Name: Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish ( Danio Rerio) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Scopri come valutare l'invasività vascolare delle cellule tumorali in embrioni di Danio rerio mediante microiniezione e microscopia a fluorescenza. Questo metodo accelera la ricerca sulle metastasi.

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Ringraziamo Peter Johnson del Nucleo di Microscopia dell'Università di Georgetown per l'assistenza nell'imaging degli embrioni di pesce zebra. La risorsa condivisa per la microscopia e l'imaging e la risorsa condivisa per il pesce zebra sono parzialmente supportate dalla sovvenzione NIH/NCI P30-CA051008. Questo lavoro è stato sostenuto anche da NIH/NCI CA71508 (AW) e CA177466 (AW).

Etica Dichiarazione: zebrafish embrioni sono stati generati secondo un protocollo IACUC approvato. Questi esperimenti sono stati effettuati in conformità con le raccomandazioni del comitato di cura degli animali e Usa Georgetown University. 1. Organizzare embrioni per iniezione e creare soluzioni di riserva <ol><li> Generare requisito larve di zebrafish per valutare invasione vascolare delle cellule tumorali. <ol><li> Impostare coppia-saggio o di un gruppo in croce accoppiamento con Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; B140 ednrb1 pesce. NOTA: Abbiamo generato Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; ednrb1 B140 zebrafish, attraversando Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, che esprimono barriera verde proteina fluorescente corallo nelle cellule endoteliali, con una linea che manca di cellule pigmentate, mitfa B692, B140 ednrb1, sviluppato presso il Centro risorse Zebrafish International. </li><li> couova llect, pulita, e rimuovere gli embrioni non fecondate o deformate il giorno successivo 22. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° C fino al momento per l&#39;iniezione di cellule tumorali, che si verificano quando gli embrioni di zebrafish sono 2 giorni dopo la fecondazione (2 DPF). </li></ol></li><li> Fare piastre di iniezione. <ol><li> Fate sciogliere 25 ml di 1,5% agarosio in DH 2 O per ogni piatto. </li><li> Versare 12 ml di agarosio in un x 15 mm piastra di Petri 100 mm e lasciarlo indurire. </li><li> Re-melt quindi versare i restanti agarosio nella piastra. </li><li> posizionare immediatamente uno stampo di vetro tagliate (3 mm x 7,2 cm di lunghezza di larghezza x 7,5 cm) in modo che sia a un angolo di 30 gradi rispetto al agarosio e posizionato al centro della piastra. NOTA: Questo creerà una ripida parete di 60 ° e una rampa inclinata di 30 °. </li><li> Nastro lo stampo di vetro al suo posto e lasciare indurire agarosio. </li><li> Rimuovere delicatamente lo stampo di vetro e fare attenzione a non strappare l&#39;agarosio. NOTA: Stampo può essere memorizzato in dH 2 O a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrare piatto iniezione con pesci d&#39;acqua (0,3 g / L di sale marino). <ol><li> Piastra Sciacquare due volte con acqua distillata. </li><li> Equilibrare plate aggiungendo 10 ml di acqua pesci alla piastra e posto su agitatore per 10 min. </li><li> Equilibrare piatto una seconda volta con acqua i pesci. </li></ol></li><li> Split post-fecondazione (DPF) di embrioni di 2 giorni in gruppi di iniezione trasferendoli in piatti a base di pesce contenenti acqua 22. </li><li> Preparare i piatti di recupero per ogni gruppo di utilizzare dopo l&#39;iniezione. Assicurarsi che il piatto di recupero contiene acqua 10 ml di pesce, più penicillina (25 mcg / ml) e streptomicina (50 mg / ml). </li><li> Preparare la soluzione tricaine 2x con l&#39;aggiunta di 4 ml di tricaine tamponata