Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare metodi per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale in tessuti vivi e fissi nell'organismo modello drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia mitocondriale. Come i meccanismi di regolazione della funzione mitocondriale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che esegue un'analisi dettagliata della relazione struttura/funzione mitocondriale. Dopo aver selezionato cinque mosche femmine anestetizzate secondo il protocollo di testo, al microscopio da dissezione, utilizzare due paia di pinze per recidere il torace dall'addome. Quindi, trasferire con cura gli addomi nel secondo pozzetto del piatto.

Usando un paio di pinze per tenere l'addome all'estremità posteriore, usa l'altro paio di pinze per spingere lentamente le ovaie verso l'esterno. Quindi usa la pinza per tenere una singola ovaia per l'estremità posteriore opaca e spostala con cautela sul terzo pozzetto del piatto per stuzzicarla o fissarla. Stuzzicare con cura la guaina protettiva intorno alle ovaie, usando un paio di pinze per tenere l'estremità posteriore e spazzando leggermente un ago stuzzicante dalla parte posteriore a quella anteriore.

Per preparare le camere rivestite di polilesso, posizionare due gocce separate da 20 microlitri di polilisene sul vetro di copertura di una capsula di Petri con fondo di vetro. Asciugare le piastre all'aria a 37 gradi Celsius per un'ora e delineare la polilisina sul lato inferiore della piastra. Impostare i parametri di scansione sul microscopio confocale aprendo il software di acquisizione delle immagini e, nella scheda di acquisizione, impostare i parametri di scansione appropriati.

Seleziona le caselle serie temporali, sbiancamento e regioni per aprire le singole schede. Quindi, immettere i valori dei parametri di acquisizione appropriati in ciascuna scheda. Quindi, posiziona un'ovaia sezionata e stuzzicata su una regione rivestita di polilisina contrassegnata e usa un ago per stuzzicare per allargare l'ovaia e separare le ovaie.

Metti una goccia da 10 microlitri di terreno di coltura per insetti sopra l'ovaio, assicurandoti di coprire l'intera area rivestita di polilisina. Quindi, coprire la capsula di Petri. Subito dopo il montaggio dell'ovaio, posizionare il campione sul tavolino del microscopio e utilizzare l'oculare per individuare rapidamente il campo di interesse nel tessuto vivo.

Fare clic su Live per acquisire un'immagine Live del campo di interesse selezionato, quindi fare clic su Interrompi per interrompere la scansione in tempo reale. Se necessario, regolare i parametri di acquisizione in modo che il segnale fluorescente rilevato sia al di sotto dei livelli di saturazione con lo sfondo definito come impostato regolando i valori di offset. Dalla scheda grafica, utilizzare lo strumento di disegno di Bezier per disegnare una piccola ROI per delimitare la zona di sbiancamento della foto sull'immagine acquisita mediante scansione.

Eseguire quindi l'acquisizione dell'immagine, cliccando su avvia esperimento. Per eseguire la colorazione dal vivo con coloranti mitocondriali fluorescenti, diluire lo stock di coloranti in mezzo di dissezione caldo fino alle concentrazioni finali di lavoro. Dopo che la dissezione e la presa in giro sono state dimostrate in precedenza, posizionare le ovaie in 200 microlitri di soluzione colorante in un pozzetto di una capsula di dissezione.

Coprire il piatto con una scatola avvolta in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e incubare il fazzoletto per 10 minuti. Quindi, lavare le ovaie colorate usando una pinza per spostarle con cura in tre pozzetti consecutivi contenenti terreno senza macchie. Per la co-colorazione con TMRE, nella colorazione mitrocondriale generale compatibile, eseguire prima la colorazione con TMRE, quindi senza lavare il tessuto, trasferire immediatamente il campione nella colorazione mitocondriale complessiva.

Dopo aver lavato e montato le ovaie, come dimostrato in precedenza in questo video, per eseguire l'imaging confocale sul campione, selezionare la casella di sezione Z per aprire la linguetta. Ruotare la rotella di messa a fuoco verso la parte inferiore del campione durante la scansione in tempo reale e fare clic su Set-First per definire la sezione Z più in basso. Quindi spostare la rotella di messa a fuoco nella direzione opposta per definire la sezione più in alto.

