Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione

L'obiettivo generale di questa tecnologia di genomica funzionale è identificare le posizioni genomiche precise che una data proteina occupa nelle cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica e dell'epigenetica, come ad esempio il modo in cui il meccanismo di trascrizione si assembla e opera nel contesto della cromatina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rivela l'esatta posizione genomica per le interazioni proteina DNA con una pre-risoluzione vicina alla base con un fondo eccezionalmente basso.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il protocollo è complesso e richiede attenzione ai dettagli in tutto. Per sonicare i lisati nucleari, inizia posizionando gli adattatori di resina in tubi di polistirene da 15 millilitri contenenti estratti nucleari. Sonicare i lisati in un bagno di acqua ghiacciata a media potenza per 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per un totale di due sessioni di 15 minuti.

Per controllare i risultati della sonicazione, trasferire due campioni da 10 microlitri da ciascuna provetta in provette da 1,5 millilitri. Quindi reticolare inversamente combinando il primo campione da 10 microlitri con 10 microlitri di TE-RNasi A e 0,2 microlitri di proteinasi K.Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere quattro microlitri di colorante DNA xilene 6X.

Al secondo campione da 10 microlitri, conservare i legami incrociati aggiungendo due microlitri di colorante DNA xilene 6X. Eseguire entrambi i campioni su un gel di agarosio all'1,5% a 140 volt per circa 30-45 minuti fino a quando il colorante bromofenolo in quest'ultimo non si trova a tre quarti del gel. Se la sonicazione ha avuto successo, trasferire i lisati sonicati in provette da due millilitri contenenti 150 microlitri di Triton X-100 al 10% e vortex da miscelare.

Pellettare la cromatina insolubile e i detriti facendo girare i lisati sonicati a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire i surnatanti in nuove provette da due millilitri. Conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius a tempo indeterminato.

Per ogni immunoprecipitazione della cromatina o reazione ChIP, combinare 1,5 millilitri di estratti sonicati con coniugati di perline di anticorpi in provette da 1,5 millilitri. Incubare le provette su un mini rotatore per provette a una velocità di nove a quattro gradi Celsius durante la notte. Controllare dopo alcuni minuti per assicurarsi che i campioni non perdano e si mescolino correttamente.

Il giorno seguente, girare molto brevemente le provette per raccogliere il liquido nei tappi e posizionare le provette su una griglia magnetica per un minuto. Quindi aspirare l'estratto. Aggiungere 0,75 millilitri di tampone RIPA in ogni provetta.

Quindi rimuovere le provette dalla rastrelliera magnetica e capovolgerle più volte per mescolare. Dopo una breve centrifuga, riposizionare i tubi sul magnete e aspirare il surnatante. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 0,75 millilitri di Tris HCL da 10 millimolari a ciascun tubo.

Rimuovere le provette dal rack magnetico e capovolgere i campioni più volte per mescolarli. Dopo una breve centrifuga, riposizionare le provette sul rack e aspirare il surnatante. Dopo aver eseguito le reazioni di lucidatura e dettaglio secondo il protocollo di testo, compilare i calcoli della miscela master di legatura.

Quindi preparare la miscela di legatura in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio e pipettare per mescolare la soluzione. Con le provette del campione sul rack magnetico, aggiungere 48 microlitri di master mix di legatura P7 e due microlitri di un diverso indice adattatore a ciascuna delle resine del campione. Incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 25 gradi Celsius per due ore.

Dopo aver lavato i campioni ed eseguito la riparazione del nick Phy 29 e le reazioni chinasiche, secondo il protocollo di testo, compilare i calcoli della miscela master di esonucleasi lambda e preparare la miscela di esonucleasi lambda in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri di miscela di esonucleasi lambda a ciascun campione di resina mentre si trova ancora sul rack magnetico. Quindi incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio come descritto nel protocollo di testo, eseguire la reazione nucleasica RecJf compilando i calcoli della miscela master RecJf e realizzando la miscela RecJf su ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri della miscela RecJf a ciascun campione di resina sul rack magnetico. Quindi incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio, preparare il tampone di eluizione ChIP e la master mix di proteinasi K e aggiungere 200 microlitri di soluzione a ciascun campione di resina. Incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 65 gradi Celsius durante la notte con un coperchio riscaldato per evitare la condensa. Il giorno seguente, centrifugare brevemente i campioni e posizionare le provette sul rack magnetico per un minuto.

Quindi trasferire 200 microlitri di surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di tampone TE. Dopo l'estrazione del DNA, l'estensione primaria P7 e le reazioni ATL, compilare i calcoli della master mix della tabella di legatura dell'adattatore P5 e realizzare la master mix di legatura su ghiaccio. Aggiungere 20 microlitri della miscela di legatura a ciascun campione e pipettare per mescolare.

Quindi incubare i campioni in un termociclatore a 25 gradi Celsius per due ore. Effettuare la purificazione e la quantificazione del DNA secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, vale la pena dedicare del tempo all'ottimizzazione delle condizioni di sonicazione per ottenere estratti di cromatina di alta qualità che producono frammenti di DNA tra le 100 e le 500 coppie di basi.

E il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica viene utilizzato per verificare che gli estratti sonicati contengano legami incrociati di DNA proteico intatti, evidenti come un super spostamento di frammenti di DNA. Per valutare il segnale di fondo, viene eseguito di routine un simulato ChIP senza anticorpi nella reazione. Una libreria ChIP exo-library di alta qualità produrrà pochissimo background nel campione mock rispetto a una preparazione di libreria ChIP-seq.

Di seguito è illustrata una valutazione del bioanalizzatore di una libreria ChIP-exo. L'analisi garantisce con precisione la distribuzione delle dimensioni della libreria e rileva i dimeri dell'adattatore contaminanti che funzionano a 125 coppie di basi. Questo pannello illustra la distribuzione regolare di ChIP-exo separati da filamenti che taggano cinque N primi per la polimerasi II, TFIIB e TBP a livello del gene RPS12 umano nelle cellule K562 proliferanti.

In questa figura sono mostrati i pattern medi ChIP-exo relativi ai siti di inizio trascrizionale dei geni codificanti le proteine. Le principali posizioni di picco per TBP, TFIIB e polimerasi II nel grafico composito riflettono l'organizzazione genomica dei complessi di inizio della trascrizione umana. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della regolazione genica per esplorare i dettagli molecolari della struttura subnucleare nell'asimmetria nel lievito. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il profilo di espressione della ricerca della RNasi per affrontare domande come se un determinato fattore influenzi l'espressione di un gene vicino. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di compilare attentamente le tabelle di miscelazione master per tutti i passaggi enzimatici.

Non dimenticare che lavorare con agenti cancerogeni e altri agenti caustici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una libreria ChIP-exo di alta qualità.