Name: Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per lidentificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Scopri come identificare fosforilazioni multiple in proteine intrinsecamente disordinate usando la spettroscopia NMR con la proteina Tau. Questo metodo consente di collegare modifiche post-traduzionali a cambiamenti strutturali e funzionali.

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Le strutture NMR sono state finanziate dalla Région Nord, CNRS, Istituto Pasteur di Lille, Comunità Europea (FEDER), Ministero della Ricerca francese e Università delle Scienze e Tecnologie di Lille. Ringraziamo il supporto delle strutture principali TGE RMN THC (FR-3050, Francia), FRABio (FR 3688, Francia) e Lille NMR e RPE Health and Biology. La nostra ricerca è supportata da sovvenzioni del LabEx (Laboratorio di Eccellenza), DISTALZ (Sviluppo di Strategie Innovative per un approccio Transdisciplinare alla Malattia di Alzheimer), EU, ITN, TASPPI e ANR BinAlz.

1. Produzione di 15 N, 13 C-Tau (figura 1) <ol><li> Trasforma pET15b-Tau ricombinante T7 plasmide di espressione 13,14 in BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule batteriche 15. NOTA: la codifica cDNA per la più lunga (441 residui di aminoacidi) Tau isoforma viene clonato tra NcoI e XhoI siti di restrizione del plasmide pET15b. <ol><li> Mescolare delicatamente 50 ml di BL21 competente cellule (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonie per mg di DNA plasmidico, con 100 ng di DNA plasmidico in un tubo di plastica da 1,5 ml. NOTA: Codone-utilizzo ottimizzato ceppi batterici per l&#39;espressione di cDNA eucariotica non sono essenziali per la produzione di Tau umana. </li><li> Posizionare la miscela di cellule in ghiaccio per 30 min e poi shock termico per 10 sec a 42 ° C. Posizionare il tubo di nuovo in ghiaccio per 5 minuti e aggiungere 1 ml di temperatura ambiente LB (Luria-Bertani) di media. Incubare la sospensione batterica a 37 ° C per 30 min sotto blandaagitazione. </li></ol></li><li> Distribuire utilizzando un ciclo inoculo 100 ml di sospensione cellulare in modo uniforme su una piastra di agar di terreno LB contenente 100 ug / ml di ampicillina. </li><li> Incubare la piastra di selezione per 15 ore a 37 ° C. </li><li> Mantenere la piastra di selezione a 4 ° C fino procedere alla fase coltura, per un massimo di 2 settimane circa. NOTA: uno stock di glicerolo di coltura batterica (50% glicerolo), conservati a -80 ° C, può essere preparato per avviare la coltura in una fase successiva. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 M MgSO 4, 1 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml 100x MEM vitamina complemento, 1 ml di 100 mg / ml di ampicillina a 1 L di sali M9 autoclave (6 g di Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g NaCl). NOTA: Un precipitato bianco formerà dopo l&#39;aggiunta della soluzione di CaCl 2 ai sali M9 che dissipa rapidamente. </li><li> Solubilizzare 300 mg di 15 N, media 13 C-completo, 1 g di 15NH 4 Cl e 2 g di 13 C 6-glucosio in 10 ml di terreno M9. Filtro-sterilizzare la soluzione isotopica utilizzando un filtro da 0,2 micron, direttamente nel terreno M9. </li><li> Sospendere utilizzando un inoculo ciclo una colonia di pET15b-Tau trasformato batteri dalla piastra di selezione in 20 ml di terreno LB addizionato con 100 ug / ml di ampicillina. </li><li> Incubare il mezzo inoculato a 37 ° C per circa 6 ore. </li><li> Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) in 1 ml di una diluizione di dieci volte della coltura batterica in una cuvetta spettrometro di plastica. NOTA: torbidità della coltura batterica di OD 600 di 3,0-4,0 indica che la fase di crescita di saturazione viene raggiunta. </li><li> Aggiungere 20 ml della cultura LB saturo a 1 L di terreno di coltura M9 addizionato con ampicillina (100 mg / ml concentrazione finale), in 2 pallone di coltura sconcertato L Erlenmeyer plastica. </li><li> Porre il pallone cultura in un incubatore programmabile impostato a 10 °C e 50 rpm. Programmare l&#39;incubatore per passare a 200 giri al minuto e 37 ° C nelle prime ore del mattino del giorno successivo. </li><li> Misura OD 600 su 1 ml di coltura batterica in una cuvetta spettrometro di plastica. Aggiungere 400 ml di 1 M IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) soluzione madre (mantenuta a -20 ° C) quando OD 600 raggiunge un valore di circa 1,0 per indurre l&#39;espressione della proteina Tau ricombinante. </li><li> Continuare l&#39;incubazione a 37 ° C per ulteriori 3 ore. