Name: Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara a analizzare struttura e funzione mitocondriale in tessuti vivi e fissati di Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di studiare i meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Leena Patel e Diamond Woodard per l'aiuto nella preparazione del terreno di coltura della Drosophila e il Dr. Igor Chesnokov per aver fornito l'accesso allo stereomicroscopio collegato alla telecamera.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2C+fusion%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li>
<li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li>
<li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+division%3A+molecular+machinery+and+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li>
<li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li>
<li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
<li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li>
<li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation%3A+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E%2C+regulated+by+Drp1%2C+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+%26%2334%3Bfalse+clones%26%2334%3B+with+apparent+polarity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &#34;false clones&#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Photobleaching: Prevenire indebite photobleaching dei campioni fluorescenti è assolutamente necessario per l&#39;esecuzione efficiente microscopia confocale. Pertanto, il tempo utilizzato per individuare i campioni attraverso l&#39;oculare o per impostare i parametri di acquisizione di immagini attraverso la modalità di scansione dal vivo deve essere ridotto al minimo per ridurre al minimo photobleaching. <p class="jove_c...

I mitocondri sono classicamente descritti come la centrale elettrica cellulare, dal momento che sono le principali sedi di produzione di energia nelle cellule differenziate. Inoltre, i mitocondri hanno un ruolo fondamentale nel metabolismo, la generazione di calore, la modifica dei lipidi, calcio e redox omeostasi, l&#39;orchestrazione dei processi di segnalazione cellulare, ecc 1. I mitocondri anche svolgere un ruolo attivo nella induzione della morte cellulare 2, nonché nella regolazione del ciclo cellulare 3. Tale multifunzionalità pone le seguenti domande fondamentali: a) come fanno i mitocondri svolgono tutte queste funzioni contemporaneamente e b) ci sono piscine mitocondriali specifici o sottozone che sono specializzati per funzioni distinte? In questo contesto, è importante notare che i mitocondri multifunzionali sono dinamici nella forma, dimensioni, e la struttura all&#39;interno delle singole cellule e che la forma a regime di mitocondri possono variare tra i tipi di cellule. Decenni di ricerca provenienti da varie laboratoriooratori suggeriscono che l&#39;alterazione della forma mitocondriale, le dimensioni e la struttura, chiamati collettivamente dinamiche mitocondriali, è fondamentale per mantenere le varie funzioni mitocondriali 4,5,6. Questi risultati sollevano la possibilità che i mitocondri possano compiere la loro multifunzionalità in virtù della loro dinamismo strutturale. Ampi sforzi sono in corso per capire il rapporto struttura-funzione mitocondriale. La dinamicità della struttura mitocondriale viene mantenuta principalmente dalla loro capacità di subire eventi di fissione e fusione con l&#39;altro. Fissione di grandi mitocondri li converte in elementi mitocondriali più piccoli, mentre la fusione tra due mitocondri piccoli li fonde in un elemento mitocondriale grande 7. Inoltre, può verificarsi la fusione transitorio di due mitocondri per consentire la miscelazione del loro contenuto. La fissione e fusione eventi delle membrane mitocondriali interne ed esterne sono attentamente regolate da specificheific imposta di proteine. Il macchinario nucleo fissione è composto dynamin-related protein 1 (DRP1), che viene assunto dal citosol ai mitocondri dalla sua interazione con certa bona proteine mitocondriali fide (ad esempio, Fis1 o Mff1), mentre la funzione DRP1 può anche essere regolata altre proteine sulla superficie mitocondriale 4. Anche se DRP1 opera sulla membrana esterna, la sua capacità di fissione impatto la membrana interna pure. L&#39;orchestrazione della fissione delle membrane mitocondriali esterne ed interne non è ben compreso. D&#39;altra parte, la fusione della membrana interna è regolata al centro dalle attività di OPA1, mentre mitofusins regolano la fusione della membrana esterna 5. Il saldo dei fissione e fusione di contrasto eventi di mitocondri dettare la forma mitocondriale stato stazionario in una cella. Ad esempio, la repressione di fissione mitocondriale comporterebbe fusione completa e senza opposizione, mentre l&#39;eccessiva attività dei mitocondril fissione comporterebbe la frammentazione dei mitocondri 3. Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale coinvolge principalmente due approcci complementari: a) analisi dei fenotipi cellulari e organismal dopo la manipolazione genetica delle proteine ​​fissione / fusione mitocondriali e b) le valutazioni diretti di struttura e funzione mitocondriale. È interessante notare che le analisi genetiche non sempre rivelare la funzionalità diretta della molecola in questione (in questo caso, mitocondriale proteine ​​fissione / fusione), come i fenotipi possono sorgere a causa di effetti secondari. Pertanto, è di fondamentale importanza per sviluppare e utilizzare strumenti per studiare la struttura e la funzione mitocondriale direttamente. Qualsiasi valutazione della struttura dei mitocondri coinvolge vari strumenti di microscopia. L&#39;uso della microscopia a fluorescenza delle cellule vive è notevolmente avanzato gli studi di dinamiche mitocondriali, dal momento che il dinamismo mitocondriale può essere controllato sia qualitativamente che Quantitätvamente utilizzando gli strumenti e le tecniche di microscopia a fluorescenza 8 appropriate. Strumenti microscopia a base di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in tessuti Drosophila melanogaster vivi e fisse, chiarire il significato di dinamismo mitocondriale in vivo 9. Questi e metodi relativi sono descritti qui, con l&#39;obiettivo di studiare la struttura e la funzione mitocondriale nelle ovaie Drosophila. L&#39;ovaio Drosophila è composto da germinali e somatiche lignaggi, che derivano dalle rispettive cellule staminali adulte che si trovano nel germarium 10,11. Sedici cellule germinali sinciziale (GCS) vengono incapsulati dalle cellule follicolari somatiche (FC) per formare singole camere d&#39;uovo che emergono dalla germarium (Figura 1). Uno dei 16 CV ottenere impegna a diventare un ovocita, e il restante 15 CV svilupparsi in cellule infermiere che supportano la crescita della camera di ovociti, Facilitando la maturazione dell&#39;uovo prima che venga deposto. La maggior parte degli FC subiscono 9 turni di divisioni mitotiche, prima di uscire dal ciclo cellulare mitotico a differenziarsi terminale in uno strato di cellule epiteliali modellato costituito da cellule anteriore follicolo (AFCS), cellule posteriore follicolo (PFC), e principali cellule del corpo (MBC) . Le camere di uova consecutivi sono collegati da cellule gambo, che si differenziano le cellule che sono anche derivati ​​da FC nelle prime fasi di sviluppo. Forma mitocondriale regolato dalla proteina DRP1 fissione mitocondriale è attivamente coinvolto nel processo di differenziazione durante il normale sviluppo del ovarico strato di FC Drosophila 9,12. I metodi utilizzati in questi studi per identificare il coinvolgimento di DRP1 in Drosophila sviluppo strato di cellule del follicolo sono descritte qui.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (mezzo di dissezione per insetti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldeide AQ</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Verde (colorazione mitocondriale complessiva)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Recostituire e aliquotare</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina estere etilico perclorato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Ricostituire e Aliquotare</td></tr><tr><td>MitoSox (colorazione Mito-Ros)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Ricostituire e Aliquotare</td></tr><tr><td>PoliLisina</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fiale per mosche</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ciclina E (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB anticorpo [3D5] - Marker mitocondriale</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniIgG anti-topo di capra pura (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniIgG anti-coniglio di capra pura (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Seleziona vetrini</td> <td>per microscopioFisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio per microscopio in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp Piatto Mircrowell con fondo in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lievito secco attivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Portaspilli nichelato</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Pad Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Ago per cerbottana</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscopio</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Fotocamera digitale raffreddata, 12 bit, Mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studiare mitocondriale struttura e funzione in drosophila ovaie

