Name: Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Impara il metodo ChIP-exo per mappare interazioni proteina-DNA con precisione di vicino paia di basi. Questa tecnica avanzata consente di studiare regolazione genica ed epigenetica con basso rumore di fondo.

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Ringraziamo il Venters Lab e i membri del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Biofisica per le utili discussioni. Un ringraziamento speciale a Frank Pugh per la sua guida, il suo mentoring e le molte discussioni approfondite sulle sfumature del ChIP-exo mentre ero un borsista post-dottorato nel suo laboratorio.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Vi presentiamo un protocollo di genomica funzionale per determinare la posizione di rilegatura preciso per cromatina proteine ​​interagenti in modo imparziale, genome-wide a risoluzione pressi coppia di basi. La fase più critica per ottenere vicino alla base risoluzione pair mappatura è il trattamento esonucleasi del DNA ChIP arricchiti mentre l&#39;immunoprecipitato rimane sulla resina magnetica. Apparentemente, complessi proteici potrebbero potenzialmente bloccare footprinting in vivo di ogni subunità <...

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente metodo per studiare i meccanismi di regolazione genica da selettivamente arricchente per frammenti di DNA che interagiscono con una certa proteina nelle cellule viventi. Metodi di rilevamento di frammenti di DNA chip arricchito si sono evoluti come la tecnologia migliora, dal rilevamento di un singolo locus (standard ChIP-qPCR) per ibridazione su microarray di oligonucleotidi (Chip-chip) a high-throughput sequencing (ChIP-Seq) 1. Anche se ChIP-Seq ha visto applicazione diffusa, l&#39;eterogeneità della cromatina e le interazioni DNA aspecifiche hanno ostacolato la qualità dei dati che porta a falsi positivi e la mappatura imprecisa. Per aggirare queste limitazioni, il Dr. Frank Pugh ha sviluppato il metodo di ChIP-Exo 2. La caratteristica saliente di ChIP-Exo è che incorpora un 5 &#39;a 3&#39; esonucleasi, footprinting efficace fattore di trascrizione posizioni vincolanti. Come risultato, la metodologia ChIP-exo raggiunge risoluzione maggiore, una maggiore gamma dinamica di detection, e più basso rumore di fondo. Anche se ChIP-exo è più tecnicamente impegnativo da padroneggiare rispetto ChIP-seq, esso viene ampiamente adottato come gli studi hanno lo scopo di acquisire conoscenze uniche ultra ad alta risoluzione utilizzando diversi sistemi biologici 3-8. Infatti, Chip-exo è stato applicato con successo a batteri, lieviti, topo, ratto, e sistemi di cellule umane. Come prova di principio, Chip-exo è stato originariamente utilizzato per identificare il motivo preciso vincolante per una manciata di trascrizione del lievito fattori 2. La tecnica è stata utilizzata anche nel lievito studiare l&#39;organizzazione del complesso di pre-inizio della trascrizione, e per decifrare la struttura subnucleosomal di vari istoni 9,10. Più di recente, abbiamo sfruttato ChIP-exo per risolvere TFIIB adiacente e Pol II eventi a promotori umani vincolanti, e ha dimostrato che diffuso la trascrizione divergenti deriva da iniziazione distinti complessi 11. Il flusso di lavoro qui presentata è ottimizzata e streamlined per mammiferi ChIP-Exo (Figura 1). In primo luogo, che vivono cellule di coltura primarie o tessuti sono trattati con formaldeide per preservare in vivo interazioni proteina-DNA attraverso una reticolazione covalente. Le cellule sono lisate e cromatina tosati a ~ 100 - 500 frammenti di dimensioni coppie di basi. ChIP poi arricchisce selettivamente per frammenti di DNA reticolati per la proteina di interesse. A questo punto, librerie ChIP-seq sono tipicamente preparati, che limita intrinsecamente la risoluzione di rilevamento per la dimensione media frammento di qualche centinaio di paia di basi. Tuttavia, ChIP-exo supera questa limitazione tagliando il diritto confini 5 &#39;del DNA del sito reticolazione proteina-DNA con lambda esonucleasi e sinistro. librerie di sequenziamento sono poi costruiti da esonucleasi DNA digerito come di seguito dettagliato. I nidificate 5 &#39;confini risultanti rappresentano un ingombro in vivo dell&#39;interazione proteina-DNA (Figura 1, fase 14), e vengono rilevati da elevata produttività sequenziamento. although la metodologia ChIP-exo è più coinvolto di ChIP-seq, le transizioni tra la maggior parte delle operazioni richiede semplice lavaggio tallone, che riduce al minimo la perdita di campione e la variabilità sperimentale. È importante sottolineare che, dal momento che ChIP-Exo è una versione raffinata di ChIP-seq, qualsiasi campione che è successo con il circuito integrato-Seq dovrebbe anche avere successo con Chip-Exo. Il footprinting in vivo di interazioni proteina-DNA con risultati ChIP-eso in una struttura dati fondamentalmente diversi dagli ChIP-seq. Anche se i chiamanti CHIP-ss incontrate possono essere applicate ai dati del chip-exo, per ottenere le chiamate di picco più precise si consiglia di strumenti bioinformatici specificamente progettati con la struttura unica di dati del chip-exo in mente. Questi includono Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, e ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% formaldeide, senza metanolo, 10 fiale da 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sezione 3</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Sezioni 4, 8</td></tr><tr><td>Sonicatore Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Sezione 5</td></tr><tr><td>Tubi in polistirene da 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>352095 Sezione 5</td></tr><tr><td>Perline MagSepharose Protein G Xtra</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Sezione 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Rack magnetico laterale</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Sezioni 6-17, 22</td></tr><tr><td>Rotatore per mini-provette</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Sezioni 7, 22</td></tr><tr><td>DNA polimerasi T4</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Sezione 9</td></tr><tr><td>DNA polimerasi I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Sezione 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x tampone di reazione 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Sezioni 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Sezioni 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Sezioni 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Sezioni 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Sezioni 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Sezioni 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Sezioni 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Sezioni 11, 21</td></tr><tr><td>&phi;-29 DNA polimerasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Sezioni 12, 19</td></tr><tr><td>10x &phi;-29 Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Sezioni 12, 19</td></tr><tr><td>Esonucleasi Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Sezione 14</td></tr><tr><td>10x Lambda Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Sezione 14</td></tr><tr><td>RecJf Esonucleasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Sezione 15</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Sezione 16</td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Sezione 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligasi Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Sezione 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (pulizia) perline&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Sezione 22</td></tr><tr><td>Q5 Avviamento a caldo DNA polimerasi&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Sezione 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x tampone PCR)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Sezione 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Sezione 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Sezione 26</td></tr><tr><td>Tubi Qubit ottici trasparenti&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Sezione 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit di test ad alta sensibilità</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Sezione 26</td></tr></tbody></table>