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 5.000 xg per 20 min. </li><li> Congelare il pellet batterico a -20 ° C. Tenere congelato fino alla fase di purificazione, per un periodo prolungato, se necessario. </li></ol> 2. Purificazione di 15 N, 13 C-Tau (Figura 2) <ol><li> Autoclave scambio cationico (CEX) buffer di depurazione a 121 ° C sotto i 15 psi per 20 min. buffer Conservare a 4 ° C. </li><li> Scongelare il pellet di cellule batteriche e risospendere accuratamente in 45 mldell&#39;estrazione CEX Un buffer (50 mm Napi tampone pH 6,5, 1 mM EDTA) appena completato con 1x inibitori della proteasi cocktail (1 compressa) e DNasiI (2.000 unità). </li><li> Frantumare le cellule batteriche utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione a 20.000 psi. 3-4 passaggi sono necessari. Centrifugare a 20.000 xg per 40 minuti per rimuovere il materiale insolubile. </li><li> Riscaldare l&#39;estratto cellula batterica per 15 min a 75 ° C utilizzando un bagno d&#39;acqua. NOTA: un precipitato bianco si osserva dopo pochi minuti. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 20 min e mantenere il surnatante contenente la proteina Tau termostabile. </li><li> Conservare a -20 ° C fino alla successiva fase di purificazione, se necessario. </li><li> Eseguire un cromatografia a scambio cationico su una forte resina CEX imballato come una colonna 5 ml di base per mezzo di una proteina veloce cromatografia liquida sistema (FPLC) (Figura 3 A). <ol><li> portata impostata a 2,5 ml / min. </li><li> Equilibrare la colonna in CEX Un buffer </li><li> Caricare il heated- 60-70 mlestratto contenente Tau utilizzando una pompa di campionamento, oppure pompa A, a seconda del sistema. Raccogliere il flusso continuo di analisi per verificare che la proteina Tau è efficacemente vincolante alla resina (vedi 2.8). </li><li> Lavare la resina con CEX Un buffer fino assorbanza a 280 nm è tornato al valore di base. </li><li> Eluire Tau dalla colonna utilizzando un tre fasi NaCl gradiente ottenuto mediante aumento graduale di tampone CEX B (CEX Un buffer con 1 M NaCl). Programmare il FPLC come segue: primo passo del gradiente al 25% tampone CEX B in 10 volumi di colonna (CV) per raggiungere 250 mM NaCl, secondo passaggio al 50% tampone CEX B in 5 CV per raggiungere 500 mM NaCl, e terzo passo al 100% CEX B buffer in 2 CV per raggiungere 1 M NaCl. Raccogliere 1,5 ml frazioni durante le fasi di eluizione. </li></ol></li><li> Analizzare 10 ml di frazioni raccolte durante la fase di eluizione mediante SDS-PAGE (12% gel SDS-acrilammide) e Coomassie colorazione (Figura 3) 16. Controllare la fase di caricamento della colonna così da analyzing 10 ml di flusso continuo. </li><li> Scegliere le frazioni contenenti Tau e piscina queste frazioni per il passo successivo. </li><li> Effettuare uno scambio di buffer sulle frazioni Tau contenenti aggregati (Figura 3 B). <ol><li> Equilibrare una colonna dissalazione di 53 ml G25 letto riempito di resina (26 x 10 cm) in 50 mM di bicarbonato di ammonio (buffer volatile) utilizzando un sistema FPLC. </li><li> Impostare la portata a 5 ml / min. Iniettare il campione Tau sulla colonna tramite un sistema di iniezione 5 ml. Raccogliere frazioni corrispondenti al picco di assorbimento a 280 nm. </li><li> Ripetere l&#39;iniezione 3-4 volte, a seconda del volume del pool iniziale CEX. </li></ol></li><li> Calcolare la quantità di proteina Tau purificata utilizzando l&#39;area del picco sul cromatogramma a 280 nm (1 mg di Tau corrisponde a 140 mAU * ml). NOTA: Il coefficiente di estinzione di proteina Tau a 280 nm è 7,550 M -1 cm -1. Tau non contiene residui di Trp. </li><li> Pool tutte le frazioni Tau. </li><li> aliquot il campione in provette contenenti l&#39;equivalente di 1 a 5 mg di Tau. Scegliere questi tubi in modo che il volume della soluzione è piccolo rispetto al volume del tubo (per esempio 5 ml di soluzione in un tubo da 50 ml). </li><li> Perforare i tappi dei tubi utilizzando un ago. Congelare i campioni Tau a -80 ° C. </li><li> campioni lyophilize Tau. proteina Tau liofilizzato può essere conservato a -20 ° C per lunghi periodi di tempo. </li></ol> 3. In Vitro fosforilazione di 15 N-Tau <ol><li> Disciogliere 