Name: La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Scopri come indurre e fenotipizzare cellule T regolatorie umane FOXP3-positive da cellule CD4 naive in vitro. Questo protocollo riproducibile consente di studiare i meccanismi molecolari della differenziazione delle iTregs.

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Nina Nagel è grata per l'assistenza tecnica durante le riprese video e la preparazione sperimentale. Ringraziamo Eva-Maria Weiss per l'aiuto con il protocollo di colorazione intracellulare FOXP3 e Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle per aver stabilito il protocollo di isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori sono riconosciute per la gestione del laboratorio. 
Finanziamento: A.S. è stato supportato da una borsa di studio intraeuropea Marie Curie nell'ambito del 7° Programma Quadro della Comunità Europea, dalla Fondazione Dr. Åke Olsson e dalle fondazioni di ricerca KI; A.S. e J.T. sono stati supportati da una sovvenzione CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease), J.T. è stato supportato da Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Fondazione Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance e Consiglio della Contea di Stoccolma.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto consente l&#39;induzione robusto di CD4 umana + FOXP3 + iTregs da cellule T CD4 + naive umane. Esso comprende un nuovo protocollo che abbiamo descritto recentemente, utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina, per l&#39;induzione di iTregs con superior funzione in vitro soppressiva 22. Rispetto ad altri protocolli pubblicati, un altro vantaggio è l&#39;induzione di diverse popolazioni iTreg in parallelo da diversi protocolli, che consente il confronto ...

Cellule T regolatorie CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) sopprimere le altre cellule del sistema immunitario e sono mediatori critici di tolleranza periferica, impedendo autoimmunità ed eccessiva infiammazione 1. L&#39;importanza di Tregs è esemplificata dalla malattia umana sindrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia legata all&#39;X (IPEX), in cui la perdita di Tregs a causa di mutazioni nel master&#39; Treg fattore di trascrizione forkhead box P3 `(FOXP3) porta ad una grave malattia autoimmune sistemica, letale in tenera età. Tuttavia, Tregs agire come una spada a doppio taglio nel sistema immunitario in quanto possono anche ostacolare l&#39;immunità anti-tumorale in alcune impostazioni 2. manipolazione terapeutica del numero e della funzione Treg è quindi soggetto a numerose indagini cliniche. Nel cancro, l&#39;esaurimento delle Tregs può essere desiderabile e un certo successo degli approcci clinici incoraggia ulteriori ricerche 3. Nelle malattie autoimmuni e infiammatorie, in aggiunta agli effetti terapeutici di Tregs in sevemodelli di malattia del mouse RAL, recenti prove in-man di trasferimento adottivo Treg per prevenire graft- contro -host malattia (GvHD) 4-7 e per valutare la sicurezza nel trattamento del diabete di tipo 1 8 ha mostrato risultati molto promettenti. Presenti in natura Tregs (nTregs) comprendono tTregs timiche-derivati e pTregs perifericamente indotte, con funzioni essenziali non ridondanti nel mantenimento della salute 9 - 11. Tuttavia, i numeri nTreg sono limitate, favorendo l&#39;approccio complementare di indurre Tregs (iTregs) in vitro da precursori delle cellule T naive 12. Ancora stabilità iTregs, presumibilmente a causa della mancanza di demetilazione nella cosiddetta regione demetilato Treg-specifico (TSDR) nel locus genico FOXP3 13, rimane una preoccupazione e diversi studi indicano che in vivo indotto Tregs sono più stabili 14. Fino ad oggi, FOXP3 rimane la migliore proteina mArker per Tregs ma non è assolutamente specifica perché convenzionali cellule CD4 + CD25- T umani transitoriamente esprimono livelli intermedi di FOXP3 all&#39;attivazione 15,16. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire la regolazione dell&#39;espressione FOXP3, resta molto da scoprire per quanto riguarda l&#39;induzione, la stabilità e la funzione di FOXP3 in particolare nelle cellule umane. Nonostante le differenze a nTregs, in vitro indotta FOXP3 + cellule T CD4 + possono essere utilizzati come sistema modello per studiare i meccanismi molecolari dell&#39;induzione FOXP3 e come punto di partenza per sviluppare protocolli in futuro che consentono la generazione di iTregs più simili al vIVO generato Tregs, che potrebbe essere applicabile per le strategie di trasferimento adottivo in futuro. Non vi è alcun `protocollo d&#39;oro standard&#39; per indurre iTregs umani, e attuali protocolli sono stati sviluppati sulla base di mimare condizioni Treg-inducono in vivo: interleuchina 2 (IL-2) E fattore di crescita trasformante β (TGF-β) di segnalazione sono cruciali per l&#39;induzione FOXP3 in vivo 17, e all-trans retinoico (ATRA) - che è prodotto in vivo dalle cellule dendritiche intestinali associate - viene spesso utilizzato per migliorare l&#39;induzione FOXP3 in vitro 18 - 21. Abbiamo sviluppato ulteriori protocolli Treg-inducono umani utilizzando butirrato 22, un acido grasso a catena corta flora intestinale di derivazione che è stato recentemente dimostrato per aumentare murino Treg induzione 23,24. Abbiamo inoltre recentemente istituito un nuovo protocollo per la generazione di iTregs con funzione di soppressiva superiore in vitro utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina 22, quest&#39;ultimo è un mammalian target clinicamente approvato rapamicina (mTOR) inibitore che è noto per la promozione manutenzione FOXP3 durante umana espansione Treg 25,26. Questo metodo descrive la riproducibile invitro generazione di CD4 umana + FOXP3 + iTregs utilizzando una serie di condizioni diverse, e la loro successiva fenotipizzazione mediante citometria di flusso e la reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) per rivelare i modelli specifici del protocollo di espressione di FOXP3 e altre molecole di firma Treg tali come CD25, CTLA-4, EOS, così come la repressione di IFN-γ e di espressione SATB1 22. Le popolazioni cellulari generati possono essere utilizzati per saggi funzionali relative attività soppressiva o per studi molecolari, né riguardo regolatori generali FOXP3 o per studiare gli effetti specifici di alcuni composti come butirrato o rapamicina. Ulteriore comprensione dei meccanismi molecolari di guida differenziazione Treg è molto importante per i futuri approcci terapeutici in autoimmunità o il cancro per indirizzare specificamente molecole coinvolte nella generazione e la funzione Treg.