il metodo chip-exo: identificazione interazioni proteina-dna con vicino paia di basi di precisione

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è uno strumento indispensabile nel campo della epigenetica e regolazione genica che isola specifiche interazioni proteina-DNA. ChIP accoppiato ad alto rendimento sequenziamento (ChIP-seq) viene comunemente utilizzato per determinare la posizione genomica di proteine ​​che interagiscono con cromatina. Tuttavia, Chip-Seq è ostacolata dalla risoluzione mappatura relativamente basso di diverse centinaia di paia di basi e di alta segnale di fondo. Il metodo ChIP-Exo è una versione raffinata di ChIP-Seq che migliora sostanzialmente al momento sia la risoluzione e rumore. La distinzione fondamentale della metodologia ChIP-Exo è l&#39;incorporazione di lambda esonucleasi digestione nel flusso di lavoro di preparazione biblioteca all&#39;impronta efficacemente sinistra e destra 5 confini &#39;del DNA del sito reticolazione proteina-DNA. Le librerie CHIP-exo vengono poi sottoposti ad alto rendimento sequenziamento. I dati risultanti può essere sfruttata per fornire intuizioni uniche e ultra-alta risoluzione nell&#39;organizzazione funzionale of genoma. Qui, descriviamo il metodo ChIP-exo che abbiamo ottimizzato e semplificato per i sistemi di mammiferi e la piattaforma di sequenziamento per sintesi di nuova generazione.