5 mg di Tau liofilizzato in 500 microlitri tampone di fosforilazione (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl). </li><li> Aggiungere 2,5 mM ATP (25 ml di 100 mM soluzione madre conservati a -20 ° C), 1 mM DTT (1 ml di 1 M soluzione madre conservati a -20 ° C), 1 mM EGTA (2 ml di uno stock di 0,5 M soluzione), cocktail di inibitori della proteasi 1x (25 ml di uno stock 40x ottenuta sciogliendo 1 compressa nel buffer di 1 ml fosforilazione) e 181; M attivato His-ERK2 (250 microlitri di tampone di conservazione 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl e 10% glicerolo, conservato a -80 ° C) in un volume totale di campione 1 ml. NOTA: La attivato il suo-ERK2 può essere preparato in casa 5,8 da fosforilazione con la chinasi MEK. </li><li> Incubare 3 ore a 37 ° C. </li><li> Riscaldare il campione a 75 ° C per 15 minuti per inattivare ERK chinasi. </li><li> Centrifugare a 20.000 xg per 15 min. Raccogliere e conservare il surnatante. </li><li> Dissalare campione proteico in 50 mM di bicarbonato di ammonio usando una colonna di 3,45 ml G25 letto di resina imballato (1.3 x 2.6 cm), che è adatto per un campione 1 ml. </li><li> Eseguire un 12% SDS-PAGE 16 con 2,5 ml di campione proteico per controllare sia la sua integrità e la fosforilazione efficiente (Figura 4). </li><li> Lyophilize il campione Tau fosforilata. Conservare la polvere a -20 ° C. </li></ol> 4. Acquisizione di spettri NMR (Figura 5) <ol><li> Solubilizzare 4 mg di liofilizzato 15 N, 13 C-ERK fosforilata-Tau in 400 microlitri di buffer NMR (50 mm o 50 mm Napi deuterati Tris- D11 .CL, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA e 1 mM DTT). </li><li> Aggiungere 5% D 2 O per bloccaggio settore dello spettrometro NMR e 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) sale sodico 4 propionico-2,2,3,3-d)) come riferimento il segnale NMR interna. Aggiungere 10 ml di una soluzione 40x magazzino di completo cocktail inibitore della proteasi. </li><li> Trasferire il campione in un tubo NMR 5 millimetri usando una siringa elettronico con un lungo ago o pipetta Pasteur. Chiudere la provetta NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria intrappolate tra il pistone e il liquido da movimenti stantuffo. </li><li> Posizionare il tubo NMR in uno spinner. Regolare la posizione verticale nel filatore con il calibro appropriato per la testa della sonda NMR utilizzato, in modo che la maggior parte della soluzione campione sarà all&#39;interno della bobina NMR. </li><li> Avviare il flusso d&#39;aria: clicca ascensore in la finestra di sistema di controllo magnetico. posizionare accuratamente il filatore con il tubo nel flusso d&#39;aria nella parte superiore del foro del magnete. Arrestare il flusso d&#39;aria (clicca ascensore) e lasciare che il tubo di scendere in posizione all&#39;interno della testa della sonda nel magnete. </li><li> Impostare la temperatura a 25 ° C (298 K). </li><li> Eseguire la sintonia semi-automatico e la corrispondenza della testa di misura per ottimizzare la trasmissione di potenza. Digitare atmm sulla riga di comando. </li><li> Bloccare la frequenza spettrometro utilizzando il segnale D 2 O del campione registrato sul canale deuterio. Fare clic di blocco nella finestra di sistema di controllo magnetico. </li><li> Avviare la procedura di spessoramento per ottimizzare l&#39;omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione. Tipo topshim gui sulla riga di comando per aprire la finestra di spessore. Fare clic su Start nella finestra di spessore. Controllare il valore variazione standard B0 residua per verificare che gli spessori sono ottimali (meno di 2 Hz è buono). </li><li> Calibrare il parametro p1 (lunghezza di un protoneimpulsi a radiofrequenza in msec), che è necessaria per ottenere una rotazione di 90 ° di giri protoni. Obiettivo per l&#39;impulso 360 ° usando uno spettro 1D di protoni dell&#39;acqua (Figura 6). </li><li> Regolare la frequenza di offset impostando il parametro o1 (in Hz) alla frequenza dell&#39;acqua protoni nello spettro 1D (Figura 6). </li><li> Inizia acquisizione di uno spettro protonico 1D (sequenza di impulsi con la sequenza watergate per la soppressione del segnale dell&#39;acqua, per esempio zggpw5) per verificare segnali dal campione (Figura 7). Adattare il numero di scansioni alla concentrazione proteica relativa. Digitare