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

L'analisi della relazione struttura-funzione mitocondriale è necessaria per una comprensione approfondita dei meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale. La microscopia a fluorescenza è uno strumento indispensabile per la valutazione diretta della struttura e della funzione mitocondriale nelle cellule vive e per lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale, che è principalmente modulata dalle molecole che regolano gli eventi di fissione e fusione tra i mitocondri. Questo articolo descrive e dimostra metodi specifici per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale in tessuti vivi e fissi nell'organismo modello Drosophila melanogaster. Il tessuto di scelta qui è l'ovaio di Drosophila, che può essere isolato e reso suscettibile per la microscopia confocale dal vivo ex vivo. Inoltre, l'articolo descrive come manipolare geneticamente la proteina di fissione mitocondriale, Drp1, nelle ovaie di Drosophila per studiare il coinvolgimento della fissione mitocondriale guidata da Drp1 nella modulazione della relazione struttura-funzione mitocondriale. L'ampio uso di tali metodi è dimostrato sia in dati già pubblicati che in dati inediti. I metodi descritti possono essere ulteriormente estesi verso la comprensione dell'impatto diretto dei nutrienti e/o dei fattori di crescita sulle proprietà mitocondriali ex vivo. Dato che la disregolazione mitocondriale è alla base dell'eziologia di varie malattie, si prevede che i metodi innovativi descritti sviluppati in un organismo modello geneticamente trattabile, Drosophila, contribuiranno in modo significativo alla comprensione dei dettagli meccanicistici della relazione struttura-funzione mitocondriale e allo sviluppo di strategie terapeutiche dirette dai mitocondri.

I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in ovaie Drosophila vivi e fissi (Figura 2B). A condizione sono alcuni esempi di risultati attesi ottenuti con i metodi descritti. La dissezione delle ovaie Drosophila: Quando sezionato ulteriormente, gli addomi mozzate (Figura 3B) da tutta la Drosophila ...