magazzino (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) a 50 ml di acqua i pesci più penicillina e la streptomicina. </li><li> Disciogliere 15 mg a basso punto di fusione agarosio in 10 ml di soluzione tricaine 2x per generare un mezzo di montaggio anestetico che immobilizza embrioni vivi per imaging. NOTA: Mezzo di montaggio consiste di 1,5% agarosio. </li><li> Tirare aghi microiniezione. <ol><li> Mettere in vetro tubo capillare in un estrattore pipetta verticale. Tirare le pipette lungo conici con 20 corrente mAmp e un elemento riscaldante 2-coil. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule Etichettatura cancro con lipofila colorante fluorescente <ol><li> Mantenere le cellule tumorali nelle loro condizioni di coltura raccomandati. NOTA: Queste linee sono state mantenute in DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, e SK-BR-3. Queste linee sono state mantenute in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 T-47D. Tutte le linee cellulari sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2 durante l&#39;incubazione. </li><li> Generare una cella singola sospensione dissociandosi una cultura aderente di cellule tumorali. <ol><li> Lavare le cellule prima con PBS e poi trattare con soluzione di tripsina-EDTA 0,05%. NOTA: tempo di esposizione Tripsina dipenderà dalla linea cellulare. </li><li> Neutralizzare la soluzione tripsina con sérum contenenti terreni di coltura cellulare dopo che le cellule si staccano. </li></ol></li><li> Centrifugare la sospensione cellulare tripsina-neutralizzato per 5 minuti a 200 xg, quindi risospendere il pellet cellulare in mezzi di coltura fresco per il conteggio delle cellule. </li><li> Conta la sospensione cellulare utilizzando un contatore automatico e preparare 1 milione di cellule in 200 ml di mezzi di coltura cellulare. <ol><li> Verificare la vitalità delle cellule con trypan colorante esclusione blu prima iniezione in embrioni di zebrafish. NOTA: le popolazioni di cellule vitali solo devono essere iniettate in embrioni di zebrafish, come l&#39;iniezione di cellule morte non rifletterà vera invasione vascolare. </li></ol></li><li> Aggiungere 2 ml di colorante lipofile rosso alla sospensione cellulare di cancro per una diluizione 1: 100, mescolare bene, e poi incubare la miscela a 37 ° C per 20 min. NOTA: Concentrazione del tempo tintura e etichettatura può essere necessario ottimizzate per ciascuna linea cellulare. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 1 ml di mezzi freschi al tubo e centrifugare per 5 min a200 x g. </li><li> Lavare via colorante fluorescente residuo dalle cellule tumorali. <ol><li> Aspirare il supernatante dal pellet cellulare, risospendere il pellet in 1 ml di terreni di coltura fresco, e centrifugare per 5 min a 200 x g. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio una seconda volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio terza volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g. </li></ol></li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare contenente 1 milione di cellule tumorali marcate in 500 ml di mezzi freschi. NOTA: 0,5 mM EDTA può essere aggiunto ai media per evitare grumi cellule. </li></ol> 3. Cellule Iniettare tumorali nel seno pre-cardiaca di embrioni di zebrafish <ol><li> Collegare il sistema di erogazione microiniezione a una fonte di aria compressa e accendere °e microiniezione fonte di alimentazione del sistema di erogazione. <ol><li> Pressione di prova premendo il pedale. Un breve impulso di aria dovrebbe emettere dalla porta-aghi. </li></ol></li><li> Equilibrare le piastre iniezione due volte con la soluzione 2x tricaine. <ol><li> Per ogni