ZG sulla riga di comando per avviare l&#39;acquisizione. </li><li> Impostare parametri aggiuntivi per l&#39;acquisizione di un 2D [1 H, 15 N] spettro HSQC (impulso sequenza hsqcetfpf3gpsi, figure 8-9). <ol><li> Per un 15 N, 13 C etichettato campione, disaccoppiare 13 C durante l&#39;evoluzione indiretta 15 N. </li><li&gt; Impostare il numero di punti e la larghezza spettrale (ppm) in 1 H (F2) e 15 N dimensioni (F1). NOTA: Adattare il numero di punti di dati di acquisizione al campo spettrometro di mantenere un numero simile di Hz per punto e di limitare i tempi di disaccoppiamento: utilizzare 3.072 punti a 900 MHz e 2048 punti a 600 MHz, nella dimensione 1 H. </li><li> Ottimizzare i parametri aggiuntivi nelle sequenze di impulsi, corrispondente a ritardi, lunghezze di impulso, offset frequenze, livelli di potenza. Tipo ased sulla riga di comando per visualizzare tutti i parametri rilevanti per l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Impostare i parametri per l&#39;acquisizione di un 3D [1 H, 15 N, 13 C] spettro HNCACB (sequenza di impulsi hncacbgpwg3d, Figura 10A) a 600 MHz. </li><li> Impostare i parametri per un 3D [1 H, 15 N, 15 N] esperimento HNCANNH (impulso sequenza hncannhgpwg3d) a 600 MHz. Impostare il numero di punti a 2048 in 1 H e 64e 128 punti in due 15 N dimensioni. Definire le larghezze spettrali come 14, 25, 25 parti per milione (ppm) centrato su 4.7, 119, 119 ppm nel 1 H, 15 N e 15 N dimensioni. Durata di acquisizione con 16 scansioni è di 1 giorno e 22 ore. </li></ol> 5. Individuazione di siti di fosforilazione <ol><li> spettri di processo utilizzando il software di acquisizione ed elaborazione NMR. <ol><li> Eseguire una trasformazione di Fourier dei dati (Figura 7). Tipo ft per uno spettro 1D, XFB per uno spettro 2D o ft3d per uno spettro 3D, sulla riga di comando. </li><li> Fase e riferimento tutti gli spettri (Figura 7C) utilizzando le finestre interattive. </li></ol></li><li> Identificare risonanze di interesse nella HSQC 2D potenzialmente corrispondente alla fosforilate residui Ser e Thr (Figura 9, box rosso). </li><li> Piani di estrazione (ad esempio 2D 1 H- 13 C spettri) dalo spettro C 3D 1 H- 15 N-13 utilizzando i 15 N spostamenti chimici di risonanze di interesse in 2D. Utilizzare il cursore di dimensione 2 (w2) per scegliere la frequenza 15 N corrispondente al piano (w1-w3) da visualizzare (Figura 10B). </li><li> Raccogliere le frequenze di risonanza di &#39;CA&#39; e &#39;CB&#39; 13 C nuclei della &#39;i&#39; e residui &#39;i-1&#39; (debole insieme di segnali rispetto a quelli del residuo i) per ogni [1 H, 15 N] risonanza di interesse nello spettro HNCACB 3D cliccando sulla risonanza, nel menu della modalità puntatore trovare / aggiungere picco, aggiungere il valore di spostamento chimico in un file di elenco di picco. <ol><li> Identificare il tipo I residui, PSER o pThr, confrontando i cambiamenti chimici nella lista di picco a valori noti di CA e CB spostamenti chimici di PSER e pThr 17. </li><li> Identificare la presenza di un residuo di Pro alla i + 1 posizione da una ulteriore caratteristica +2 ppm spostamento of il valore di spostamento CA chimica 18. </li><li> Confrontare i valori di chemical shift delle risonanze CA e CB corrispondenti alla i-1 residuo una tabella di spostamenti chimici previsti per Tau residui amminoacidici 19 per identificare la natura del residuo in posizione i-1. </li></ol></li><li> Raccogliere le frequenze di risonanza di 15 N nuclei di la &#39;i&#39; e &#39;I-1&#39; residui per ciascuna [1 H, 15 N] risonanza di interesse nello spettro HNCANNH. </li><li> Confrontare i valori di chemical shift 15 N all&#39;assegnazione chemical shift della proteina Tau 20 - 23. </li><li> Confronto dipeptidi identificati con la sequenza Tau per definire l&#39;assegnazione specifica sequenza. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo usato la spettroscopia NMR per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati. L&#39;espressione ricombinante e purificazione qui descritta per la proteina Tau umano full-length possono allo stesso modo essere utilizzati per produrre mutanti Tau o Tau domini. Isotopicamente proteina arricchito è necessaria per la spettroscopia NMR, rendendo necessario l&#39;espressione ricombinante. Identificazione dei siti di fosforilazione richiede l&#39;assegnazione di risonanza e un 15 N, 13 C p...

