Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di identificare la fosforilazione multipla di una proteina intrinsecamente disordinata mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare utilizzando la proteina tau come caso di studio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella regolazione molecolare legate alla malattia, come l'impatto della fosforilazione sull'interazione della proteina con il suo partner molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo identificare la fosforilazione sito-specifica in una proteina disordinata e collegarla a cambiamenti strutturali e funzionali.

Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sulla funzione. Può anche essere applicato ad altre proteine come i resti disordinati della proteina DNA del virus aPtc Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia mediante lo sviluppo di proteine, inibitori dell'interazione proteica. Questo metodo sarà dimostrato da Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa e Hamida Merzougui, i dottorandi del nostro gruppo.

Per iniziare, mescola delicatamente 50 microlitri di cellule BL21 competenti con 100 nanogrammi di DNA plasmidico, formando da 10 a 15 milioni di colonie per microgrammo di DNA plasmatico in una provetta di plastica da 1,5 millilitri. Dopo aver messo la miscela di celle sul ghiaccio per 30 minuti, riscaldarla per 10 secondi a 42 gradi Celsius. Quindi rimettere il tubo in ghiaccio per cinque minuti prima di aggiungere un millilitro di Luria Bertani a temperatura ambiente o LB medium.

Incubare la sospensione batterica a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando delicatamente. Utilizzando uno spreader, distribuire uniformemente 100 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar di terreno LB contenente 100 microgrammi per millilitro di antibiotico ampicillina. Incubare la piastra di selezione per 15 ore a 37 gradi Celsius.

Successivamente, solubilizzare 300 milligrammi di terreno arricchito con azoto 15 e carbonio 13, un grammo di cloruro di ammonio azoto 15 e due grammi di glucosio marcato con carbonio 13 in 10 millilitri di terreno M9. Filtro: sterilizzare la soluzione isotopica direttamente nel mezzo M9 utilizzando un filtro da 0,2 micron. Utilizzando una pipetta pasteur, sospendere una colonia di batteri trasformati nel plasma ricombinante dalla piastra di selezione in 20 millilitri di terreno LB, integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Incubare il terreno inoculato a 37 gradi Celsius per circa sei ore. Misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600 utilizzando un millilitro di una diluizione di dieci volte della coltura batterica in una cuvetta spettrometrica in plastica. Quindi, aggiungere 20 millilitri di coltura LB satura a un litro di terreno di crescita M9 integrato con ampicillina in un pallone di coltura sconcertato in vetro Erlenmeyer da due litri.

Posizionare il pallone di coltura in un incubatore programmabile impostato a 10 gradi Celsius e 50 giri/min. Programmare l'incubatrice in modo che passi a 200 giri/min e 37 gradi Celsius la mattina presto del giorno successivo. Misurare l'OD600 su un millilitro di coltura batterica in una cuvetta spettrometrica in plastica.

Aggiungere 400 microlitri di una soluzione madre di IPTG molare quando l'OD600 raggiunge un valore di circa 1,0 per indurre l'espressione della proteina tau ricombinante. Dopo aver incubato le cellule batteriche a 37 gradi Celsius per altre tre ore, raccoglierle mediante centrifugazione a 5.000 volte g per 20 minuti. Scongelare il pellet di cellule batteriche e ri-sospenderlo accuratamente in 45 millilitri di tampone a scambio cationico A, appena integrato con 1x cocktail di inibitori della proteasi DNasel 1.

Distruggere le cellule batteriche utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione a 20.000 PSI, sono necessari da tre a quattro passaggi per distruggere adeguatamente le cellule. Centrifugare le cellule disgregate a 20.000 volte g per 40 minuti per rimuovere il materiale insolubile. Riscaldare l'estratto di cellule batteriche per 15 minuti a 75 gradi Celsius utilizzando un bagnomaria.

Dopo pochi minuti si osserverà un precipitato bianco. Quindi, centrifugare l'estratto riscaldato a 15.000 volte g per 20 minuti e mantenere il surnatante contenente la proteina tau stabile al calore. Successivamente, eseguire la cromatografia a scambio cationico su una resina CEX forte confezionata come colonna a letto da 5 millilitri utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce.

Impostare la portata a 2,5 millilitri al minuto ed equilibrare la colonna in tampone CEX A. Successivamente, caricare l'estratto di tau riscaldato da 60 a 70 millilitri utilizzando una pompa per campioni, raccogliere il flusso per l'analisi per verificare che la proteina tau si leghi in modo efficiente alla resina. Lavare la resina con tampone CEX A fino a quando l'assorbanza a 280 nanometri non torna al valore basale.

Programmare l'FPLC con un gradiente fino al 25% di tampone CEX B in 10 volumi di colonna per raggiungere 250 millimolari di cloruro di sodio. Seguire con il tampone CEX B al 50% in cinque volumi di colonna per raggiungere i 500 millimolari di cloruro di sodio. Infine, aumentare il gradiente al 100% del tampone CEX B in due volumi di colonna per raggiungere un molare di cloruro di sodio.

