A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Questo protocollo è stato originariamente pubblicato dal Dr. Gary Bunker e dai suoi colleghi, e consente la lunga densità e l'alta purezza della coltura dei neuroni ippocampali a carico embrionale, sospendendo i neuroni su uno strato gliale più adatto. Questo risultato è alla base dei pericoli degli altri nostri risultati cruciali dell'ippocampo, perché consente ai neuroni di crescere a basse densità con poche cellule gliali contaminanti. Questo risultato è quindi ideale per l'imaging ad alta risoluzione e per il funzionamento della tipografia e dei neuroni maturi in coltura.

La post-maturazione di questo protocollo dovrebbe accelerare l'adattamento da parte di una nuova vita perché ci sono diversi stati chiave durante la procedura che sono difficili da descrivere, quindi ti porta con sé. Questo protocollo è costituito da tre popolazioni indipendenti necessarie per la coltura di neuroni primari di alta qualità. Questi processi includono la coltura di cellule gliali, la creazione e il rivestimento di vetrini coprioggetti e la preparazione di cellule nervose ippocampali.

Per iniziare, il tessuto corticale di ratto post-natale precoce deve essere ottenuto come descritto nel protocollo scritto. Sebbene non sia mostrato direttamente qui, si noti che la fase di dissezione mostrata più avanti in questo protocollo è quasi identica a quella utilizzata per la dissezione corticale. Per questo motivo, i passaggi rilevanti saranno evidenziati durante la procedura di dissezione ippocampale mostrata più avanti in questo video.

A partire dal passaggio sei del protocollo scritto, rimuovere l'HBSS dal tessuto corticale raccolto, quindi tritare il tessuto il più finemente possibile usando le forbici. Aggiungere abbastanza HBSS al tessuto tritato per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri, quindi portare il volume totale a 12 millilitri aggiungendo HBSS. Aggiungere 1,5 millilitri ciascuno di tripsina al 2,5% e 10 milligrammi per millilitro di soluzione di DNA, capovolgere per mescolare, quindi incubare la miscela risultante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 12 minuti.

Triturare il tessuto da 10 a 15 volte utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, quindi incubarlo a bagnomaria per altri tre minuti. Assicurarsi che eventuali pezzi di tessuto si siano depositati sul fondo della provetta, quindi filtrare il surnatante in una provetta conica da 50 millilitri contenente 5 millilitri di BGS. Aggiungere 13,5 millilitri di HBSS e 1,5 millilitri di 2,5&tripsina alla provetta contenente i restanti pezzi di tessuto non digerito, capovolgere per mescolare, quindi incubarla a bagnomaria per altri 10 minuti.

Dopo l'incubazione, triturare il tessuto di ridenominazione da 10 a 15 volte, quindi filtrarlo nella provetta contenente il filtrato iniziale. Successivamente, sciacquare il filtro passando attraverso di esso altri 3 millilitri di BGS. A questo punto, il filtrato può essere diviso in più tubi per semplificare sia il bilanciamento che la ri-sospensione delle celle del pellet.

Centrifugare le sospensioni per sei minuti a 130 G.Dopo la centrifugazione, notare che il fondo del pellet appare leggermente rossastro, a causa della presenza di componenti del sangue. Rimuovere i surnatanti, quindi aggiungere 1 millilitro di terreno gliale a ciascun tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Trasferire le porzioni di ogni pellet che non hanno questo aspetto rossastro in un tubo conico fresco da 50 millilitri.

Aggiungere fino a 2 millilitri di terreno gliale per cucciolo per risospendere il tessuto combinato e trasferire ogni 2 millilitri di sospensione in 18 millilitri di terreno gliale preriscaldato in un pallone di coltura quadrato di 75 centimetri. Incubare il pallone in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% CO2. Il giorno dopo la semina delle cellule, cambiare il terreno in ogni pallone in terreno gliale fresco.

Si noti che in questo momento, la coltura sarà un mix di astrociti e altri tipi di cellule non bersaglio. Per rimuovere i tipi di cellule non astrocitarie, le fiasche devono essere agitate energicamente circa quattro giorni dopo essere state seminate. Per fare ciò, sciacquare i flaconi con HBSS, quindi aggiungere 10 millilitri di HBSS fresco a ciascun pallone e agitare energicamente da cinque a 10 volte.

Aspirare l'HBSS e risciacquare altre due volte con HBSS. Quindi aggiungere 20 millilitri di terreno gliale e rimettere i palloni nell'incubatore come prima. Si noti che mentre questo è vigoroso, gli astrociti desiderati per la coltura rimarranno fortemente aderenti alla superficie del pallone.