Una delle principali sfide della sanità nel 21 ° secolo, sono le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD). Tau è una proteina associata ai microtubuli che stimola microtubuli (MT) formazione. Tau è ugualmente coinvolto in diverse malattie neurodegenerative, le cosiddette tauopatie, di cui il più noto è AD. In questi disturbi, Tau auto-aggregati in filamenti elicoidali appaiati (PHFS) e si trova modifica per molti residui di modificazioni post-(PTM), come la fosforilazione 1. La fosforilazione della proteina tau è implicata nella regolazione sia della sua funzione fisiologica di stabilizzazione MT e la perdita patologica di funzione che caratterizza i neuroni AD. Inoltre, la proteina Tau, se integrato in PHFS nei neuroni malati, è invariabilmente hyperphosphorylated 2. A differenza di Tau normale che contiene 2-3 gruppi fosfato, il Tau iperfosforilata in PHFS contiene 5-9 Phosphate gruppi 3. Iperfosforilazione di Tau corrisponde sia ad un aumento della stechiometria in alcuni siti e fosforilazione di altri siti che sono chiamati siti patologici di fosforilazione. Tuttavia, esiste sovrapposizione tra AD e modelli normali adulti di fosforilazione, nonostante le differenze quantitative nel livello 4. Come specifica eventi di fosforilazione funzione di influenza e la disfunzione di Tau rimane in gran parte sconosciuta. Il nostro obiettivo è di decifrare regolamento Tau dal PTM a livello molecolare. Per approfondire la comprensione degli aspetti molecolari di Tau, dobbiamo affrontare sfide tecniche. In primo luogo, è una proteina Tau intrinsecamente disordinati (IDP) quando isolato in soluzione. Tali proteine ​​mancano ben definita struttura tridimensionale in condizioni fisiologiche e richiedono particolari metodi biofisici per studiare la funzione (s) e le proprietà strutturali. Tau è un paradigma per la crescente classe degli sfollati, che spesso si trovano associatopatologie quali le malattie neurodegenerative, aumentando così l&#39;interesse per comprendere i parametri molecolari sottostanti le loro funzioni. In secondo luogo, la caratterizzazione di Tau fosforilazione è una sfida analitica, con 80 potenziali siti di fosforilazione lungo la sequenza più lunga 441 amminoacidi Tau isoforma. Un certo numero di anticorpi sono stati sviluppati contro epitopi fosforilate di Tau e sono utilizzati per il rilevamento di proteina tau nei neuroni o tessuto cerebrale. eventi di fosforilazione possono avvenire su almeno 20 siti presi di mira da chinasi prolina-diretto, la maggior parte dei quali in prossimità nella regione ricca di prolina. La qualitativo (quali siti?) E quantitativa (cosa stechiometria?) Caratterizzazione è difficile anche dalle più recenti tecniche di MS 5. spettroscopia NMR può essere usato per studiare le proteine ​​disordinate che sono altamente sistemi dinamici costituiti da gruppi di conformeri. spettroscopia NMR ad alta risoluzione è stato appliEd a indagare sia la struttura e la funzione della proteina Tau. Inoltre, la complessità del profilo fosforilazione di Tau ha portato allo sviluppo di strumenti molecolari e nuovi metodi analitici utilizzando NMR per l&#39;identificazione dei siti di fosforilazione 6 - 8. NMR come metodo analitico consente l&#39;identificazione dei siti di fosforilazione Tau in modo globale, visualizzazione di tutte le modifiche single-site in un singolo esperimento, e la quantificazione del grado di incorporazione di fosfato. Questo punto è essenziale in quanto, anche se gli studi di fosforilazione di Tau abbondano nella letteratura, la maggior parte di loro sono stati eseguiti con anticorpi, lasciando un ampio margine di incertezza sul profilo completo di fosforilazione e quindi il vero impatto di singoli eventi di fosforilazione. chinasi ricombinanti tra PKA, glicogeno-sintasi chinasi 3β (Gsk3β), ciclina-dipendente chinasi 2 / ciclina A (CDK2 / CYCA), ciclina-dipendente chinasi 5 (CDK5) / p25 attoproteine ​​ivator, extracellulare segnale-regolate chinasi 2 (ERK2) e microtubuli-affinità di regolazione chinasi (MARK), che mostrano l&#39;attività fosforilazione verso Tau, possono essere preparati in una forma attiva. Inoltre, Tau mutanti che permettono per la generazione di specifiche isoforme della proteina Tau con i modelli di fosforilazione ben caratterizzati sono utilizzati per decifrare il codice di fosforilazione di Tau. Spettroscopia NMR viene quindi utilizzato per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati 6 - 8. Anche se in vitro fosforilazione di Tau è più impegnativo di pseudo-fosforilazione come per mutazione di selezionati Ser / Thr in residui di acido glutammico (Glu), questo approccio ha i suoi meriti. Infatti, né i impatto né di interazione parametri strutturali di fosforilazione possono sempre essere imitato da acidi glutammico. Un esempio è il motivo turno osservato intorno fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), che non è riprodotto con Glu mutazioni 9. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Qui, la preparazione di isotopicamente marcato Tau per indagini NMR verrà descritto prima. proteina tau fosforilata da ERK2 viene modificato su numerosi siti descritti come siti patologiche di fosforilazione, e rappresenta quindi un interessante modello di Tau hyperphosphorylated. Un protocollo dettagliato di Tau in fosforilazione vitro da ricombinante ERK2 chinasi è presentato. ERK2 viene attivata dalla fosforilazione da mitogeni activated protein chinasi / ERK chinasi (MEK) 10 - 12. Oltre alla preparazione di modificato, proteina Tau isotopicamente marcati, la strategia NMR utilizzato per l&#39;identificazione del PTM è descritto.

