Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish ( Danio Rerio)

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il comportamento maligno e invasivo delle cellule tumorali in un modello di embrione di zebrafish. Questo metodo aiuta i ricercatori a determinare se le cellule tumorali possono invadere da un sistema circolatorio funzionale, modellando così un passaggio chiave nella cascata metastatica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello di embrione di zebrafish fornisce questa valutazione e tempi di risposta più brevi rispetto a esperimenti simili spesso condotti nei topi.

A dimostrare la procedura sarà il dottor Eric Glasgow, che gestisce la struttura centrale del pesce zebra presso la Georgetown University. Dopo aver preparato le cellule tumorali, i reagenti e gli embrioni di zebrafish secondo il protocollo di testo, collegare il sistema di erogazione della microiniezione a una fonte d'aria pressurizzata e accendere la fonte di alimentazione. Testare la pressione premendo il pedale.

Un breve impulso d'aria dovrebbe essere emesso dal portaaghi. Aggiungere 20 millilitri di soluzione di tricaina 2X a una piastra per iniezione e posizionare la piastra su uno shaker per equilibrarla. Quindi ripetere l'equilibratura con una seconda aliquota di Tricaina 2X.

Quindi, usa una pipetta di plastica per trasferire un gruppo di embrioni in un piccolo piatto, contenente una soluzione di tricaina 2X. Utilizzando una punta di caricamento in gel, riempire l'ago per microiniezione con cellule tumorali. Posizionare l'ago in un barattolo per la conservazione degli elettrodi con l'estremità appuntita rivolta verso il basso in modo che le cellule si depositino vicino alla punta.

Trasferisci da 20 a 30 embrioni anestetizzati su una piastra per iniezione raccogliendo embrioni con abbondante tricaina 2X in una pipetta di plastica. Lasciare che gli embrioni si depositino sulla punta della pipetta, quindi espellere delicatamente gli embrioni nella depressione della piastra di iniezione, distribuendo gli embrioni lungo la lunghezza della vasca. Allinea gli embrioni con le teste rivolte verso l'alto e la pancia rivolta verso la parete ripida della depressione.

Fissare l'ago al supporto dell'ago del micromanipolatore. Quindi, posizionare la piastra di iniezione sotto lo stereoscopio con la parete di 60 gradi a sinistra e concentrarsi sull'embrione superiore con un ingrandimento di 25X. Posizionare il micromanipolatore in modo che, una volta esteso, l'ago perfori l'embrione.

Quindi estendere l'ago a occhio fino a toccare quasi l'embrione. Ora, guardando al microscopio, allinea l'ago contro l'embrione. Per iniettare le cellule, perforare la depressione dell'embrione attraverso il sacco vitellino.

Premere il pedale, posizionando la punta proprio in corrispondenza del seno precardiaco, ma non all'interno. La forza dell'iniezione espellerà le cellule nel seno cardiaco. In alternativa, l'iniezione di cellule nel sacco vitellino consente lo studio di diversi aspetti dell'invasione vascolare come descritto nel manoscritto.

Usando la mano destra, estendere e ritrarre l'ago per iniezione. Con la mano sinistra, effettuare regolazioni fini per posizionare l'embrione successivo. Quando l'intera piastra è stata iniettata, rimettere l'ago nel contenitore per elettrodi.

Per trasferire gli embrioni nella piastra di recupero, inclinare la piastra di iniezione per estrarre gli embrioni dal fondo, lavando gli embrioni dalla mangiatoia e utilizzando la pipetta di plastica per raccoglierli. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo della pipetta, quindi trasferire gli embrioni nella capsula di recupero in una quantità minima di tricaina. Incubare la capsula di recupero a 28 gradi Celsius per un'ora, prima di separare gli embrioni vitali dagli embrioni morti e dai detriti.

Incubare il piatto a 33 gradi Celsius fino al momento di segnare. Dopo aver anestetizzato un lotto di embrioni da valutare, secondo il protocollo di testo, posizionare una larva anestetizzata su un vetrino da microscopio a depressione in una goccia di Tricaina. Orientare le larve lateralmente per ottenere un imaging ottimale della regione caudale.

Posizionare il vetrino su un microscopio a fluorescenza composto con un obiettivo 10X. Valuta le larve contando il numero di cellule tumorali che sono uscite con successo dal sistema vascolare concentrandosi su e giù attraverso la regione della coda per distinguere chiaramente le cellule intatte. Sciogliere la soluzione di tricaina all'1,5% di agarosio e portarla a 37 gradi Celsius.

Dopo aver anestetizzato gli embrioni come prima, trasferire un embrione in una goccia di soluzione di tricaina sulla superficie di imaging. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione di tricaina in eccesso che trattiene l'embrione sulla superficie di imaging. Quindi sovrapporre una goccia di soluzione di agarosio fusa sull'embrione.

Lavorando rapidamente, prima che l'agarosio polimerizzi utilizzare uno strumento delicato come uno spazzolino per ciglia per orientare l'embrione lateralmente per l'imaging, prestando particolare attenzione per garantire che l'embrione sia appiattito lungo la superficie dell'imaging. Quando la goccia di agarosio si è polimerizzata, immergerla in una soluzione di Tricaina. Infine, sottoporre l'embrione vivo di pesce zebra all'imaging microscopico.

Delle sette linee cellulari di cancro al seno testate per la loro capacità invasiva vascolare negli embrioni di zebrafish, la linea cellulare MDA-MB-231 ha mostrato il maggior numero di cellule tumorali stravasate per embrione quando valutata, 96 ore dopo l'iniezione. È stato anche osservato che le cellule BT-474 invadono facilmente la regione caudale degli embrioni, mentre altre linee cellulari come le cellule MCF-7, SK-BR-3 e T-47D sono minimamente invasive. In un test modificato che utilizza un sito di iniezione diverso, è stato condotto un esperimento di competizione in cui due popolazioni di cellule MDA-MB-231, che differiscono nella loro capacità invasiva vascolare, sono state iniettate simultaneamente nel sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo.

Dopo il punteggio, è stato determinato che le cellule MDA-MB-231 propagate in condizioni di coltura confluente prima dell'iniezione, mostravano una riduzione dell'intravasazione in circolo e, quindi, avevano una presenza ridotta nella regione caudale degli embrioni. Una volta padroneggiate, le iniezioni di embrioni di zebrafish possono essere eseguite in quattro ore se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare criteri rigorosi e coerenti quando si valuta lo stravaso delle cellule tumorali.

Seguendo questa procedura, i risultati possono essere ulteriormente convalidati in un modello murino. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le iniezioni e segnare lo stravaso, permettendoti di testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali negli embrioni di zebrafish.