Le seguenti figure illustrano i risultati rappresentativi del protocollo ChIP-exo qui presentata. In contrasto con metodologie tradizionali chip ss con pochi passaggi enzimatici, Chip-exo richiede undici reazioni enzimatiche in sequenza dipendenti (Figura 1). Pertanto, occorre fare attenzione ad ogni passaggio per garantire che ciascun componente di reazione viene aggiunto al rispettivo master mix di reazione. Si consiglia di generare un foglio di calcolo formule in base...

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere una risoluzione vicina alla coppia di basi delle interazioni proteina-DNA. Questo si ottiene mediante trattamento esonucleasico di frammenti di DNA arricchiti selettivamente mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-exo) seguita da sequenziamento ad alto rendimento.

Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

L'obiettivo generale di questa tecnologia di genomica funzionale è identificare le posizioni genomiche precise che una data proteina occupa nelle cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica e dell'epigenetica, come ad esempio il modo in cui il meccanismo di trascrizione si assembla e opera nel contesto della cromatina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rivela l'esatta posizione genomica per le interazioni proteina DNA con una pre-risoluzione vicina alla base con un fondo eccezionalmente basso.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il protocollo è complesso e richiede attenzione ai dettagli in tutto. Per sonicare i lisati nucleari, inizia posizionando gli adattatori di resina in tubi di polistirene da 15 millilitri contenenti estratti nucleari. Sonicare i lisati in un bagno di acqua ghiacciata a media potenza per 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per un totale di due sessioni di 15 minuti.Per controllare i risultati della sonicazione, trasferire due campioni da 10 microlitri da ciascuna provetta in provette da 1,5 millilitri. Quindi reticolare inversamente combinando il primo campione da 10 microlitri con 10 microlitri di TE-RNasi A e 0,2 microlitri di proteinasi K.Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere quattro microlitri di colorante DNA xilene 6X.Al secondo campione da 10 microlitri, conservare i legami incrociati aggiungendo due microlitri di colorante DNA xilene 6X. Eseguire entrambi i campioni su un gel di agarosio all'1,5% a 140 volt per circa 30-45 minuti fino a quando il colorante bromofenolo in quest'ultimo non si trova a tre quarti del gel. Se la sonicazione ha avuto successo, trasferire i lisati sonicati in provette da due millilitri contenenti 150 microlitri di Triton X-100 al 10% e vortex da miscelare.Pellettare la cromatina insolubile e i detriti facendo girare i lisati sonicati a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire i surnatanti in nuove provette da due millilitri. Conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius a tempo indeterminato.Per ogni immunoprecipitazione della cromatina o reazione ChIP, combinare 1,5 millilitri di estratti sonicati con coniugati di perline di anticorpi in provette da 1,5 millilitri. Incubare le provette su un mini rotatore per provette a una velocità di nove a quattro gradi Celsius durante la notte. Controllare dopo alcuni minuti per assicurarsi che i campioni non perdano e si mescolino correttamente.Il giorno seguente, girare molto brevemente le provette per raccogliere il liquido nei tappi e posizionare le provette su una griglia magnetica per un minuto. Quindi aspirare l'estratto. Aggiungere 0,75 millilitri di tampone RIPA in ogni provetta.Quindi rimuovere le provette dalla rastrelliera magnetica e capovolgerle più volte per mescolare. Dopo una breve centrifuga, riposizionare i tubi sul magnete e aspirare il surnatante. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 0,75 millilitri di Tris HCL da 10 millimolari a ciascun tubo.Rimuovere le provette dal rack magnetico e capovolgere i campioni più volte per mescolarli. Dopo una breve centrifuga, riposizionare le provette sul rack e aspirare il surnatante. Dopo aver eseguito le reazioni di lucidatura e dettaglio secondo il protocollo di testo, compilare i calcoli della miscela master di legatura.Quindi preparare la miscela di legatura in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio e pipettare per mescolare la soluzione. Con le provette del campione sul rack magnetico, aggiungere 48 microlitri di master mix di legatura P7 e due microlitri di un diverso indice adattatore a ciascuna delle resine del campione. Incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 25 gradi Celsius per due ore.Dopo aver lavato i campioni ed eseguito la riparazione del nick Phy 29 e le reazioni chinasiche, secondo il protocollo di testo, compilare i calcoli della miscela master di esonucleasi lambda e preparare la miscela di esonucleasi lambda in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri di miscela di esonucleasi lambda a ciascun campione di resina mentre si trova ancora sul rack magnetico. Quindi incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio come descritto nel protocollo di