<table><tbody><tr><td>pET15B plasmide di espressione T7 ricombinante</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Mantenere a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) trasformazione competente E. coli batteri</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Tenere a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Brodo LB autoclavato, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td></td></tr><tr><td>Complementi vitaminici MEM</td> per terreno di crescita batterica 100x <td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Integratore di terreno per la crescita batterica</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO polvere media completa</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Integratore di terreno per la crescita batterica</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isotopo</td></tr><tr><td>13C6-glucosio</td><td>Sigma</td><td>389374</td> compresse di <td></td></tr><tr><td>inibitori della proteasi isotopica&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Mantenere a 4 gradi C</td></tr><tr><td>1 compressa in 1 ml è una soluzione 40x che può essere conservata a -20 gradi C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Mantenere a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysis è realizzato a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Proteina non colorata MW Marker</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>chinasi MEK1 umana attiva, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Mantenere a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; Sistema cromatografico puro</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (colonna da 5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Colonne cromatografiche a scambio cationico</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalinizzazione</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Colonna di desalinizzazione delle proteine</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Colonna di desalinizzazione delle proteine</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Tampone NMR deuterato</td></tr><tr><td>5 mm Microprovetta simmetrica SHIGEMI D2O (set di 5 tubi interni ed esterni)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi</td></tr><tr><td>Tubes eVol kit-starter kit siringa elettronica</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipettaggio</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII con testa di sonda criogenica a tripla risonanza</td><td>Spettrometro Bruker NMR per acquisizione dati</td><td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>600 MHz Avance con testa di sonda criogenica a tripla risonanza</td><td>Spettrometro Bruker</td><td></td><td>NMR per acquisizione dati</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software di acquisizione ed elaborazione per esperimenti NMR</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard e D. G. Kneller)</td><td></td><td>Software di analisi dei dati NMR</td></tr></tbody></table>

nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Gli aggregati della proteina Tau neuronale si trovano all'interno dei neuroni dei pazienti con malattia di Alzheimer. Lo sviluppo della malattia è accompagnato da un'aumentata fosforilazione anomala della Tau. Nel corso dell'indagine molecolare delle funzioni e delle disfunzioni della Tau nella malattia, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene utilizzata per identificare le fosforilazioni multiple della Tau. Presentiamo qui protocolli dettagliati di produzione ricombinante di Tau nei batteri, con arricchimento isotopico per studi NMR. Vengono descritte le fasi di purificazione che sfruttano la stabilità al calore e l'alto punto isoelettrico della Tau. Il protocollo per la fosforilazione in vitro di Tau da parte di ERK2 attivata ricombinante consente di generare fosforilazioni multiple. Il campione proteico è pronto per l'acquisizione dei dati al momento di questi passaggi. Successivamente viene considerata l'impostazione dei parametri per avviare la registrazione sullo spettrometro. Infine, viene spiegata la strategia per identificare i siti di fosforilazione della Tau modificata, sulla base dei dati NMR. Viene discusso il vantaggio di questa metodologia rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i siti di fosforilazione, come l'immunorilevazione o la spettrometria di massa (MS).

La figura 3A mostra un grande picco di assorbimento a 280 nm osservati durante il gradiente di eluizione. Questo picco corrisponde alla proteina Tau purificata come visto sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Figura 3B mostra un picco di assorbimento ben separati a 280 nm e picco di conducibilità, assicurando che dissalazione della proteina è efficiente. La figura 4 mostra proteina gel-shift osservato mediante analisi SDS-PAGE 16 caratteristico multiple fosforilazione pr...

