Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Ciao a tutti, sono Kai Wang del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Pechino presso il laboratorio del Dr.Lowe. Attualmente, gli individui con diabete di tipo uno vengono trattati principalmente con iniezioni di insulina che non simulano perfettamente la secrezione di insulina dalle isole. La sostituzione delle isole perse con il trasporto delle isole può mostrare un controllo stabile della glicemia senza forti fluttuazioni.

Tuttavia, l'esigenza di produrre un gran numero di isole di alta qualità e la scarsa efficienza dell'attecchimento hanno compromesso l'uso clinico diffuso. Oggi vi mostrerò il processo di isolamento delle isole e il trapianto di isole supportate da scaffold nel cuscinetto adiposo dell'epididimo dei topi diabetici. Questi passaggi richiedono una buona conoscenza delle strutture tissutali e le mani esperte per eseguire l'intervento chirurgico.

Spruzzare tutto il corpo con etanolo. Fai un'incisione a V partendo dalla zona genitale. Rimuovere l'intestino attraverso il lato destro del mouse.

Clamp la vena porta e il dotto biliare con pinza emostatica. Afferrare con cura il duodeno con una pinza e tirare il duodeno fino a quando il dotto biliare non viene estratto. Inserire l'ago endovenoso nel dotto biliare comune attraverso l'ampolla.

Bloccare il segmento del dotto contenente l'ago utilizzando una pinza ultra emostatica. Erogare la soluzione collagenica a una velocità lenta e costante. Dopo aver gonfiato completamente il pancreas, spingere l'intestino attraverso il lato sinistro del topo.

Puoi vedere che il dotto pancreatico è completamente gonfiato. Rimuovere il pancreas all'inizio della fine del colon discendente. Usa la pinza per sollevare l'intestino e separarlo dal pancreas con un'altra pinza.

Continuare a rimuovere il pancreas fino a quando non si stacca dalla parte superiore dello stomaco. Infine, solleva il pancreas dall'addome e liberalo dalla milza rimasta. Posizionare un pancreas nel tubo conico e rilasciare con ghiaccio.

Incubare il pancreas perfuso. Terminare la digestione aggiungendo soluzioni neutralizzanti. Dissociare le due zuppe agitando energicamente i tubi.

Filtrare i campioni di tessuto digestivo attraverso la rete metallica. Raccogli le sospensioni delle isole in un nuovo tubo conico. Centrifugare le provette.

Versare il surnatante con cura senza disturbare le palette di tessuti. Risospendere le palette con Histopaque pipettando la sospensione su e giù per alcune volte. Pipettare lentamente l'HBSS lungo il lato del tubo fino alla parte superiore delle soluzioni Histopaque.

Le due soluzioni dovrebbero essere strati ben separati con un'interfaccia nitida. Centrifugare la sospensione per 20 minuti. La maggior parte degli isolotti migra verso l'interfaccia dei livelli Histopaque e HBSS.

Rimuovere tutte le soluzioni surnatanti e passare le soluzioni attraverso un colino capovolto. Le isole saranno trattenute dal colino. Immergere la superficie che trattiene le isole nella soluzione e agitare delicatamente per rilasciare le isole.

Raccogli a mano le isole isolate al microscopio. Raccogli gli isolotti in un nuovo piatto di cultura. Se il tessuto che circonda il dotto inizia a gonfiarsi, significa che l'ago passa attraverso la parete del dotto biliare.

È necessario riposizionare l'ago e provare a incannulare nuovamente il dotto biliare. Quando le soluzioni riempiono il pancreas, il tessuto vicino al duodeno si gonfia per primo, seguito dalla regione vicino alla coda pancreatica. Se il duodeno inizia a gonfiarsi come mostrato qui con la colorazione blu, regolare il morsetto arterioso e richiudere il dotto biliare.

Posizionare il mouse in posizione supina. Radere l'addome. Quindi tamponare con iodofori per sterilizzare la pelle.

Copri il topo con un telo sterile. Fai una piccola incisione attraverso la parete peritoneale al centro vicino all'area genitale. Afferra delicatamente ed estrai il cuscinetto adiposo dell'epididimo dalla cavità addominale.

Stendere il cuscinetto di grasso su una garza bagnata. Posiziona un'impalcatura contenente isole sul cuscinetto adiposo e piega il cuscinetto adiposo per avvolgere il trapianto. Sutura il cuscinetto adiposo per fissare le isole incapsulate nel cuscinetto adiposo.

Riposizionare delicatamente il cuscinetto adiposo nella cavità addominale. Chiudi il topo suturando la parete peritoneale. Clamp lo strato dermico con clip per ferite.

Iniettare dosi appropriate di antidolorifici e antibiotici per via sottocutanea. Gli isolotti isolati freschi avevano tipicamente una periferia ruvida al microscopio ottico. Una volta che le isole si sono riprese dal processo di isolamento, apparivano luminose, strette e acquisivano una superficie liscia.

Il diametro medio dell'isolotto calcolato era di circa 130 micrometri. I ponteggi decelerati sono meccanicamente abbastanza robusti da poter essere maneggiati con una pinzetta. Le isole porose supportate da impalcature sono state quindi trasferite sulla superficie del cuscinetto adiposo diffuso e quindi incapsulate dal cuscinetto adiposo.

In un modello di trapianto singenico, in genere 500 isole invertono l'ipoglicemia entro 10 giorni. La glicemia normale è stata mantenuta prima di circa 100 giorni fino al prelievo degli innesti. Gli studi istologici dimostrano che le isole erano rivascolarizzate e circondate dal tessuto adiposo e dall'impalcatura.

Dopo aver visto questo video, con la pratica, dovresti imparare i passaggi chiave coinvolti nell'isolamento e nel trasporto dell'isolotto. In primo luogo, l'incannulamento del dotto biliare comune e la dilatazione del pancreas sono la parte più difficile di questo protocollo. In secondo luogo, incapsulare completamente l'impalcatura carica di isole con un cuscinetto adiposo, poiché l'incapsulamento incompleto potrebbe portare al fallimento del trapianto.