Raccogliere frazioni di 1,5 millilitri durante le fasi di eluizione. Quindi, eseguire uno scambio di buffer sulla tau contenente frazioni raggruppate. Equilibrare una colonna di desalinizzazione con un letto impaccato di resina G25 da 53 millilitri in tampone bicarbonato di ammonio da 15 millimolari utilizzando un sistema FPLC.

Impostare la portata a cinque millilitri al minuto e iniettare il campione di tau sulla colonna tramite un circuito di iniezione da cinque millilitri. Raccogliere le frazioni corrispondenti al picco di assorbimento a 280 nanometri. Raggruppare tutte le frazioni tau prima di allocare il campione nelle provette.

Scegliere questi tubi in modo che il volume della soluzione sia piccolo rispetto al volume del tubo. Quindi, praticare dei fori nei tappi delle provette utilizzando un ago prima di congelare i campioni di tau a meno 80 gradi Celsius per la successiva liofilizzazione. Solubilizzare quattro milligrammi di tau fosforilata arricchita con azoto 15 e carbonio 13 in 400 microlitri di tampone NMR.

Aggiungere il cinque percento di ossido di deuterio per il blocco di campo dello spettrometro NMR e un millimolare TMSP come riferimento del segnale NMR interno. Inoltre, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre da 40 EK di un cocktail completo di inibitori della proteasi. Trasferire il campione in una provetta NMR da cinque millilitri utilizzando una siringa elettronica con ago lungo o utilizzando una pipetta pasteur.

Chiudere il tubo NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra lo stantuffo e il liquido muovendo lo stantuffo. Posizionare il tubo NMR in uno spinner.

Utilizzare il manometro appropriato per regolare la sua posizione verticale nella rotatrice in modo tale che la maggior parte della soluzione del campione si trovi all'interno della bobina NMR. Quindi, avviare il flusso d'aria nello strumento NMR facendo clic su lift nella finestra Magnet Control System. Posizionare con cautela l'ogiva con il tubo nel flusso d'aria nella parte superiore del foro del magnete.

Quindi arrestare il flusso d'aria e lasciare che il tubo scenda in posizione all'interno della testa della sonda all'interno del magnete. Dopo aver lasciato che il campione si equilibrasse a 25 gradi Celsius, digitare ATMM nella riga di comando per eseguire la regolazione e l'abbinamento semiautomatici della testa della sonda per ottimizzare la trasmissione di potenza. Quindi fare clic su Blocca nella finestra Sistema di controllo del magnete per attivare il blocco della frequenza di campo dello spettrometro.

Avviare la procedura di shimming per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione digitando prima TopShim GUI sulla riga di comando per aprire la finestra dello shim. Quindi fare clic su Avvia nella finestra dello shim. Controllare la deviazione standard B0 residua per verificare che gli spessori siano ottimali.

Quindi, calibrare il parametro P1, che è la lunghezza di un impulso a radiofrequenza protonica in microsecondi. Questo parametro è necessario per ottenere una rotazione di 90 gradi della magnetizzazione dello spin del protone. Punta all'impulso a 360 gradi utilizzando uno spettro unidimensionale di protoni d'acqua.

Regolare l'offset di frequenza impostando il parametro O1 sulla frequenza dell'acqua protonica nello spettro unidimensionale. Infine, inizia l'acquisizione dello spettro protonico unidimensionale digitando ZG nella riga di comando. Un risultato rappresentativo della purificazione della tau ricombinante mostra un picco di assorbimento maggiore a 280 nanometri osservato durante il gradiente di eluizione.

Questo picco corrisponde alla proteina tau purificata, come si vede sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Il cromatogramma per la desalinizzazione della tau purificata ricombinante mostra che il picco di assorbimento a 280 nanometri e il picco di conducibilità sono ben separati, garantendo che la desalinizzazione della proteina sia efficiente per la fase di liofilizzazione. Lo spettro NMR unidimensionale dell'azoto 15 tau ricombinante a 900 megahertz conferma che è possibile rilevare un segnale NMR dal campione proteico.

Un buon rapporto segnale/rumore indica che i parametri di acquisizione di base sono stati impostati correttamente. Lo spettro bidimensionale della proteina fosforilata mostra una buona risoluzione, le risonanze sono strette e ben separate. Le risonanze nella regione dello spettro inscatolata in rosso corrispondono ai residui fosforilati.

Dopo aver visto questo video si dovrebbe essere in grado di produrre una proteina ricombinante con un'etichettatura facile da selezionare, di purificare questa proteina e di impostare il parametro di base per l'acquisizione dei dati dello spettro. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in due settimane se è organizzato correttamente. Non dimenticare che la spettroscopia NMR utilizza magneti molto potenti che non devono essere avvicinati con oggetti metallici.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che queste altre proteine sono sensibili alla lisi della proteasi e che è necessario prendere una serie di precauzioni per evitare la degradazione del campione. Seguendo questa procedura, altri metodi come la risonanza magnetica nucleare allo stato solido possono essere applicati per studiare gli aggregati simili all'amiloide che sono spesso formati da proteine disordinate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia chimica per esplorare composti attivi con potenziale serapatico in sistemi modello in vitro.