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di identificare la fosforilazione multipla di una proteina intrinsecamente disordinata mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare utilizzando la proteina tau come caso di studio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella regolazione molecolare legate alla malattia, come l'impatto della fosforilazione sull'interazione della proteina con il suo partner molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo identificare la fosforilazione sito-specifica in una proteina disordinata e collegarla a cambiamenti strutturali e funzionali.Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sulla funzione. Può anche essere applicato ad altre proteine come i resti disordinati della proteina DNA del virus aPtc Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia mediante lo sviluppo di proteine, inibitori dell'interazione proteica. Questo metodo sarà dimostrato da Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa e Hamida Merzougui, i dottorandi del nostro gruppo.Per iniziare, mescola delicatamente 50 microlitri di cellule BL21 competenti con 100 nanogrammi di DNA plasmidico, formando da 10 a 15 milioni di colonie per microgrammo di DNA plasmatico in una provetta di plastica da 1,5 millilitri. Dopo aver messo la miscela di celle sul ghiaccio per 30 minuti, riscaldarla per 10 secondi a 42 gradi Celsius. Quindi rimettere il tubo in ghiaccio per cinque minuti prima di aggiungere un millilitro di Luria Bertani a temperatura ambiente o LB medium.Incubare la sospensione batterica a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando delicatamente. Utilizzando uno spreader, distribuire uniformemente 100 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar di terreno LB contenente 100 microgrammi per millilitro di antibiotico ampicillina. Incubare la piastra di selezione per 15 ore a 37 gradi Celsius.Successivamente, solubilizzare 300 milligrammi di terreno arricchito con azoto 15 e carbonio 13, un grammo di cloruro di ammonio azoto 15 e due grammi di glucosio marcato con carbonio 13 in 10 millilitri di terreno M9. Filtro: sterilizzare la soluzione isotopica direttamente nel mezzo M9 utilizzando un filtro da 0,2 micron. Utilizzando una pipetta pasteur, sospendere una colonia di batteri trasformati nel plasma ricombinante dalla piastra di selezione in 20 millilitri di terreno LB, integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.Incubare il terreno inoculato a 37 gradi Celsius per circa sei ore. Misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600 utilizzando un millilitro di una diluizione di dieci volte della coltura batterica in una cuvetta spettrometrica in plastica. Quindi, aggiungere 20 millilitri di coltura LB satura a un litro di terreno di crescita M9 integrato con ampicillina in un pallone di coltura sconcertato in vetro Erlenmeyer da due litri.Posizionare il pallone di coltura in un incubatore programmabile impostato a 10 gradi Celsius e 50 giri/min. Programmare l'incubatrice in modo che passi a 200 giri/min e 37 gradi Celsius la mattina presto del giorno successivo. Misurare l'OD600 su un millilitro di coltura batterica in una cuvetta spettrometrica in plastica.Aggiungere 400 microlitri di una soluzione madre di IPTG molare quando l'OD600 raggiunge un valore di circa 1,0 per indurre l'espressione della proteina tau ricombinante. Dopo aver incubato le cellule batteriche a 37 gradi Celsius per altre tre ore, raccoglierle mediante centrifugazione a 5.000 volte g per 20 minuti. Scongelare il pellet di cellule batteriche e ri-sospenderlo accuratamente in 45 millilitri di tampone a scambio cationico A, appena integrato con 1x cocktail di inibitori della proteasi DNasel 1.Distruggere le cellule batteriche utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione a 20.000 PSI, sono necessari da tre a quattro passaggi per distruggere adeguatamente le cellule. Centrifugare le cellule disgregate a 20.000 volte g per 40 minuti per rimuovere il materiale insolubile. Riscaldare l'estratto di cellule batteriche per 15 minuti a 75 gradi Celsius utilizzando un bagnomaria.Dopo pochi minuti si osserverà un precipitato bianco. Quindi, centrifugare l'estratto riscaldato a 15.000 volte g per 20 minuti e mantenere il surnatante contenente la proteina tau stabile al calore. Successivamente, eseguire la cromatografia a scambio cationico su una resina CEX forte confezionata come colonna a letto da 5 millilitri utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce.Impostare la portata a 2,5 millilitri al minuto ed equilibrare la colonna in tampone CEX A. Successivamente, caricare l'estratto di tau riscaldato da 60 a 70 millilitri utilizzando una pompa per campioni, raccogliere il flusso per l'analisi per verificare che la proteina tau si leghi in modo efficiente alla resina. Lavare la resina con tampone CEX A fino a quando l'assorbanza a 280 nanometri non torna al valore basale.Programmare l'FPLC con un gradiente fino al 25% di tampone CEX B in 10 volumi di colonna per raggiungere 250 millimolari di cloruro di sodio. Seguire con il tampone CEX B al 50% in cinque volumi di colonna per raggiungere i 500 millimolari di cloruro di sodio. Infine, aumentare il gradiente al 100% del tampone CEX B in due volumi di colonna per raggiungere un molare di cloruro di sodio.Raccogliere frazioni di 1,5 millilitri durante le fasi di eluizione. Quindi, eseguire uno scambio di buffer sulla tau contenente frazioni raggruppate. Equilibrare una colonna di desalinizzazione con un letto impaccato di resina G25 da 53 millilitri in tampone bicarbonato di ammonio da 15 millimolari utilizzando un sistema FPLC.Impostare la portata a cinque millilitri al minuto e iniettare il campione di tau sulla colonna tramite un circuito di iniezione da cinque millilitri. Raccogliere le frazioni corrispondenti al picco di assorbimento a 280 nanometri. Raggruppare tutte le frazioni tau prima di allocare