A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Questo protocollo è stato originariamente pubblicato dal Dott. Gary Bunker e dai suoi colleghi, ed è in grado di garantire una coltura di neuroni ippocampali embrionali con elevata densità e purezza, sospendendo i neuroni sopra uno strato di cellule gliali. Questo risultato rappresenta un notevole vantaggio rispetto ai nostri altri metodi per l'ippocampo, poiché consente ai neuroni di crescere a basse densità con poche cellule gliali di contaminazione. Tale risultato è pertanto ideale per l'analisi mediante imaging ad alta risoluzione e per lo studio della morfologia e della maturazione dei neuroni in coltura.

La post-maturazione di questo protocollo dovrebbe accelerare l'adattamento da parte di nuovi utenti, poiché esistono diversi passaggi chiave durante la procedura che sono difficili da descrivere, pertanto il protocollo li illustra passo dopo passo. Questo protocollo comprende tre popolazioni indipendenti necessarie per la coltivazione di neuroni primari di alta qualità. Questi processi includono la coltura di cellule gliali, la preparazione e il rivestimento di coprioggetti, e l'isolamento di cellule nervose ippocampali.

Per iniziare, il tessuto corticale di ratto in età postnatale precoce deve essere ottenuto come descritto nel protocollo scritto. Sebbene non mostrato direttamente qui, si noti che il passaggio di dissezione mostrato successivamente in questo protocollo è quasi identico a quello utilizzato per la dissezione corticale. Per questo motivo, i passaggi rilevanti saranno evidenziati durante la procedura di dissezione ippocampale mostrata più avanti in questo video.

A partire dal Passaggio Sei del protocollo scritto, rimuovere l'HBSS dal tessuto corticale raccolto, quindi tritare il tessuto nel modo più fine possibile utilizzando delle forbici. Aggiungere quantità sufficiente di HBSS al tessuto tritato per trasferire i pezzetti di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri, quindi portare il volume totale a 12 millilitri aggiungendo HBSS. Aggiungere 1,5 millilitri di tripsina al 2,5% e 1,5 millilitri di soluzione di DNA da 10 milligrammi per millilitro, capovolgere per mescolare, quindi incubare la miscela risultante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 12 minuti.

Trasferire il tessuto da 10 a 15 volte utilizzando una pipetta di Pasteur in vetro, quindi incubarlo nel bagnomaria per altri tre minuti. Assicurarsi che tutti i frammenti di tessuto si siano depositati sul fondo del tubo, quindi filtrare il soprannatante in un tubo conico da 50 millilitri contenente 5 millilitri di BGS. Aggiungere 13,5 millilitri di HBSS e 1,5 millilitri di 2.5&trypsin al tubo contenente i frammenti residui di tessuto non digerito, capovolgere per mescolare, quindi incubare nel bagnomaria per ulteriori 10 minuti.

Dopo l'incubazione, triturare il tessuto rimanente da 10 a 15 volte, quindi filtrarlo nel tubo contenente il filtrato iniziale. Successivamente, risciacquare il filtro facendo passare attraverso di esso ulteriori 3 millilitri di BGS. A questo punto, il filtrato può essere suddiviso in più tubi per semplificare sia la bilanciatura che la risospensione del pellet cellulare.

Centrifugare le sospensioni per sei minuti a 130 G. Dopo la centrifugazione, osservare che il fondo del pellet appare leggermente rossastro, a causa della presenza di componenti ematici. Rimuovere i soprannatanti, quindi aggiungere 1 millilitro di mezzo gliale a ciascuna provetta, avendo cura di non disturbare il pellet. Trasferire le porzioni di ciascun pellet che non presentano tale aspetto rossastro in una nuova provetta conica da 50 millilitri.

Aggiungere fino a 2 millilitri di mezzo gliale per ogni cucciolo per ri-sospendere il tessuto combinato e trasferire ogni volume di 2 millilitri della sospensione in 18 millilitri di mezzo gliale pre-riscaldato in un’area di coltura di 75 centimetri quadrati. Incubare il flacone in un’incubatrice a 37 gradi Celsius, con 5% di CO2. Il giorno successivo al seeding delle cellule, sostituire il mezzo in ogni flacone con mezzo gliale fresco.

Si noti che a questo stadio la coltura sarà una miscela di astrociti e altri tipi cellulari non bersaglio. Per rimuovere i tipi cellulari non astrocitari, i flaconi devono essere agitati energeticamente circa quattro giorni dopo la semina. A tale scopo, risciacquare i flaconi con HBSS, quindi aggiungere 10 millilitri di HBSS fresco a ciascun flacone e agitare vigorosamente ciascuno da cinque a dieci volte.

Aspirare l'HBSS e risciacquare altre due volte con HBSS. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo gliale e riposizionare le fiale nell'incubatore come in precedenza. Si noti che, nonostante questa procedura energica, gli astrociti desiderati per la coltura rimarranno fortemente aderenti alla superficie della fiala.