<table><tbody><tr><td>Acido retinoico all-trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>clone anit-umano Foxp3-APC 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microsfere CD25 anti-umane</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD28 anti-umano, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD3 umano, LEAF purificato&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD4-PerCP clone SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, viola brillante 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano IFN-g FITC clone 4S. B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Soluzione contenente A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA: SuperScript VILO (Trascrittasi inversa) Kit di sintesi del cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di centrifugazione a densità: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, inattivato a caldo</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di vitalità fissabile, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 o 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi per colorazione Foxp3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Attenzione: contiene paraformaldeide. Può essere acquistato anche in kit combinato con anticorpi; 77-5774-40 Set di colorazione Foxp3 anti-umano Clone APC: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutammina)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>kit di isolamento delle cellule T CD4 naive umane II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina da Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>topo IgG1 K Controllo isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>topo IgG1 K Controllo isotipo FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo IgG2a di topo, viola brillante 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>pipetta Pasteur in plastica, confezionato singolarmente</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umano ricombinante, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr> Kit di isolamento <tr><td>dell'RNA umano ricombinante TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr>: <tr><td>Kit RNAqueous-Micro</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura di cellule T: terreno X-Vivo 15, con gentamicina+fenolo Lonza</td><td></td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Migliore copertura)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; ID saggio: Hs01085834_m1</td><td>Attenzione: contiene paraformaldeide</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Migliore copertura)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; ID test: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Attenzione: contiene paraformaldeide</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

la differenziazione in vitro di cellule cd4 + umana foxp3 + indotta da t regolatorie (itregs) da cellule t cd4 naïve utilizzando un protocollo tgf-β contenenti