testo, eseguire la reazione nucleasica RecJf compilando i calcoli della miscela master RecJf e realizzando la miscela RecJf su ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri della miscela RecJf a ciascun campione di resina sul rack magnetico. Quindi incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio, preparare il tampone di eluizione ChIP e la master mix di proteinasi K e aggiungere 200 microlitri di soluzione a ciascun campione di resina. Incubare i campioni in un ThermoMixer a tre volte g a 65 gradi Celsius durante la notte con un coperchio riscaldato per evitare la condensa. Il giorno seguente, centrifugare brevemente i campioni e posizionare le provette sul rack magnetico per un minuto.Quindi trasferire 200 microlitri di surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di tampone TE. Dopo l'estrazione del DNA, l'estensione primaria P7 e le reazioni ATL, compilare i calcoli della master mix della tabella di legatura dell'adattatore P5 e realizzare la master mix di legatura su ghiaccio. Aggiungere 20 microlitri della miscela di legatura a ciascun campione e pipettare per mescolare.Quindi incubare i campioni in un termociclatore a 25 gradi Celsius per due ore. Effettuare la purificazione e la quantificazione del DNA secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, vale la pena dedicare del tempo all'ottimizzazione delle condizioni di sonicazione per ottenere estratti di cromatina di alta qualità che producono frammenti di DNA tra le 100 e le 500 coppie di basi.E il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica viene utilizzato per verificare che gli estratti sonicati contengano legami incrociati di DNA proteico intatti, evidenti come un super spostamento di frammenti di DNA. Per valutare il segnale di fondo, viene eseguito di routine un simulato ChIP senza anticorpi nella reazione. Una libreria ChIP exo-library di alta qualità produrrà pochissimo background nel campione mock rispetto a una preparazione di libreria ChIP-seq.Di seguito è illustrata una valutazione del bioanalizzatore di una libreria ChIP-exo. L'analisi garantisce con precisione la distribuzione delle dimensioni della libreria e rileva i dimeri dell'adattatore contaminanti che funzionano a 125 coppie di basi. Questo pannello illustra la distribuzione regolare di ChIP-exo separati da filamenti che taggano cinque N primi per la polimerasi II, TFIIB e TBP a livello del gene RPS12 umano nelle cellule K562 proliferanti.In questa figura sono mostrati i pattern medi ChIP-exo relativi ai siti di inizio trascrizionale dei geni codificanti le proteine. Le principali posizioni di picco per TBP, TFIIB e polimerasi II nel grafico composito riflettono l'organizzazione genomica dei complessi di inizio della trascrizione umana. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della regolazione genica per esplorare i dettagli molecolari della struttura subnucleare nell'asimmetria nel lievito. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il profilo di espressione della ricerca della RNasi per affrontare domande come se un determinato fattore influenzi l'espressione di un gene vicino. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di compilare attentamente le tabelle di miscelazione master per tutti i passaggi enzimatici.Non dimenticare che lavorare con agenti cancerogeni e altri agenti caustici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una libreria ChIP-exo di alta qualità.

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Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è un metodo...

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

In questo video, dimostriamo la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine su regioni specifiche del DNA genomico delle cellule precursori degli oligodendrociti attraverso l'immunoprecipitazione selettiva di frammenti di cromatina legati alle proteine. Questo metodo aiuta a studiare l'interazione di diverse proteine regolatrici, compresi i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione genica.

Immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine bersaglio sul DNA genomico

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

In questo articolo video descrive un metodo microarray basato in vitro per determinare gli obiettivi del gene e siti di legame per due regolatori di risposta del sistema dei componenti.

DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

CUT&amp;RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&amp;RUN a singola cellula.

Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

Un metodo ChIRP basato su UV per identificare interazioni dirette lncRNA-proteina.

Un metodo ChIRP a base di UV per l'identificazione verificabile di proteine che interagiscono direttamente con lncRNA: dalle cellule coltivate al testicolo del topo

Impara il metodo ChIP-exo per mappare interazioni proteina-DNA con precisione di vicino paia di basi. Questa tecnica avanzata consente di studiare regolazione genica ed epigenetica con basso rumore di fondo.

Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione

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