il campione nelle provette.Scegliere questi tubi in modo che il volume della soluzione sia piccolo rispetto al volume del tubo. Quindi, praticare dei fori nei tappi delle provette utilizzando un ago prima di congelare i campioni di tau a meno 80 gradi Celsius per la successiva liofilizzazione. Solubilizzare quattro milligrammi di tau fosforilata arricchita con azoto 15 e carbonio 13 in 400 microlitri di tampone NMR.Aggiungere il cinque percento di ossido di deuterio per il blocco di campo dello spettrometro NMR e un millimolare TMSP come riferimento del segnale NMR interno. Inoltre, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre da 40 EK di un cocktail completo di inibitori della proteasi. Trasferire il campione in una provetta NMR da cinque millilitri utilizzando una siringa elettronica con ago lungo o utilizzando una pipetta pasteur.Chiudere il tubo NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra lo stantuffo e il liquido muovendo lo stantuffo. Posizionare il tubo NMR in uno spinner.Utilizzare il manometro appropriato per regolare la sua posizione verticale nella rotatrice in modo tale che la maggior parte della soluzione del campione si trovi all'interno della bobina NMR. Quindi, avviare il flusso d'aria nello strumento NMR facendo clic su lift nella finestra Magnet Control System. Posizionare con cautela l'ogiva con il tubo nel flusso d'aria nella parte superiore del foro del magnete.Quindi arrestare il flusso d'aria e lasciare che il tubo scenda in posizione all'interno della testa della sonda all'interno del magnete. Dopo aver lasciato che il campione si equilibrasse a 25 gradi Celsius, digitare ATMM nella riga di comando per eseguire la regolazione e l'abbinamento semiautomatici della testa della sonda per ottimizzare la trasmissione di potenza. Quindi fare clic su Blocca nella finestra Sistema di controllo del magnete per attivare il blocco della frequenza di campo dello spettrometro.Avviare la procedura di shimming per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione digitando prima TopShim GUI sulla riga di comando per aprire la finestra dello shim. Quindi fare clic su Avvia nella finestra dello shim. Controllare la deviazione standard B0 residua per verificare che gli spessori siano ottimali.Quindi, calibrare il parametro P1, che è la lunghezza di un impulso a radiofrequenza protonica in microsecondi. Questo parametro è necessario per ottenere una rotazione di 90 gradi della magnetizzazione dello spin del protone. Punta all'impulso a 360 gradi utilizzando uno spettro unidimensionale di protoni d'acqua.Regolare l'offset di frequenza impostando il parametro O1 sulla frequenza dell'acqua protonica nello spettro unidimensionale. Infine, inizia l'acquisizione dello spettro protonico unidimensionale digitando ZG nella riga di comando. Un risultato rappresentativo della purificazione della tau ricombinante mostra un picco di assorbimento maggiore a 280 nanometri osservato durante il gradiente di eluizione.Questo picco corrisponde alla proteina tau purificata, come si vede sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Il cromatogramma per la desalinizzazione della tau purificata ricombinante mostra che il picco di assorbimento a 280 nanometri e il picco di conducibilità sono ben separati, garantendo che la desalinizzazione della proteina sia efficiente per la fase di liofilizzazione. Lo spettro NMR unidimensionale dell'azoto 15 tau ricombinante a 900 megahertz conferma che è possibile rilevare un segnale NMR dal campione proteico.Un buon rapporto segnale/rumore indica che i parametri di acquisizione di base sono stati impostati correttamente. Lo spettro bidimensionale della proteina fosforilata mostra una buona risoluzione, le risonanze sono strette e ben separate. Le risonanze nella regione dello spettro inscatolata in rosso corrispondono ai residui fosforilati.Dopo aver visto questo video si dovrebbe essere in grado di produrre una proteina ricombinante con un'etichettatura facile da selezionare, di purificare questa proteina e di impostare il parametro di base per l'acquisizione dei dati dello spettro. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in due settimane se è organizzato correttamente. Non dimenticare che la spettroscopia NMR utilizza magneti molto potenti che non devono essere avvicinati con oggetti metallici.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che queste altre proteine sono sensibili alla lisi della proteasi e che è necessario prendere una serie di precauzioni per evitare la degradazione del campione. Seguendo questa procedura, altri metodi come la risonanza magnetica nucleare allo stato solido possono essere applicati per studiare gli aggregati simili all'amiloide che sono spesso formati da proteine disordinate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia chimica per esplorare composti attivi con potenziale serapatico in sistemi modello in vitro.

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Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare per identificare fosforilazioni multiple nelle proteine

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Strutture di assiemi di proteina supramolecolari a risoluzione atomica sono di grande rilevanza a causa della loro un ruolo cruciale in una varietà di fenomeni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire studi strutturali ad alta risoluzione su assiemi di proteina insolubile e non cristallini macromolecolari di magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR MAS).

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Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

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Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per lidentificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine (Video) | JoVE Journal

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

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