Per mantenere le colture di astrociti, cambiare il terreno in terreno gliale fresco due volte alla settimana fino a quando non sono confluenti. Una volta confluenti, le cellule possono essere congelate per un uso futuro come descritto nel protocollo scritto. La glia deve essere impiattata in piastre almeno 14 giorni prima dell'inizio della coltura neuronale come descritto nel protocollo scritto.

Immergere i vetrini di copertura in acido nitrico concentrato e sonicarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Fai attenzione, perché l'acido nitrico concentrato è estremamente caustico. Si noti inoltre che alcuni laboratori preferiscono immergere i vetrini coprioggetto in acido nitrico durante la notte utilizzando rack di colorazione in ceramica.

Gettare con cura l'acido nitrico nella cappa chimica come da linee guida istituzionali, quindi sciacquare i vetrini coprioggetto tre volte con acqua deionizzata. Immergere i vetrini di copertura in acqua e farli sonicare di nuovo per 30 minuti. Quindi, rimuovere l'acqua e sciacquare i vetrini coprioggetto altre tre volte.

Immergere i vetrini coprioggetti in 50 millilitri di acqua, quindi sterilizzarli in autoclave. In una cappa sterile a flusso laminare, rimuovere l'acqua e aggiungere da 20 a 30 millilitri di etanolo per risciacquare. Aggiungere altri 20-30 millilitri di etanolo, quindi trasferire i vetrini coprioggetto e l'etanolo in una piastra di Petri da 100 millimetri.

Usando una pinzetta smussata, trasferisci le strisce di colore su piastre di Petri da 60 millilitri, quattro o cinque per piatto, quindi lasciale asciugare all'aria appoggiando i vetrini di copertura contro il bordo del piatto. Una volta evaporato l'etanolo, riportare i vetrini del coperchio in posizione orizzontale. Sciogliere 10 grammi di paraffina in una bottiglia di vetro resistente al calore e mantenerla a circa 150-200 gradi Celsius.

La temperatura ideale può richiedere alcune modifiche e temperature errate possono portare a difficoltà a produrre la dimensione corretta dei piedi in paraffina. Immergi una pipetta Pasteur nella paraffina, quindi toccala rapidamente in tre punti vicino al bordo di ciascun vetrino coprioggetti. Le gocce di paraffina si solidificheranno in perle alte da 3 a 5 millimetri e di diametro da 1 a 2 millimetri e funzioneranno per fornire uno spazio tra i neuroni sul vetrino coprioggetti e lo strato mono gliale sottostante.

Procurarsi piatti contenenti vetrini coprioggetti precedentemente preparati con piedini in paraffina. Aggiungere 200 microlitri di tampone poli-l-lisina e borato sulla superficie di ciascun vetrino coprioggetti e lasciare riposare la soluzione sui vetrini coprioggetti per una notte, coperti a temperatura ambiente. La superficie da rivestire deve essere la stessa su cui si trovano le perle di paraffina.

Se adeguatamente pulita, la poli-l-lisina dovrebbe diffondersi facilmente per coprire la superficie del vetrino coprioggetto. La mattina dopo, lavare due volte i vetrini coprioggetti immergendoli in acqua sterile per due ore ogni volta. Dopo il lavaggio finale, sostituire l'acqua con 4 millilitri di terreno di placcatura per piatto.

Si noti che è importante che la superficie dei vetrini coprioggetto non si asciughi dopo essere stata rivestita con poli-l-lisina. Posizionare i coprioggetti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il vetrino coprioggetti rivestito deve essere incubato per almeno 24 ore prima dell'inizio della coltura neuronale.

Ottenere un ratto gravido embrionale del giorno 18 o 19 e sopprimere con un metodo approvato. Spruzzare la parte inferiore del ratto con etanolo al 70%, quindi praticare un'incisione sulla linea mediana dalla regione pubica fino alla fine della cavità addominale. Per evitare contaminazioni, fare attenzione a tagliare solo la pelle in questo passaggio.

Sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando etanolo al 70%, quindi tagliare la parete addominale per esporre l'utero. Togliete le due corna uterine e mettetele in un piatto sterile. In una cappa sterile a flusso laminare, rimuovere le membrane uterine che circondano i feti, quindi decapitarli e posizionare le teste in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 20 millilitri di HBSS.

Sezionare i cervelli e metterli immediatamente in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente 2 millilitri di HBSS con ghiaccio. Raccogli solo due o tre cervelli per piatto per lasciare spazio sufficiente per il passaggio successivo. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere le meningi dalla linea mediana degli emisferi cerebrali.

Quindi, seziona l'ippocampo. Si noti che l'ippocampo può essere distinto come una struttura a forma di mezzaluna nella superficie mediale dell'emisfero corticale ed è facile da rimuovere in quanto è delimitato lateralmente da un ventricolo. Una volta liberato, mettere l'ippocampo in una capsula Petri da 60 millimetri contenente 4,5 millilitri di HBSS e tenere in ghiaccio.

