Protocollo sperimentale per il rilevamento cianobatteri In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la presenza di più ceppi cianobatterici in campioni liquidi e solidi utilizzando un test immunologico con microarray a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei settori dell'ambiente, del monitoraggio e della gestione delle acque, come la presenza di tossine che producono batteri produttori di protossine prima che le fioriture diventino visibili ad occhio nudo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile monitorare contemporaneamente più ceppi cianobatterici e più campioni in un periodo di tre, quattro ore, sia in situ che in laboratorio.

Quindi, questi metodi possono fornire informazioni sulla biodiversità. Può essere applicato anche ad altri campi, come il monitoraggio di impianti agricoli, il rilevamento della vita in ambienti di deformazione o l'esplorazione planetaria. In generale, le persone nuove a questo metodo non avranno difficoltà.

Grazie alla semplicità nell'elaborazione del campione e alla più facile interpretazione dei risultati. Dopo aver prodotto e purificato gli anticorpi secondo il protocollo di testo, aggiungere 100 microlitri di DMSO in una fiala commerciale contenente colorante per la marcatura, un milligrammo di proteine. Una volta sciolto il colorante, etichettare gli anticorpi purificati aggiungendo due microlitri di colorante a 50 microlitri di ciascun preparato di anticorpi.

Mantenere le reazioni di marcatura a temperatura ambiente in agitazione continua su una piattaforma vibrante per un'ora. Dopo aver purificato gli anticorpi marcati secondo il protocollo di testo, caricare una piccola aliquota in uno spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 280 e 650 nanometri. Calcola l'efficienza dell'etichettatura seguendo le raccomandazioni del fornitore.

Per realizzare un CYANOCHIP, preparare 30 microlitri di ciascun anticorpo purificato mescolando un milligrammo per millilitro di anticorpo in un tampone di stampa proteica 1X con 01% di volume per volume di Tween 20. Preparare 30 microlitri delle seguenti soluzioni di stampa come controlli. 1X tampone di stampa proteica con 01% di volume per volume di Tween 20.

Ogni proteina A ha purificato il siero preimmune a un milligrammo per millilitro in tampone di stampa proteica 1X con 01%Tween 20 e un millgrammo per millilitro di BSA e tampone di stampa proteica 1X con 01%Tween 20. Aggiungere 30 microlitri per pozzetto delle soluzioni di stampa preparate alle micropiastre da 384 pozzetti di alta qualità. Dopo aver impostato il robot di stampa e i substrati delle diapositive secondo il protocollo di testo, individuare tutti gli anticorpi e i controlli sulle diapositive in uno schema spot triplicato di circa 180-200 micron di diametro.

Per il campionamento nell'ambiente, utilizzare una siringa sterile per raccogliere da uno a 100 millilitri di liquidi e concentrare le cellule facendo passare il campione attraverso un filtro con pori di tre micron. Se necessario, raccogliere campioni solidi da rocce o terreni e conservarli in provette sterili. I campioni possono essere analizzati in un piccolo laboratorio sul campo.

Aggiungere un millilitro di tampone di incubazione per l'estrazione per recuperare la biomassa raccolta nel filtro e utilizzare uno spatolare per raschiare il filtro in un tubo da 15 millilitri. Con un processore a ultrasuoni portatile o pipettando su e giù più volte, questo aggrega e omogeneizza il campione. Inoltre, pesare fino a 0,5 grammi di campione solido in una provetta separata da 10 millilitri e aggiungere fino a due millilitri di tampone di estrazione.

Immergere una sonda sonicatrice nel tubo e sonicare con un processore a ultrasuoni portatile o un altro dispositivo a ultrasuoni. Mantenendo il campione sul ghiaccio, eseguire almeno cinque cicli di 30 secondi a 30 kilohertz, fermandosi per 30 secondi tra una sonicazione e l'altra. Per preparare un estratto filtrato per l'immunodosaggio, utilizzare una siringa da 10 millilitri accoppiata a un portafiltro in nylon con pori da cinque a 20 micron per filtrare la soluzione in un tubo da 1,5 millilitri per rimuovere sabbia, argilla e altro materiale grossolano.

Con i punti del microarray rivolti verso il basso, appoggiare il vetrino su una goccia da 100 a 200 microlitri di soluzione bloccante e incubare per tre-cinque minuti. Utilizzando una pinza con punta in plastica ed evitando le zone del microarray, prelevare con cautela il vetrino. Immergere il vetrino in una soluzione di blocco fresca e incubare il vetrino con una leggera agitazione per 30 minuti.