L'analisi della relazione struttura-funzione mitocondriale è necessaria per una comprensione approfondita dei meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale. In questo articolo sono descritti e dimostrati metodi specifici per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie di Drosophila vive e fisse.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare metodi per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale in tessuti vivi e fissi nell'organismo modello drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia mitocondriale. Come i meccanismi di regolazione della funzione mitocondriale.Il vantaggio principale di questa tecnica è che esegue un'analisi dettagliata della relazione struttura/funzione mitocondriale. Dopo aver selezionato cinque mosche femmine anestetizzate secondo il protocollo di testo, al microscopio da dissezione, utilizzare due paia di pinze per recidere il torace dall'addome. Quindi, trasferire con cura gli addomi nel secondo pozzetto del piatto.Usando un paio di pinze per tenere l'addome all'estremità posteriore, usa l'altro paio di pinze per spingere lentamente le ovaie verso l'esterno. Quindi usa la pinza per tenere una singola ovaia per l'estremità posteriore opaca e spostala con cautela sul terzo pozzetto del piatto per stuzzicarla o fissarla. Stuzzicare con cura la guaina protettiva intorno alle ovaie, usando un paio di pinze per tenere l'estremità posteriore e spazzando leggermente un ago stuzzicante dalla parte posteriore a quella anteriore.Per preparare le camere rivestite di polilesso, posizionare due gocce separate da 20 microlitri di polilisene sul vetro di copertura di una capsula di Petri con fondo di vetro. Asciugare le piastre all'aria a 37 gradi Celsius per un'ora e delineare la polilisina sul lato inferiore della piastra. Impostare i parametri di scansione sul microscopio confocale aprendo il software di acquisizione delle immagini e, nella scheda di acquisizione, impostare i parametri di scansione appropriati.Seleziona le caselle serie temporali, sbiancamento e regioni per aprire le singole schede. Quindi, immettere i valori dei parametri di acquisizione appropriati in ciascuna scheda. Quindi, posiziona un'ovaia sezionata e stuzzicata su una regione rivestita di polilisina contrassegnata e usa un ago per stuzzicare per allargare l'ovaia e separare le ovaie.Metti una goccia da 10 microlitri di terreno di coltura per insetti sopra l'ovaio, assicurandoti di coprire l'intera area rivestita di polilisina. Quindi, coprire la capsula di Petri. Subito dopo il montaggio dell'ovaio, posizionare il campione sul tavolino del microscopio e utilizzare l'oculare per individuare rapidamente il campo di interesse nel tessuto vivo.Fare clic su Live per acquisire un'immagine Live del campo di interesse selezionato, quindi fare clic su Interrompi per interrompere la scansione in tempo reale. Se necessario, regolare i parametri di acquisizione in modo che il segnale fluorescente rilevato sia al di sotto dei livelli di saturazione con lo sfondo definito come impostato regolando i valori di offset. Dalla scheda grafica, utilizzare lo strumento di disegno di Bezier per disegnare una piccola ROI per delimitare la zona di sbiancamento della foto sull'immagine acquisita mediante scansione.Eseguire quindi l'acquisizione dell'immagine, cliccando su avvia esperimento. Per eseguire la colorazione dal vivo con coloranti mitocondriali fluorescenti, diluire lo stock di coloranti in mezzo di dissezione caldo fino alle concentrazioni finali di lavoro. Dopo che la dissezione e la presa in giro sono state dimostrate in precedenza, posizionare le ovaie in 200 microlitri di soluzione colorante in un pozzetto di una capsula di dissezione.Coprire il piatto con una scatola avvolta in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e incubare il fazzoletto per 10 minuti. Quindi, lavare le ovaie colorate usando una pinza per spostarle con cura in tre pozzetti consecutivi contenenti terreno senza macchie. Per la co-colorazione con TMRE, nella colorazione mitrocondriale generale compatibile, eseguire prima la colorazione con TMRE, quindi senza lavare il tessuto, trasferire immediatamente il campione nella colorazione mitocondriale complessiva.Dopo aver lavato e montato le ovaie, come dimostrato in precedenza in questo video, per eseguire l'imaging confocale sul campione, selezionare la casella di sezione Z per aprire la linguetta. Ruotare la rotella di messa a fuoco verso la