fase di equilibrio, aggiungere 20 ml di soluzione tricaine 2x alla piastra di iniezione e posto su agitatore per 10 minuti. </li></ol></li><li> Utilizzare pipetta di plastica per trasferire un gruppo di embrioni ad un piccolo recipiente contenente la soluzione 2x tricaine. </li><li> Backfill l&#39;ago dell&#39;iniezione microiniezione con le cellule tumorali utilizzando una punta della pipetta di gel-caricamento. <ol><li> Posizionare l&#39;ago in un vaso di stoccaggio elettrodo con l&#39;estremità appuntita rivolta verso il basso in modo da cellule stabilirsi vicino alla punta. </li></ol></li><li> Trasferimento 20 - 30 embrioni anestetizzati ad una piastra di iniezione attraverso la raccolta degli embrioni con abbondanza di 2x tricaine in una pipetta di plastica. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lasciare embrioni di stabilirsi nella punta della pipetta. </li><li> gentiluomoly espellere embrioni nella vaschetta della piastra di iniezione, diffondendo gli embrioni lungo la lunghezza della vasca. </li><li> Allineare gli embrioni con le teste verso l&#39;alto e pance di fronte alla ripida parete della vasca. NOTA: soluzione Tricaine dovrebbe coprire sia la lunghezza trogolo e la superficie agarosio piatta, con embrioni risiede solo nel trogolo. Gli embrioni sono ora pronti per l&#39;iniezione. </li></ol></li><li> Iniettare 50 - 100 cellule tumorali (2-5 NL) nel seno precardiac degli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema di erogazione microiniezione. <ol><li> Attaccare l&#39;ago al titolare ago di una micromanipolatore. </li><li> Posizionare la piastra iniezione sotto lo stereoscopio con la parete 60 gradi a sinistra e mettere a fuoco l&#39;embrione superiore a 25x. </li><li> Posizionare il micromanipolatore in modo tale che, se aperto, l&#39;ago trafiggerà l&#39;embrione. </li><li> Estendere l&#39;ago a occhio fino a quando non è quasi a contatto con l&#39;embrione. </li><li> Guardando al microscopio, allineare l&#39;ago in modo tcappello che trafiggerà l&#39;embrione su ulteriore estensione. </li><li> Pierce l&#39;embrione attraverso il sacco vitellino posizionando la punta appena a, ma non in, il seno pre-cardiaca. </li><li> Iniettare cellule premendo il pedale. La forza di iniezione espelle le cellule nel seno cardiaca. Ritrarre l&#39;ago. </li><li> Usando la mano destra, estendere e ritrarre l&#39;ago di iniezione. Con la mano sinistra, effettuare regolazioni di precisione per posizionare successivo dell&#39;embrione. </li><li> Ritorna l&#39;ago al barattolo di stoccaggio degli elettrodi durante l&#39;impostazione di iniettare un altro piatto. </li></ol></li><li> Trasferire gli embrioni al piatto recupero una volta che l&#39;intera piastra viene iniettato. <ol><li> La piastra di iniezione per unire gli embrioni in basso, lavando le rimanenti embrioni fuori del canale, e della raccolta con la pipetta di plastica. </li><li> Lasciare gli embrioni di depositarsi sul fondo della pipetta. </li><li> Trasferire gli embrioni al piatto di recupero in un volume minimo di tricaine. </li></ol></li><li> incubaTE recupero piatto a 28 ° C per 1 ora. <ol><li> Separare zebrafish embrioni vitali da embrioni morti e altri detriti. </li></ol></li><li> Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-96 ore. NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish. </li></ol> 4. Punteggio stravaso <ol><li> Anestetizzare la partita di embrioni per essere segnata mettendoli in un piatto con la soluzione tricaine. </li><li> Inserire un larve anestetizzato su un vetrino da microscopio depressione in una goccia di tricaine. <ol><li> larve Orient lateralmente per l&#39;imaging ottimale della