Per asciugare il vetrino, metterlo in una centrifuga adatta ai vetrini da microscopio e girarlo brevemente. Impostare il vetrino in una cassetta di ibridazione microarray a tre pozzetti per otto seguendo le istruzioni del fornitore. In alternativa, dopo aver modificato il modello di stampa dell'anticorpo, è possibile impostare una cassetta personalizzata, come quella mostrata qui, o semplicemente utilizzare i vetrini di copertura per la configurazione.

Dopo l'assemblaggio del vetrino e della cassetta, pipettare fino a 50 microlitri di ciascun estratto del campione o diluirlo nel tampone di incubazione dell'estrazione in ciascun pozzetto della cassetta. In alternativa, è possibile caricare i campioni in altri dispositivi di incubazione o semplicemente utilizzare i vetrini di copertura. Come controllo in bianco, pipettare 50 microlitri di tampone TBSTRR in almeno due pozzetti separati della cassetta.

Incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora e miscelarli pipettandoli ogni 15 minuti, oppure incubare a quattro gradi Celsius per 12 ore. Per lavare i microarray, posizionare la cassetta e picchiettarla con cura su carta assorbente pulita. Quindi lavare i pozzetti aggiungendo a ciascuno 150 microlitri di tampone di incubazione per estrazione e rimuovere il tampone picchiettando su carta assorbente come prima.

Ripetere il lavaggio altre tre volte. A ciascun pozzetto, aggiungere 50 microlitri della miscela di anticorpi fluorescenti che contiene i 17 anticorpi anti-ceppo cianobatterico. Incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora o a quattro gradi Celsius per 12 ore.

Per lavare i microarray, posizionare con cura la cassetta e picchiettarla delicatamente su carta assorbente pulita. Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone di incubazione per l'estrazione prima di rimuoverlo picchiettando su un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.

Quindi smontare la cassetta e immergere il vetrino in una soluzione PBS 0,1X per un rapido risciacquo. Centrifugare rapidamente come prima per asciugare il vetrino. Utilizzando uno scanner fluorescente, scansionare il vetrino per la fluorescenza al picco di massima emissione per il colorante fluorescente rosso lontano.

Scatta diverse immagini dei microarray con diversi parametri di scansione modificando il valore di guadagno. Infine, carica la griglia, quantifica, quindi elabora e analizza i dati secondo il protocollo di testo. Il test immunologico multiplex CYANOCHIP dimostrato in questo video è stato utilizzato per testare l'identificazione simultanea delle specie cianobatteriche d'acqua dolce più rilevanti, come elencato in questa tabella.

I campioni d'acqua raccolti sulla riva di un bacino idrico di acqua dolce sono stati analizzati utilizzando il saggio dei microarray. Le principali reazioni immunitarie positive corrispondevano agli anticorpi contro le specie di cianobatteri planctonici microcystis e contro le specie bentoniche leptolyngbya. Segnali fluorescenti più bassi sono stati ottenuti per le specie planctonice nostocales aphanizomenon, anabaena species, microcystis flos-aquae e le specie rivularia bentonica.

Il microarray è stato anche convalidato analizzando un tappetino microbico secco antartico per verificare la presenza di marcatori cianobatterici. Reazioni positive negli anticorpi sono state prodotte contro i cianobatteri bentonici, le specie anabaena e le specie leptolyngbya. Ulteriori reazioni immunitarie positive sono state rilevate con anticorpi contro i cianobatteri planctonici, come le specie microcystis, le specie aphanizomenon e le specie planktothrix rubescens.

Infine, questi segnali sono stati ottenuti da anticorpi contro altre specie bentoniche, tra cui le specie tolypothrix e le specie anabaena. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre, quattro ore, se eseguita correttamente, escludendo la produzione di anticorpi e il livellamento. Con l'incubazione simultanea del campione e degli anticorpi fluorescenti, si può risparmiare un'ora.

Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordare di preparare la miscela di anticorpi fluorescenti con il suo anticorpo alla sua diluizione di lavoro ottimale. A seguito di queste procedure, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia ottica o l'estrazione del DNA e un'amplificazione PCR specifica, per rispondere a ulteriori domande, come la concentrazione nel suolo o per confermare il tipo di ceppo rilevato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo del monitoraggio ambientale per esplorare i corpi idrici, in processi di bicoltura, gestione dell'acqua dolce o studi di ecologia microbica, indipendentemente dal tipo di campione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare gli anticorpi con fluorescenza, manipolare i microarray di anticorpi, eseguire il test immunologico multiplex e analizzare e interpretare i risultati del test immunologico del microarray. Non dimenticare che lavorare con gli ultrasuoni può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario adottare sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione dell'udito o altre misure di cura specifiche.