parte inferiore del campione durante la scansione in tempo reale e fare clic su Set-First per definire la sezione Z più in basso. Quindi spostare la rotella di messa a fuoco nella direzione opposta per definire la sezione più in alto.Esegui l'acquisizione dell'immagine facendo clic su avvia esperimento. Nel caso di xvivamicroscopia dal vivo, i dati devono essere ottenuti entro 15 minuti dall'inserimento del tessuto, altrimenti i risultati sperimentali possono essere influenzati da alterazioni della fisiologia dovute alla conseguente morte del tessuto. Immediatamente dopo la dissezione, sotto una cappa aspirante, immergere le ovaie in 200 microlitri di PFA fresco a temperatura ambiente nel pozzetto di una piastra di vetro.Incubare il fazzoletto per 15 minuti per fissarlo. Dopo aver lavato le ovaie in PBS secondo il protocollo di testo, mentre si è ancora in PBS, stuzzicare le ovaie per rimuovere con cura la guaina protettiva della fibra che può ostacolare l'accesso dell'antigene dall'anticorpo. Permeabilizzare le ovaie stuzzicate mettendole in un tubo microfusibile con 500 microlitri di tritan allo 0,5% x 100 in PBS.Quindi, posizionare il tubo in una scatola coperta e impostare su dondolo a 25 giri/min per 30 minuti. Rimuovere il PBS/TX secondo il protocollo di testo, bloccare il tessuto aggiungendo 200 microlitri di BSA disciolto nello 0,5% di PBS/TX. Incubare i campioni sul bilanciere a temperatura ambiente per un'ora.Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere anti-rabbia desiclina E e anticorpi anti-topo ATPB. Incubare il fazzoletto sul bilanciere a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, utilizzare PBS-TX per lavare le ovaie tre volte per 15 minuti ciascuna.Quindi, aggiungere 200 microlitri di anticorpi secondari appropriati e PBS-TX fresco e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver lavato il fazzoletto due volte, aggiungere i ganci al terzo lavaggio. Quindi, con una micropipetta da un millilitro, rimuovere le ovaie immunocolorate dal tubo della microfusibile in un pozzetto fresco di una capsula di dissezione in vetro contenente 200 microlitri di PBS.Aggiungere una goccia di terreno di montaggio a base di glicerolo a un vetrino e aggiungere le ovaie immunocolorate una alla volta al mezzo di montaggio. Sotto un microscopio da dissezione, tenendo la parte opaca dell'ovaio con una pinza, utilizzare un ago per stuzzicare delicatamente le ovaie trasparenti dalle camere opache degli ovuli maturi. Quindi, rimuovere le camere delle uova mature dal mezzo di montaggio.Posizionare un vetro di copertura sulla diapositiva e premere leggermente per assicurarsi che il mezzo di montaggio si diffonda uniformemente. Asciugare i campioni all'aria per 15 minuti prima di utilizzare lo smalto per sigillare i bordi. Infine, eseguire la microscopia confocale secondo necessità.Come mostrato qui, il flip mirato a una delle nuvole mitocondriali associate alle cellule nerse porta a una perdita superiore al 50% del segnale fluorescente dalle ROI blu e bianche che circondano la ROI del flip rosso entro 200 secondi, mentre la ROI di controllo gialla è minimamente sbiancata. Le ovaie di drosophilla hanno mostrato una diminuzione del segnale con la profondità del tessuto ed è importante discernere la profondità massima del tessuto all'interno della quale i florofori come TMRE e mitostain, possono essere rilevati durante l'imaging dal vivo. Un'analisi qualitativa della co-colorazione con TMRE e della colorazione mitocondriale complessiva, mostra che il germarium di drisophilla mostra un potenziale mitocondriale più elevato per unità di massa nello stadio 2B.In questa figura, l'analisi semi-qualitativa dimostra la differenza nel potenziale mitocondriale per unità di massa tra AFC e MBC analizzata da una camera uovo di stadio 9. Queste immagini rivelano che l'assorbimento di mitox avviene nelle cellule del follicolo mitotico e post-mitotico di drisophilla. In questo esperimento, la colorazione co-immuno identifica un elevato segnale di deciclina che si sovrappone al segnale mitocondriale ATPB e ai cloni nolici DRP1 negativi alla GFP nel Germarium e in una camera uovo allo stadio 9.I metodi descritti possono essere modificati e impiegati per studiare la funzione della struttura mitocondriale in altri tessuti drisophilla. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare, colorare e visualizzare le ovaie fisse e vive di drisophilla per studiare la struttura e la funzione mitocondiale.