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Le cellule T regolatorie (Treg) sono parte integrante della tolleranza periferica, sopprimendo le reazioni immunitarie contro le autostrutture e prevenendo così le malattie autoimmuni. Sono in corso approcci clinici per trasferire adottivamente le Treg, o per esaurire le Treg nel cancro, con primi risultati promettenti. 
Poiché il numero di Treg presenti in natura (nTregs) è molto limitato, lo studio di alcune caratteristiche delle Treg utilizzando Treg indotte in vitro (iTregs) può essere vantaggioso. Ad oggi, il miglior marcatore proteico, anche se non assolutamente specifico, per delineare le Treg è il fattore di trascrizione FOXP3. Nonostante l'importanza delle Treg, compresi i ruoli non ridondanti delle Treg indotte perifericamente, i protocolli per generare le iTreg sono attualmente controversi, in particolare per le cellule umane. Questo protocollo descrive quindi la differenziazione in vitro di iTreg CD4+FOXP3+ umani da cellule T naïve umane utilizzando una serie di fattori induttori di Treg (TGF-β più solo IL-2, o la loro combinazione con acido retinoico, rapamicina o butirrato) in parallelo. Descrive anche la fenotipizzazione di queste cellule mediante citometria a flusso e qRT-PCR. 
Questi protocolli determinano un'espressione riproducibile di FOXP3 e di altri geni di firma delle Treg e consentono lo studio dei meccanismi generali di regolazione di FOXP3 e degli effetti specifici del protocollo per delineare l'impatto di determinati fattori. Gli iTreg possono essere utilizzati per studiare vari aspetti fenotipici e i meccanismi molecolari dell'induzione delle Treg. Studi molecolari dettagliati sono facilitati da un numero relativamente elevato di cellule che può essere ottenuto. 
Una limitazione per l'applicazione degli iTreg è la relativa instabilità dell'espressione di FOXP3 in queste cellule rispetto agli nTreg. Gli iTreg generati da questi protocolli possono essere utilizzati anche per saggi funzionali come lo studio della loro funzione soppressiva, in cui gli iTreg indotti da TGF-β più acido retinoico e rapamicina mostrano un'attività soppressiva superiore. Tuttavia, la capacità soppressiva degli iTreg può differire da quella degli nTreg e l'uso di controlli appropriati è fondamentale.

La figura 1 mostra uno schema del setup sperimentale. La figura 2 mostra una colorazione rappresentante controllo della purezza per le cellule T CD4 + naive magneticamente isolate e nTregs. F IGURA 3A mostra la citometria a flusso strategia di gating e la Figura 3B mostra FOXP3 rappresentante e CD25 citometria a flusso colorazioni il giorno 6 della ...

Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l&#39;induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Gli obiettivi generali di questo esperimento sono l'induzione di cellule T regolatorie umane FOXP3-positive da cellule T CD4 naive in vitro e l'analisi del loro fenotipo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle cellule T, ad esempio come avviene la differenziazione regolatoria delle cellule T a livello molecolare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione e la fenotipizzazione riproducibili di cellule T regolatorie umane FOXP3-positive.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla differenziazione regolatoria delle cellule T, può anche essere modificato per studiare altri sottogruppi di cellule T CD4 e altre cellule immunitarie di interesse. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di isolamento dei bit PBMC e magnetici sono facili da capire quando vengono mostrate piuttosto che descritte. Per isolare le cellule T del sangue periferico, iniziare aggiungendo 15 millilitri di terreno di gradiente di densità a temperatura ambiente in cinque provette da 50 millilitri per buffy coat e portare il volume finale di buffy coat fino a 180 millilitri con PBS a temperatura ambiente.Quindi, inclinare lateralmente una provetta di terreno a gradiente di densità e sovrapporre lentamente circa 35 millilitri di sangue diluito sul mezzo a gradiente di densità senza mescolare le soluzioni. Separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, trasferire gli strati bianchi di PBMC tra il gradiente di densità e le fasi del plasma da ciascun tubo in nuovi tubi conici da 50 millilitri.Lavare il PBMC con 200 millilitri di PBS fresco e risospendere i pellet in terreno completo per la deplezione dei monociti del sangue periferico mediante aderenza plastica. Dopo aver raccolto le cellule galleggianti, lavare la PBMC tre volte in un massimo di 50 millilitri di PBS fresco, rimettendo in sospensione il pellet finale in 40 microlitri di tampone di isolamento a quattro gradi Celsius e 10 microlitri di cocktail di anticorpi di biotina delle cellule T CD4-positive naive per una volta da 10 alla settima cellula con un'accurata miscelazione. Incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare le cellule con 40 millilitri di PBS a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone di isolamento e 20 microlitri di microsfere anti-biotina per una volta da 10 alla settima cellula per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius.Mentre le cellule sono in incubazione, posizionare una colonna LS su un magnete ed equilibrare con tre millilitri di tampone di isolamento, quindi lavare le cellule in 50 millilitri di PBS e risospendere il pellet in tre millilitri di tampone di isolamento fresco. Ora aggiungi le cellule alla colonna, raccogliendo il flusso naive contenente cellule T CD4-positive in una provetta da 15 millilitri. Quando la colonna smette di gocciolare, sciacquare il tubo con due millilitri di tampone isolante e trasferire il lavaggio sulla colonna.Dopo l'ultimo lavaggio, pellettare le cellule T selezionate magneticamente mediante centrifugazione, seguita da due lavaggi in 15 millilitri di terreno, ottenendo una popolazione di cellule T CD4-positive naive pura superiore al 94%. Per indurre le cellule T regolatorie, aggiungere 50 microlitri degli stimoli appropriati ai pozzetti corrispondenti di una piastra a 96 pozzetti rivestita anti-CD3. Quindi riempire i pozzetti vuoti, compresi i pozzetti a margine, con 200 microlitri di PBS e preriscaldare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Regolare la concentrazione delle cellule T naive a riposo a una densità da 2,2 a 2,6 volte 10 al sesto per millilitro in un mezzo di 37 gradi Celsius e aggiungere 50 microlitri di cellule a ciascun pozzetto. Quando tutte le cellule sono state seminate, avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due o tre giorni, piccoli gruppi di cellule proliferanti che emergono in gruppi più grandi in punti temporali successivi dovrebbero diventare visibili al microscopio ottico.Dopo quattro-sei giorni, il terreno cambia da leggermente arancione a giallastro e i pellet di cellule raggruppate sono visibili ad occhio nudo. Per valutare l'espressione del marcatore della superficie cellulare, utilizzare una pipetta per risospendere le cellule in ciascun pozzetto e trasferire le cellule in una nuova piastra con fondo a U a 96 pozzetti, lasciando un pozzetto libero attorno a ciascun pozzetto per evitare la contaminazione da spillover durante il processo in piedi. Quando tutte le cellule sono state trasferite, centrifugare la piastra ed eliminare il surnatante.Lasciando la lastra capovolta su una carta assorbente, picchiettare una volta la lastra e girarla immediatamente con il lato destro rivolto verso l'alto. Vortice per risospendere le cellule nel liquido rimanente. Quindi aggiungere 25 microlitri di premiscela superficiale a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio.Al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti due volte in 200 microlitri di PBS, rimuovendo il surnatante, e rimettendo in sospensione le cellule dopo ogni lavaggio, come appena dimostrato. Quindi eseguire la vitalità e la colorazione intracellulare per FOXP3 e altri marcatori di interesse. In questi grafici, viene mostrata la strategia di gating della citometria a flusso per le cellule T regolatorie CD25-positive CD4-positive FOXP3-positive.Dopo la stimolazione in vitro, la maggior parte delle cellule regola il CD25, la cui espressione è ridotta in presenza di rapamicina. Solo con l'aggiunta di fattori Treg inducibili diventa evidente una chiara popolazione di cellule FOXP3-positive con livelli di espressione proteica intracellulare elevati come le Treg presenti in natura. Infatti, ogni condizione di Treg indotta dimostra un modello specifico e riproducibile di proliferazione cellulare.Con il TGF beta che induce un leggero aumento della proliferazione e l'acido retinoico all-trans che aumenta drasticamente la proliferazione delle cellule T, mentre l'aggiunta di rapamicina alle colture riduce fortemente le dimensioni del cluster cellulare. L'analisi QRT-PCR delle Treg indotte indica che l'espressione dell'mRNA di FOXP3 è più alta in tutte le colture di Treg indotte rispetto alle cellule stimolate dal controllo, con le Treg indotte trattate con rapamicina che mostrano i livelli più bassi di mRNA di FOXP3 tra le colture di Treg indotte. Inoltre, si osserva che l'espressione dell'mRNA di FOXP3 nelle Treg presenti in natura è superiore a quella esibita da qualsiasi popolazione di cellule T regolatorie inducibili.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia delle cellule T per esplorare i meccanismi molecolari della generazione e della funzione delle Treg in donatori sani o in pazienti con malattie autoimmuni o cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule T CD4-positive naive umane e di come differenziare e fenotipizzare le NU risultanti in cellule T regolatorie. Non dimenticate che lavorare con sangue umano o paraformaldeide può essere estremamente pericoloso.Pertanto, durante l'esecuzione di queste procedure dovrebbero essere prese in considerazione precauzioni come la pre-elaborazione, l'esecuzione di tutte le vaccinazioni, l'uso di indumenti protettivi e l'utilizzo di un corretto smaltimento dei rifiuti.

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La differenziazione in vitro di cellule CD4 ⁺ umana FOXP3 ⁺ indotta da T regolatorie (iTregs) da ^cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

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