Name: Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Scopri come misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli in cellule di cancro al seno resistenti al docetaxel utilizzando la microscopia a deconvoluzione con GFP-tubulina. Questo metodo permette di studiare il comportamento dei microtubuli in vivo sotto trattamento farmacologico.

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1. Preparare le cellule per Immagini dal vivo <ol><li> Coltura cellulare e la semina <ol><li> Utilizzare le cellule MCF-7 di tumore mammario selezionate per la resistenza a docetaxel (MCF-7 TXT) e la loro linea cellulare dei genitori non resistente (MCF-7 CC). Il processo di selezione dettagliata e la caratterizzazione di queste linee cellulari selezionate sono state descritte in precedenza 24. </li><li> Grow tutte le cellule in coltura 10 cm a 37 ° C in un mezzo costituito 90% del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e il 10% di siero fetale bovino (FBS) e integrati con amminoacidi non essenziali. Mantenere il mezzo in CO 2 atmosphere 5%. Mantenere le cellule MCF-7 TXT a 5 nM docetaxel. </li><li> cellule seme su vetrini per l&#39;imaging dal vivo. Sterilizzare 24 mm vetrini poli-L-lisina rivestite risciacquandole con il 70% di alcol e poi esporli ai raggi UV durante la notte. Mettere i coprioggetti in una piastra di coltura 6 pozzetti di 35 mm. Plasso un vetrino in ciascun pozzetto. </li><li> Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura di 10 cm e lavare le cellule con PBS. Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA al piatto per staccare le cellule dal piatto. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura al piatto di neutralizzare la tripsina dopo il distacco delle cellule. </li><li> Contare le cellule con un emocitometro per determinare il numero di cellule per unità di volume. </li><li> Aggiungere circa 10 5 cellule in ciascun pozzetto in base al numero di cellule per unità di volume. Dopo aver agitato delicatamente, mettere la piastra posteriore in incubatrice per permettere alle cellule di allegare alle lamelle. </li></ol></li><li> L&#39;espressione di GFP-tagged α-tubulina <ol><li> Per saggiare dinamica dei microtubuli, trasdurre le cellule con GFP-tagged α-tubulina con il controllo di trasduzione GFP commerciale (ad esempio, BacMam) secondo il protocollo del produttore. </li><li> Cultura le cellule nel pozzo per 36 h in un incubatore a 37 ° C coltura cellulare per consentire comadesione completo e il 60% di confluenza. </li><li> Calcolare il volume appropriato di GFP-tagged α-tubulina aggiungere a ciascun pozzetto, secondo la seguente equazione: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> Il numero di cellule è il numero totale stimato di cellule nel pozzo al momento dell&#39;etichettatura e PPC desiderato è il numero di particelle per cella. NOTA: Semina le cellule MCF-7 va raddoppiato il numero di celle da 10 5 2 x 10 5 con un PPC desiderata del 20, il volume necessario per ogni vetrino è quindi di 40 microlitri. Per le cellule differenti, il volume calcolato sulla base della formula di cui sopra non può essere la migliore. Il volume esatto deve essere regolata in base al livello di espressione reale di GFP-tubulina. </li><li> Mescolare le alfa-tubulina più volte GFP-etichettato per inversione per garantire una soluzione omogenea. Non farlo vortice. NOTA: Per il controllo, la (controllo) reagente Null manca di qualsiasi genetica dei mammiferielementi e possono essere usati per aiutare a determinare i potenziali effetti baculovirus-mediata e fluorescenza di fondo. Un controllo di trasduzione non mirati GFP può anche essere utilizzato, che si illuminerà l&#39;intera cella. </li><li> Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco. Aggiungere 2 ml del nuovo mezzo e 40 ml di GFP-tagged α-tubulina in ciascun pozzetto. </li><li> Agitare delicatamente la piastra per permettere la completa miscelazione di GFP-tagged α-tubulina con il terreno di coltura. Riportare la piastra alla cultura incubatore e incubare per 24 ore per permettere l&#39;espressione di GFP-tubulina. </li></ol></li><li> Trattare le cellule con docetaxel NOTA: Questo esperimento è quello