Esegui l'acquisizione dell'immagine facendo clic su avvia esperimento. Nel caso di xvivamicroscopia dal vivo, i dati devono essere ottenuti entro 15 minuti dall'inserimento del tessuto, altrimenti i risultati sperimentali possono essere influenzati da alterazioni della fisiologia dovute alla conseguente morte del tessuto. Immediatamente dopo la dissezione, sotto una cappa aspirante, immergere le ovaie in 200 microlitri di PFA fresco a temperatura ambiente nel pozzetto di una piastra di vetro.

Incubare il fazzoletto per 15 minuti per fissarlo. Dopo aver lavato le ovaie in PBS secondo il protocollo di testo, mentre si è ancora in PBS, stuzzicare le ovaie per rimuovere con cura la guaina protettiva della fibra che può ostacolare l'accesso dell'antigene dall'anticorpo. Permeabilizzare le ovaie stuzzicate mettendole in un tubo microfusibile con 500 microlitri di tritan allo 0,5% x 100 in PBS.

Quindi, posizionare il tubo in una scatola coperta e impostare su dondolo a 25 giri/min per 30 minuti. Rimuovere il PBS/TX secondo il protocollo di testo, bloccare il tessuto aggiungendo 200 microlitri di BSA disciolto nello 0,5% di PBS/TX. Incubare i campioni sul bilanciere a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere anti-rabbia desiclina E e anticorpi anti-topo ATPB. Incubare il fazzoletto sul bilanciere a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, utilizzare PBS-TX per lavare le ovaie tre volte per 15 minuti ciascuna.

Quindi, aggiungere 200 microlitri di anticorpi secondari appropriati e PBS-TX fresco e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver lavato il fazzoletto due volte, aggiungere i ganci al terzo lavaggio. Quindi, con una micropipetta da un millilitro, rimuovere le ovaie immunocolorate dal tubo della microfusibile in un pozzetto fresco di una capsula di dissezione in vetro contenente 200 microlitri di PBS.

Aggiungere una goccia di terreno di montaggio a base di glicerolo a un vetrino e aggiungere le ovaie immunocolorate una alla volta al mezzo di montaggio. Sotto un microscopio da dissezione, tenendo la parte opaca dell'ovaio con una pinza, utilizzare un ago per stuzzicare delicatamente le ovaie trasparenti dalle camere opache degli ovuli maturi. Quindi, rimuovere le camere delle uova mature dal mezzo di montaggio.

Posizionare un vetro di copertura sulla diapositiva e premere leggermente per assicurarsi che il mezzo di montaggio si diffonda uniformemente. Asciugare i campioni all'aria per 15 minuti prima di utilizzare lo smalto per sigillare i bordi. Infine, eseguire la microscopia confocale secondo necessità.

Come mostrato qui, il flip mirato a una delle nuvole mitocondriali associate alle cellule nerse porta a una perdita superiore al 50% del segnale fluorescente dalle ROI blu e bianche che circondano la ROI del flip rosso entro 200 secondi, mentre la ROI di controllo gialla è minimamente sbiancata. Le ovaie di drosophilla hanno mostrato una diminuzione del segnale con la profondità del tessuto ed è importante discernere la profondità massima del tessuto all'interno della quale i florofori come TMRE e mitostain, possono essere rilevati durante l'imaging dal vivo. Un'analisi qualitativa della co-colorazione con TMRE e della colorazione mitocondriale complessiva, mostra che il germarium di drisophilla mostra un potenziale mitocondriale più elevato per unità di massa nello stadio 2B.

In questa figura, l'analisi semi-qualitativa dimostra la differenza nel potenziale mitocondriale per unità di massa tra AFC e MBC analizzata da una camera uovo di stadio 9. Queste immagini rivelano che l'assorbimento di mitox avviene nelle cellule del follicolo mitotico e post-mitotico di drisophilla. In questo esperimento, la colorazione co-immuno identifica un elevato segnale di deciclina che si sovrappone al segnale mitocondriale ATPB e ai cloni nolici DRP1 negativi alla GFP nel Germarium e in una camera uovo allo stadio 9.

I metodi descritti possono essere modificati e impiegati per studiare la funzione della struttura mitocondriale in altri tessuti drisophilla. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare, colorare e visualizzare le ovaie fisse e vive di drisophilla per studiare la struttura e la funzione mitocondiale.