studying-mitochondrial-structure-and-function-in-drosophila-ovaries

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione...

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Questo video descrive l'anatomia generale dell'ovaio di Drosophila e presenta un metodo di dissezione delle ovaie per l'imaging dal vivo o fisso.

Drosophila melanogaster Dissezione ovarica: una tecnica per la preparazione dei tessuti ex vivo

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo e dell'omeostasi. Sottili cambiamenti nel metabolismo mitocondriale che influenzano la fisiologia dell'organismo potrebbero essere difficili da rilevare negli studi di metabolomica dell'intero organismo. Qui descriviamo un metodo di isolamento che migliora il rilevamento di sottili cambiamenti metabolici in Drosophila melanogaster.

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; Drosophila</em

L'oogenesi della Drosophila continua ad essere eccezionalmente utile nello studio della proliferazione e dell'ereditarietà mitocondriale. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato utilizzato per marcare il DNA mitocondriale replicante (mtDNA) nelle ovaie adulte di Drosophila con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), che facilita la scoperta di meccanismi associati all'eredità mitocondriale che erano precedentemente discutibili.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

In questo protocollo, dimostriamo l'applicazione della tomografia elettronica di serie-sezione per delucidare la struttura mitocondriale nel muscolo di Drosophila voli indiretti.

3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Impara a analizzare struttura e funzione mitocondriale in tessuti vivi e fissati di Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di studiare i meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale in vivo.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

Esplora altri video