di testare l&#39;effetto di docetaxel in microtubuli instabilità dinamica. Così, le cellule vengono trattate con la concentrazione desiderata di docetaxel. <ol><li> Preparare un mezzo composto 90% di DMEM e il 10% di FBS e completato con amminoacidi non essenziali. Utilizzare DMEM senza rosso fenolo perché rosso fenolo può interferire con la fluorescence di GFP-tubulina. Aggiungere la concentrazione desiderata di docetaxel (da 10 nM a 10 pM). La soluzione madre di docetaxel è di 10 mm di dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Pre-riscaldare il mezzo docetaxel a 37 ° C in incubatore di coltura tissutale. </li><li> Sostituire il terreno di coltura normale con il mezzo contenente docetaxel e incubare per 30 minuti nel tessuto culturale incubatore. Ci dovrebbe essere almeno 3 lamelle per pozzetto per ciascuna concentrazione docetaxel. </li></ol></li></ol> 2. l&#39;imaging dal vivo per esaminare microtubuli instabilità dinamica <ol><li> Impostazione del sistema <ol><li> Eseguire esperimenti in una camera mantenuta a 37 ° C e 5% CO 2. Acquisire immagini di fluorescenza dal lasso di tempo di un sistema microscopico dotato di 60X, 1.42 olio NA lente obiettivo su un microscopio a fluorescenza invertito e con una telecamera CCD. </li><li> Impostare le cellule per l&#39;imaging dal vivo. Pre-caldo sia il titolare del campione eil mezzo a 37 ° C. Scegliere un vetrino da esaminare. Montare il vetrino di interesse su un porta-campioni e incubare con 1 ml del mezzo contenente docetaxel preparato al punto 1.3.1. </li></ol></li><li> Immagini dal vivo di microtubuli instabilità dinamica <ol><li> Identificare le celle che verranno utilizzati per l&#39;imaging. Essi dovrebbero essere piatta, hanno una elevata intensità di fluorescenza di espresso GFP-tubulina, e hanno strutture microtubuli chiare. </li><li> Scegliere una cella dal gruppo di cellule identificate dal punto 2.2.1 di esaminare prima. Focus sulla superficie periferica della cella identificata. Impostare il programma per il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione delle immagini. Mentre il tempo di esposizione è di solito di 0,5 s, le immagini saranno acquisite ogni due s. </li><li> Lasciare un ulteriore 20 minuti per i passi da 1,33 a 2.2.3. Così, esattamente 50 minuti dopo l&#39;aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3, avviare l&#39;imaging (questo è per la standardizzazione). </li><li> Registrare il microtubulo dynamics per 2 minuti, scattare una foto ogni 2 s. In totale, acquisire 60 immagini per la cella identificata. </li><li> Passare alla successiva cella identificata e ripetere i passaggi 2.2.2 a 2.2.4. Ripetere la procedura fino a 5 celle sono state ripreso. È indispensabile farlo prima del tempo raggiunge 70 min dopo l&#39;aggiunta del docetaxel, come descritto al punto 1.3.3. </li><li> Per ogni condizione di trattamento, ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5 per 3 diverse lamelle. In totale, immagine 15 celle, che è abbastanza dati per misurare microtubuli instabilità dinamica. </li></ol></li></ol> 3. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati <ol><li> Deconvoluzione di immagini <ol><li> Deconvolve le immagini acquisite per ottenere una qualità elevata. Aprire il programma deconvoluzione equipaggiato con il sistema del microscopio. </li><li> Fai clic su &quot;Processo&quot; e selezionare &quot;Deconvolve.&quot; Trascinate il file immagine nella finestra &quot;Input&quot; e fare clic su &quot;Do.&quot; Il file di immagine verrà deconvolved, ed ilfile di deconvolved verrà salvato come un nuovo file automaticamente. </li></ol></li><li> Generazione di video <ol><li> Fare clic sul file immagine deconvolved da aprire con il software attrezzato. </li><li> Fai clic su &quot;File&quot; e selezionare &quot;Salva come film&quot;. Selezionare il &quot;formato di un film&quot; come &quot;AV&quot; e lo &quot;stile di animazione&quot; come &quot;Forward&quot;. Impostare la &quot;qualità di compressione&quot; a &quot;100%&quot; e il &quot;frame rate&quot; a &quot;5 / secondo.