regione caudale. </li></ol></li><li> Contare il numero di cellule tumorali che hanno invaso successo della vascolarizzazione concentrandosi su e giù attraverso la regione di coda di discernere chiaramente cellule intatte. NOTA: E &#39;meglio avere almeno due persone coinvolte in til suo processo, in cui l&#39;individuo segnando il pesce è cieco alla condizione sperimentale in corso di valutazione. <ol><li> Punteggio larve su un microscopio a fluorescenza mescola con la lente dell&#39;obiettivo 10x. Utilizzare l&#39;obiettivo 20x per le chiamate difficili. </li></ol></li></ol> 5. Embrioni di montaggio su vetrini e la successiva imaging di fluorescenza <ol><li> Sciogliere 1,5% soluzione di agarosio / tricaine e portare a 37 ° C. </li><li> Anestetizzare l&#39;embrione di essere ripreso ponendolo in soluzione tricaine. </li><li> Trasferire l&#39;embrione in una goccia di soluzione tricaine alla superficie di formazione dell&#39;immagine. Opzionalmente usare un piatto o vetrino da microscopio con fondo di vetro. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione in eccesso tricaine, mantenendo l&#39;embrione sulla superficie di formazione dell&#39;immagine. </li><li> Sovrapponi una goccia di soluzione di agarosio fuso sopra l&#39;embrione. </li><li> Rapidamente, prima che l&#39;agarosio polimerizza, utilizzare uno strumento delicato, come un pennello ciglia, per orientare l&#39;embrione lateralmente per l&#39;imaging, dando particolare attenzioneper assicurare l&#39;embrione viene appiattito lungo la superficie di formazione dell&#39;immagine. </li><li> Immergere la goccia di agarosio ora polimerizzato sotto soluzione tricaine. </li><li> Sottoporre il zebrafish vivo per l&#39;imaging microscopico. </li></ol> 6. Modifica: iniezione di cellule tumorali nel tuorlo Sac di embrioni di zebrafish <ol><li> Preparare il sistema e di iniezione piastre microiniezione di erogazione come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo. </li><li> Etichettare due popolazioni di cellule con contrasto coloranti fluorescenti come precedentemente descritto nel paragrafo (2) del presente protocollo. </li><li> Iniettare 5 - 10 nl di 2 x 10 ^ 7 cellule / ml nel sacco vitellino. Mantenere il costante volume di iniezione per iniettare il numero di cellule identiche (100 - 200 le cellule tumorali) da ciascuna popolazione cellulare NOTA: Si può utilizzare embrioni di zebrafish trasparente privi vascolare fluorescente per questo test. ingresso passivo di particelle nel sistema vascolare può essere controllato per iniettando perline fluorescenti (&lt;10 micron) o, alternativamente, una linea cellulare che non intravsate. </li><li> Recuperare gli embrioni iniettati come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo e quindi lo screening per le iniezioni di successo. <ol><li> Utilizzare uno stereoscopio per lo screening e trasferire gli embrioni vitali che sono stati iniettati con successo ad un nuovo piatto. NOTA: tutti gli embrioni devono avere una massa di dimensioni sempre di cellule situate nel tuorlo. Gli embrioni vengono scartati se la dimensione di massa è diversa o se le cellule si trovano al di fuori del tuorlo. </li><li> Trasferire gli embrioni vitali per un nuovo piatto se le cellule tumorali si vedono chiaramente nel sacco vitellino. </li></ol></li><li> Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-48 ore. NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish. </li><li> A segnare intravasation, seguire le linee guida descritte nel paragrafo (4) del presente protocollo, ma invece contare il numero di ccellule ancer che hanno invaso con successo nel sistema vascolare della regione caudale. </li></ol>