Si noti che i passaggi compiuti fino a questo punto valgono anche per la dissezione corticale, tranne per il fatto che le cortecce sono mantenute al contrario degli ippocampi. Per la dissezione corticale, il passo successivo sarebbe quello di separare la corteccia dal resto del cervello, come mostrato qui, e quindi raccogliere le cortecce e l'HBSS come mostrato in precedenza. Una volta che tutto il tessuto ippocampale è stato raccolto in HBSS, trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere 5 millilitri di tripsina al 2,5%, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere delicatamente la soluzione di tripsina con la pipetta Pasteur, lasciando indisturbato il tessuto ippocampale sul fondo del tubo. Lavare il fazzoletto due volte aggiungendo delicatamente 5 millilitri di HBSS, incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi rimuovendolo nuovamente con la pipetta Pasteur, assicurandosi di non disturbare il fazzoletto sul fondo.

In attesa della fase di incubazione precedentemente mostrata, preparare due varianti di pipette lucidate a fiamma per la dissociazione tissutale. Per fare ciò, esporre brevemente la punta della pipetta di vetro Pasteur a una fiamma, quindi esaminare la punta della pipetta. Per la prima variante, ripetere questo passaggio fino a quando i bordi del puntale della pipetta non sono levigati, ma il diametro rimane invariato.

Per il secondo, ripetere fino a quando i bordi non saranno levigati e il diametro della punta sarà stato ridotto di circa la metà. È importante esercitarsi per trovare il diametro ideale per garantire che il tessuto sia dissociato per produrre singole cellule senza danneggiare queste cellule nel processo. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume totale a 5 millilitri aggiungendo un volume sufficiente di HBSS al tessuto.

Triturare il tessuto ippocampale prima di circa 10 passaggi attraverso la pipetta normale a bordi lisci, quindi con altri 5-10 passaggi attraverso la pipetta con punta di diametro ridotto. L'obiettivo qui è ottenere una soluzione omogenea di cellule con nessun grumo di tessuto o pochissimi. Determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro.

Le rese tipiche sono di circa 800.000-un milione di cellule per cucciolo. Trasferire un volume sufficiente della sospensione cellulare in piastre contenenti vetrini di copertura rivestiti di poli-l-lisina in 4 millilitri di mezzo di placcatura, per ottenere una densità di placcatura compresa tra 100.000 e 500.000 cellule per piatto da 60 millimetri, a seconda dell'esperimento previsto. Metti i piatti in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2.

Dopo tre o quattro ore, trasferire i vetrini coprioggetti con i neuroni attaccati a piastre contenenti cellule gliali e terreno NBG. Questo dovrebbe essere fatto in modo tale che il lato su cui sono stati placcati i neuroni sia rivolto verso il basso verso lo strato di cellule gliali. Aggiungere un totale di quattro o cinque vetrini coprioggetti per piatto gliale.

Due o tre giorni dopo la piastratura, aggiungere la soluzione di aerocele a una concentrazione finale di cinque micromolari per piatto per arrestare la crescita delle cellule gliali. Alimentare le cellule una volta alla settimana sostituendo 2 millilitri del vecchio terreno con 2,5 millilitri di terreno fresco ad ogni poppata. Il mezzo extra aggiunto serve a compensare l'evaporazione nel tempo.

E solo una parte del terreno viene cambiata per garantire un condizionamento coerente del terreno da parte delle cellule gliali. Queste colture sono in genere sane per almeno un mese. I neuroni sono stati fissati con paraformaldeide al 4%, quindi incubati in anticorpi primari per l'imaging a fluorescenza.

Come si vede dalle immuno-colorazioni Tau e MAP2, questi neuroni sviluppano un'ampia arborizzazione con assoni e dendriti ben sviluppati. I neuroni maturi sviluppano anche spine sinaptiche identificate dalla localizzazione selettiva di Drebrin One, che sono strettamente opposte alle specializzazioni presinaptiche identificate dalla sinapsi in uno immuno-stating. Questi neuroni primari sono adatti per studi funzionali e strutturali di neuroni e sinapsi, inclusi studi sulla trasduzione del segnale, la polarità neuronale, il traffico subcellulare e lo sviluppo e la plasticità delle sinapsi, tra gli altri.

Questo video dovrebbe aiutare nella comprensione e nell'esecuzione accurata di diversi passaggi chiave di questo protocollo. La corretta aderenza al metodo descritto dovrebbe portare a una coltura neuronale sana e a lunga densità con un'ampia arborizzazione e sinapsi morfologicamente e funzionalmente ben sviluppate.