Per mantenere le colture di astrociti, cambiare il mezzo con mezzo gliale fresco due volte alla settimana fino al raggiungimento della confluenza. Una volta confluenti, le cellule possono essere congelate per un uso futuro come descritto nel protocollo scritto. Le cellule gliali devono essere seminate nelle piastre almeno 14 giorni prima dell'inizio della coltura neuronale, come descritto nel protocollo scritto.

Immergere i coprioggetti in acido nitrico concentrato e sottoporli a sonificazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Prestare attenzione, poiché l'acido nitrico concentrato è estremamente corrosivo. Si noti inoltre che alcuni laboratori preferiscono lasciare in ammollo i coprioggetti in acido nitrico tutta la notte utilizzando portacoprioggetti in ceramica.

Scartare con attenzione l'acido nitrico nella cappa chimica seguendo le linee guida istituzionali, quindi risciacquare le coprioggetti tre volte con acqua deionizzata. Immergere le coprioggetti in acqua e sottoporle nuovamente a sonificazione per 30 minuti. Successivamente, rimuovere l'acqua e risciacquare nuovamente le coprioggetti altre tre volte.

Immergere i coprioggetti in 50 millilitri di acqua, quindi sottoporli ad autoclave. In una cappa a flusso laminare sterile, rimuovere l'acqua e aggiungere da 20 a 30 millilitri di etanolo per il risciacquo. Aggiungere altri da 20 a 30 millilitri di etanolo, quindi trasferire i coprioggetti e l'etanolo in una piastra di Petri da 100 millimetri.

Utilizzando pinzette smussate, trasferire le lamelle colorate in piatti di Petri da 60 millilitri, quattro o cinque per piatto, quindi lasciarle asciugare all'aria appoggiando le lamelle contro il bordo del piatto. Una volta evaporato l'etanolo, riposizionare le lamelle in posizione orizzontale. Sciogliere 10 grammi di paraffina in un contenitore di vetro resistente al calore e mantenerla a una temperatura di circa 150-200 gradi Celsius.

La temperatura ideale potrebbe richiedere alcuni aggiustamenti, e temperature errate possono rendere difficile produrre paraffina di dimensioni corrette per i piedini. Immergere una pipetta di Pasteur nella paraffina, quindi toccare rapidamente tre punti vicino al bordo di ogni coprioggetto. Le gocce di paraffina si solidificheranno in perle alte circa da 3 a 5 millimetri e con un diametro da 1 a 2 millimetri, e fungeranno da spaziatori tra i neuroni sul coprioggetto e lo strato mono di cellule gliali sottostante.

Prendere piastre contenenti coprioggetti precedentemente preparati con piedini di paraffina. Aggiungere 200 microlitri di poli-l-lisina e tampone borato sulla superficie di ciascun coprioggetto e lasciare la soluzione a riposo sui coprioggetti per tutta la notte, coperti a temperatura ambiente. La superficie da rivestire deve essere la stessa su cui si trovano le perline di paraffina.

Se correttamente pulito, il poli-l-lisina dovrebbe diffondersi facilmente per coprire la superficie del vetrino. La mattina successiva, lavare i vetrini due volte immergendoli in acqua sterile per due ore ogni volta. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire l'acqua con 4 millilitri di mezzo di semina per ogni piastra.

Si noti che è importante che la superficie dei coverslip non si secchi dopo essere stata rivestita con poli-l-lisina. Posizionare le piastre con i coverslip in un incubatore a 37 gradi Celsius. Il coverslip rivestito deve essere incubato per almeno 24 ore prima dell'inizio della coltura neuronale.

Procacciare un ratto gravido al diciottesimo o diciannovesimo giorno embrionale e praticare l'eutanasia mediante un metodo approvato. Spruzzare la parte inferiore del ratto con etanolo al 70%, quindi praticare un'incisione mediana dalla regione pubica fino all'estremità della cavità addominale. Per evitare contaminazioni, prestare attenzione a tagliare soltanto attraverso la pelle in questo passaggio.

Sterilizzare gli strumenti da dissezione utilizzando etanolo al 70%, quindi praticare un'incisione nella parete addominale per esporre l'utero. Rimuovere i due corni uterini e posizionarli in una piastra sterile. All'interno di un'area di lavoro sterile a flusso laminare, rimuovere le membrane uterine che circondano i feti, quindi decapitarli e posizionare le teste in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente 20 millilitri di HBSS.

Dissezionare i cervelli e posizionarli immediatamente in una piastra Petri da 60 millimetri contenente 2 millilitri di HBSS su ghiaccio. Raccogliere solo due o tre cervelli per piastra per garantire spazio sufficiente per il passaggio successivo. Sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere le meningi a partire dalla linea mediana degli emisferi cerebrali.