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<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , Epub ahead of print (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questa tecnica utilizza il modello zebrafish per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali (vedi Figura 1). Qui abbiamo applicato la tecnica ad un pannello di linee cellulari di cancro al seno, al fine di fornire una base su cui altri ricercatori possono costruire i propri studi (vedi Tabella 1; figure 2 - 3). L&#39;osservazione che MDA-MB-231 cellule prontamente hanno invaso nella regione caudale embrioni di zebrafish renderebbe questa...

La malattia metastatica è una delle principali cause di mortalità per cancro e molti meccanismi che consentono la diffusione delle cellule tumorali rimangono da scoprire 1. Al fine di una cellula tumorale a metastatizzare con successo, deve prima di invadere attraverso lo stroma che circonda un tumore primario, entra (intravasate) nel sistema circolatorio, sopravvivere in transito, uscita (stravaso) dalla circolazione, e, infine, stabilire una colonia vitale presso il sito organo lontana 2. Intravasation e stravaso sono quindi una tappa fondamentale verso la cascata metastatica, eppure ogni cellula tumorale non è intrinsecamente abili a interrompere e la migrazione attraverso giunzioni endoteliali 3. In realtà, ci sono una serie di pressioni selettive uniche che circondano invasione vascolare delle cellule tumorali e il processo può essere ulteriormente influenzata da una varietà di fattori endogeni ed esogeni 4. Per queste ragioni, le tecniche che analizzano il comportamento aggressivo di cancro in fase avanzata spesso si concentrano su vascular capacità invasiva come un mezzo per prevedere diffusione metastatica. Vari sistemi modello esistono per facilitare lo studio di invasione vascolare delle cellule tumorali in vitro. Il più utilizzato in vitro coinvolgono sia sistemi transwell per valutare la migrazione delle cellule tumorali attraverso una tecnologia elettrica Cell-substrato impedenza di rivelazione (ECIS) barriera endoteliale 5 o per monitorare l&#39;interruzione in tempo reale di un monostrato endoteliale intatto dalle cellule tumorali 6. Questi test in genere non hanno la dinamica dei fluidi e fattori stromali che altrimenti un impatto attaccamento delle cellule tumorali ad una parete endoteliale. Questo problema è in qualche modo aggirato da reti vascolari perfusable che nascono dalla cultura 3D di endoteli con il supporto di cellule stromali, e questi sistemi microfluidici 3D ora rappresentano la prima linea di corrente in vitro opzioni 7,8. Tuttavia, questi approcci omettono microambiente robusta di un sistema circolatorio funzionantee quindi solo in parte sostituto per modelli in vivo. Il più utilizzato nel modello vivo di invasione vascolare è il mouse, in cui saggi metastasi sperimentali sono comunemente eseguiti perché si verificano in tempi relativamente brevi e sono generalmente indicativi di capacità metastatica 9. Questi test comportano l&#39;iniezione diretta delle cellule tumorali in circolazione e quindi modellare le fasi finali della metastasi, cioè stravaso e delle cellule del cancro della colonizzazione degli organi. I saggi metastasi sperimentali variano a seconda del sito di iniezione delle cellule tumorali e gli organi infine analizzati. Nel primo tipo di saggio, cellule tumorali vengono iniettate nella vena della coda di topi e semina delle cellule del cancro ai polmoni è monitorata 10,11. Il secondo saggio comprende l&#39;esecuzione di iniezioni intracardiaci per dirigere semina metastatico verso il microambiente del midollo 12-14, ma anche il cervello 15. Nel terzo test, il cancro cells vengono iniettati milza per permettere la colonizzazione del fegato 16 mentre il quarto percorso di consegna nella carotide trasporta cellule tumorali al cervello 17,18. Indipendentemente dal metodo di consegna delle cellule tumorali, la colonizzazione organo è il punto finale sperimentale accettato e viene generalmente determinato tramite luminescenza, istologia, o tecniche di PCR-based. Nonostante i vantaggi fisiologici di condurre test di metastasi sperimentali all&#39;interno di un host murino, questi esperimenti richiedono ancora settimane o mesi per completare e analizzare. Il modello di zebrafish (Danio rerio) ha recentemente emerso come un nuovo sistema per studiare la progressione del cancro 19,20, e permette per la valutazione di invasione vascolare delle cellule tumorali all&#39;interno di un sistema circolatorio funzionale su un arco di tempo molto più breve se confrontato con i topi 21-24. Il metodo utilizza un ceppo zebrafish trasparente che ha la sua endoteli etichettato con una barriera verde fluo corallinagiornalista proteine fluore- guidato dal promotore kdrl, il recettore zebrafish per endoteliali fattore di crescita vascolare 25. Nel saggio, le cellule tumorali sono etichettati con un marcatore fluorescente rosso e iniettato nel seno precardiac di 2 giorni embrioni. Ovunque tra 48 a 96 ore dopo l&#39;iniezione, le cellule tumorali che hanno invaso fuori del sistema vascolare e nella regione caudale embrioni possono essere lanciati in modo efficiente su un microscopio a fluorescenza. Qui si applica la tecnica di un panel di linee di cellule umane di cancro al seno comunemente usati per dimostrare forti differenze nella loro capacità invasiva vascolare. Inoltre, abbiamo dimostrato che cambiare il sito di iniezione al sacco embrionale tuorlo permette per lo studio delle interazioni cellulari eterogenee, come le popolazioni di cellule del cancro possono essere etichettati con differenziale coloranti fluorescenti e iniettate in embrioni di zebrafish prive di vascolarizzazione fluorescente. In quest&#39;ultimo test, le cellule tumorali che hanno invaso il tuorlo e intravasated nella vasculature sono segnato nella regione caudale 24-48 ore dopo l&#39;iniezione. A causa l&#39;efficacia e la convenienza di questo modello, zebrafish sono sempre più impiegati per testare rapidamente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali in un ambiente fisiologico.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 100 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pastur monouso da 5 3/4", vetro borosilicato</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 60 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, basso punto di fusione</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, Grado Molecolare Bioline</td><td></td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Vetro capillare, Standard, 1,2 mm x 0,68 mm, 4"</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Estrattore per pipette verticale</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo per elettrodi, 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale (Tricaina, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Pennello per ciglia</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, inattivato a caldo</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipette di trasferimento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caricamento Punte</td> <td>per pipetteFisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro (12,0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino a depressione in vetro</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Sale oceanico istantaneo, sale marino</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Bulbi di gomma in lattice, 2 ml, confezione da 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-G Potassio</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>. </td><td></td>FB0875713</tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&nbsp;</td>Risorse <td></td><td></td><td>condivise di Georgetown Zebrafish</td></tr><tr><td>Le linee cellulari sono state mantenute in DMEM + 10% FBS, con l'aspettativa di celle BT-474 e HCC18-6, che sono state mantenute in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in zebrafish (<em&gt; danio rerio</em&gt;)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

L'invasione e lo stravaso delle cellule tumorali sono un segno distintivo della progressione metastatica. I modelli tradizionali in vitro di invasione delle cellule tumorali degli endoteli in genere mancano della fluidodinamica a cui le cellule invasori sono altrimenti esposte in vivo. Tuttavia, i sistemi in vivo come i modelli murini, sebbene più rilevanti dal punto di vista fisiologico, richiedono tempi sperimentali più lunghi e presentano sfide uniche associate al monitoraggio e all'analisi dei dati. Qui descriviamo un saggio del pesce zebra che cerca di colmare questa lacuna tecnica consentendo la valutazione rapida dell'invasione vascolare e dello stravaso delle cellule tumorali. L'approccio prevede l'iniezione di cellule tumorali fluorescenti nel seno precardiaco di embrioni trasparenti di zebrafish di 2 giorni la cui vascolarizzazione è contrassegnata da un reporter fluorescente di contrasto. Dopo l'iniezione, le cellule tumorali devono sopravvivere in circolazione e successivamente stravasare dai vasi nei tessuti nella regione caudale dell'embrione. Le cellule tumorali stravasate vengono identificate in modo efficiente e valutate in embrioni vivi tramite imaging a fluorescenza in un punto temporale fisso. Questa tecnica può essere modificata per studiare l'intravaso e/o la competizione tra una miscela eterogenea di cellule tumorali modificando il sito di iniezione nel sacco vitellino. Insieme, questi metodi possono valutare un comportamento caratteristico delle cellule tumorali e aiutare a scoprire meccanismi indicativi di progressione maligna verso il fenotipo metastatico.