Successivamente, dissezionare gli ippocampi. Si noti che l'ippocampo può essere riconosciuto come una struttura a forma di mezzaluna sulla superficie mediale dell'emisfero corticale ed è facile da rimuovere poiché è delimitato lateralmente da un ventricolo. Dopo averlo isolato, posizionare gli ippocampi in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente 4,5 millilitri di HBSS e mantenere in ghiaccio.

Si noti che i passaggi eseguiti fino a questo punto valgono anche per la dissezione della corteccia, con la differenza che si conservano le cortecce anziché gli ippocampi. Per la dissezione della corteccia, il passaggio successivo consiste nel separare la corteccia dal resto del cervello, come mostrato qui, quindi raccogliere le cortecce e l'HBSS come illustrato in precedenza. Una volta raccolto tutto il tessuto ippocampale nell'HBSS, trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere 5 millilitri di tripsina al 2,5%, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere delicatamente la soluzione di tripsina mediante pipetta di Pasteur, lasciando indisturbato il tessuto ippocampale sul fondo del tubo. Lavare il tessuto due volte aggiungendo delicatamente 5 millilitri di HBSS, incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi rimuovendola nuovamente con la pipetta di Pasteur, assicurandosi di non disturbare il tessuto sul fondo.

Mentre si attende il passaggio di incubazione precedentemente mostrato, preparare due varianti di pipette levigate alla fiamma per la dissociazione del tessuto. Per fare ciò, esporre brevemente la punta della pipetta di Pasteur in vetro a una fiamma, quindi esaminare la punta della pipetta. Per la prima variante, ripetere questo passaggio fino a quando i bordi della punta della pipetta sono levigati, ma il diametro rimane invariato.

Per il secondo, ripetere fino a quando i bordi non sono lisciati e il diametro della punta non è ridotto di circa la metà. È importante esercitarsi per individuare il diametro ideale, in modo da garantire che il tessuto venga dissociato per ottenere cellule singole senza danneggiare le cellule nel processo. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume totale a 5 millilitri aggiungendo un volume sufficiente di HBSS al tessuto.

Trasferire il tessuto ippocampale prima con circa 10 passaggi attraverso la pipetta normale con bordi lisci, quindi con altri cinque-dieci passaggi attraverso la pipetta con diametro della punta ridotto. L'obiettivo qui è ottenere una soluzione omogenea di cellule senza, o con pochissimi, grumi di tessuto. Determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro.

I rendimenti tipici sono di circa 800.000 fino a un milione di cellule per topo. Trasferire un volume sufficiente della sospensione cellulare in piastre contenenti coverslip rivestiti con poli-l-lisina in 4 millilitri di mezzo di semina, al fine di ottenere una densità di semina compresa tra 100.000 e 500.000 cellule per piastra da 60 millimetri, a seconda dell'esperimento previsto. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di CO2.

Dopo tre o quattro ore, trasferire i coverslip con i neuroni attaccati in piatti contenenti cellule gliali e mezzo NBG. L'operazione deve essere eseguita in modo che il lato su cui sono stati piastrati i neuroni sia rivolto verso il basso, in direzione dello strato di cellule gliali. Aggiungere un totale di quattro o cinque coverslip per ogni piatto di cellule gliali.

Due o tre giorni dopo la semina, aggiungere la soluzione di aerocele a una concentrazione finale di cinque micromolari per piastra per arrestare la crescita delle cellule gliali. Nutrire le cellule una volta alla settimana sostituendo 2 millilitri del mezzo vecchio con 2,5 millilitri di mezzo fresco a ogni cambio. Il mezzo aggiuntivo serve per compensare l'evaporazione nel tempo.

E viene cambiata solo una porzione del mezzo per garantire un condizionamento costante del mezzo da parte delle cellule gliali. Queste colture sono tipicamente sane per almeno un mese. I neuroni sono stati fissati con paraformaldeide al 4%, quindi incubati con anticorpi primari per l'immagine di fluorescenza.

Come evidenziato dalle colorazioni immunoistochimiche per Tau e MAP2, questi neuroni sviluppano un'ampia arborizzazione con assoni e dendriti ben differenziati. I neuroni maturi sviluppano inoltre spine sinaptiche identificate mediante la localizzazione selettiva della Drebrina Uno, che si trovano in stretta opposizione alle specializzazioni pre-sinaptiche rilevate mediante colorazione immunoistochimica per la sinapsina. Questi neuroni primari sono particolarmente adatti per studi funzionali e strutturali di neuroni e sinapsi, inclusi studi sulla trasduzione del segnale, polarità neuronale, traffico subcellulare e sviluppo e plasticità delle sinapsi, tra gli altri.

Questo video dovrebbe contribuire alla comprensione e alla corretta esecuzione di diverse fasi chiave di questo protocollo. Un rigoroso rispetto del metodo descritto dovrebbe portare a una coltura di neuroni vitali e densa, con ampia arborizzazione e sinapsi ben sviluppate dal punto di vista morfologico e funzionale.