Qui abbiamo testato la capacità invasiva vascolare comunemente utilizzate linee di cellule di cancro al seno in un modello di zebrafish (Figura 1). criteri rigorosi sono stati impiegati nel punteggio stravaso per queste diverse linee cellulari, dove gli eventi positivi sono stati contati solo se le cellule tumorali avevano chiaramente uscito dai vasi, questo essere fatto principalmente per limitare eventuali falsi positivi che potrebbero derivare da segnando detriti cell...

Questo metodo utilizza zebrafish embrioni per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali. le cellule tumorali fluorescenti sono iniettati nel precardiac seno o il sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. invasione vascolare delle cellule tumorali e stravaso è valutata mediante microscopia a fluorescenza della regione di coda 24-96 ore più tardi.

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il comportamento maligno e invasivo delle cellule tumorali in un modello di embrione di zebrafish. Questo metodo aiuta i ricercatori a determinare se le cellule tumorali possono invadere da un sistema circolatorio funzionale, modellando così un passaggio chiave nella cascata metastatica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello di embrione di zebrafish fornisce questa valutazione e tempi di risposta più brevi rispetto a esperimenti simili spesso condotti nei topi.A dimostrare la procedura sarà il dottor Eric Glasgow, che gestisce la struttura centrale del pesce zebra presso la Georgetown University. Dopo aver preparato le cellule tumorali, i reagenti e gli embrioni di zebrafish secondo il protocollo di testo, collegare il sistema di erogazione della microiniezione a una fonte d'aria pressurizzata e accendere la fonte di alimentazione. Testare la pressione premendo il pedale.Un breve impulso d'aria dovrebbe essere emesso dal portaaghi. Aggiungere 20 millilitri di soluzione di tricaina 2X a una piastra per iniezione e posizionare la piastra su uno shaker per equilibrarla. Quindi ripetere l'equilibratura con una sec

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

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Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di cellule di cancro al seno nello spazio perivitellino di embrioni di pesce zebra transgenico. Dopo l'incubazione, visualizziamo l'embrione al microscopio a fluorescenza per osservare l'invasione, la disseminazione e la metastasi delle cellule tumorali.

zPDX-Analisi dell'invasività: studio del comportamento invasivo delle cellule tumorali metastatiche negli xenotrapianti di embrioni di zebrafish

Questo video descrive il test di xenotrapianto di pesce zebra per valutare la formazione del tumore in vivo e studiare l'effetto degli agenti terapeutici.

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Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

Il trapianto di cellule tumorali è un importante strumento per l'identificazione dei meccanismi del cancro e delle risposte terapeutiche. Le tecniche correnti dipendono dagli animali immuno-incompetenti. Qui descriviamo un metodo per il trapianto di cellule tumorali di zebrafish in embrioni immuni-competenti per l'analisi a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e delle risposte in vivo .

Il trapianto di tumori del cervello pediatrico di Zebrafish in ospedali immunitario-competenti per uno studio a lungo termine del comportamento della cellula tumorale e della risposta ai farmaci

Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Descritto qui è un metodo per utilizzare gli embrioni di pesce zebra per studiare la capacità delle nanoparticelle funzionalizzate di colpire le cellule tumorali umane in vivo. Questo metodo consente la valutazione e la selezione di nanoparticelle ottimali per test futuri su animali di grandi dimensioni e in studi clinici.

In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

Previsione rapida della risposta ai farmaci in vivo utilizzando innesti di cellule leucemiche in embrioni di zebrafish

Scopri come valutare l'invasività vascolare delle cellule tumorali in embrioni di Danio rerio mediante microiniezione e microscopia a fluorescenza. Questo metodo accelera la ricerca sulle metastasi.

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (

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