&quot; </li><li> Selezionare la casella di &quot;animare attraverso il tempo&quot; e fare clic su &quot;Do it&quot;. Il video verrà generato. </li></ol></li><li> Misura di microtubuli accorciamento e tasso di crescita <ol><li> Identificare i microtubuli che verranno utilizzati per la misurazione. Per ogni cella, solo pochi microtubuli potranno avere il loro accorciamento o di crescita seguiti chiaro e completo. </li><li> Esaminate ogni frame del video per identificare il fotogramma che mostra la lunghezza iniziale del microtubulo unND il telaio con il microtubulo più estesa o ridotta. Misurare la variazione di lunghezza tra i due microtubuli e il tempo trascorso tra i due telai. </li><li> Calcolare il tasso di crescita o accorciamento dividendo la variazione di lunghezza per tempo (l&#39;unità è micron / s). Per ogni condizione di trattamento, seguire almeno 10 cellule e misurare almeno 20 microtubuli. </li><li> Calcolare la media e l&#39;errore standard per ogni condizione di trattamento. Analizzare la differenza statistica tra le condizioni utilizzando il test di Student. Riportare i dati in una tabella e / o in un grafico. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ci sono due metodi principali per misurare microtubuli instabilità dinamica: in vitro e in vivo. Nel metodo in vitro, tubulina purificato viene utilizzato per misurare instabilità dinamica dei microtubuli con time-lapse microscopia a interferenza differenziale contrasto informatica avanzata. Nel metodo in vivo, microiniettato tubulina fluorescenti, o espresso GFP-tubulina, è incorporato in microtubuli. La dinamica (crescita e accorciamento) dei microtubuli vengono quindi registrati da...

<html> La principale causa di mortalità per cancro al seno è attraverso le metastasi 1, 2. Taxani, come docetaxel e paclitaxel, sono attualmente utilizzati come prima linea di regimi nel trattamento del carcinoma mammario metastatico 2, 3, 4, 5, 6. Fanno parte di un gruppo di agenti microtubuli-targeting (MTA) che interrompono la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, una delle più grandi sfide di utilizzare taxani nella terapia curativa è lo sviluppo della resistenza taxani nelle cellule tumorali, che porta alla malattia recidiva 7. La resistenza ai farmaci rappresenta oltre il 90% di tutti i decessi tra i pazienti con carcinoma mammario metastatico 7. I microtubuli sono formati dalla polimerizzazione di eterodimeri alfa- e beta-tubulinaclass = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. La regolazione precisa della dinamica dei microtubuli è importante per molte funzioni cellulari, tra cui la polarizzazione delle cellule, progressione del ciclo cellulare, trasporto intracellulare, e segnalazione cellulare. Disregolazione dei microtubuli e le loro dinamiche interromperà la funzione delle cellule e causare la morte delle cellule 10, 11. A seconda di come essi causano questa disregolazione, farmaci MTA possono essere classificati come agenti dei microtubuli di stabilizzazione (ad esempio, taxani) o agenti microtubuli destabalizing (cioè, alcaloidi della vinca o colchicina loco agenti leganti) 20. Nonostante i loro effetti opposti sulla massa microtubuli, ad una dose sufficiente, entrambe le classi possono uccidere le cellule tumorali attraverso i loro effetti sulla dinamica dei microtubuli 21. Taxani funzionano principalmente dalla stabilizzazione del microtubulo del mandrino 12, che porta adisallineamento cromosomica. La successiva attivazione perpetua del punto di controllo di assemblaggio del mandrino (SAC) arresta la cella in mitosi. Mitotico arresto prolungato provoca quindi l&#39;apoptosi 13, 14. Taxano interagisce con microtubuli attraverso il sito di legame taxano on β-tubulina 8, 15, che è presente solo in tubulina assemblato 16. Meccanismi multipli per resistenza taxani sono stati proposti 9, 17. Questi meccanismi comprendono sia la resistenza ai farmaci in generale a causa della sovraespressione di proteine droga efflusso e specifici taxano resistenza 5, 9, 18, 19. Ad esempio, le cellule tumorali taxani resistenti potrebbero aver alterato espressione e la funzione di alcuni β-tubulin isotipi 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Utilizzando un metodo in vivo per misurare microtubuli instabilità dinamica, dimostriamo che, rispetto ai non-resistenti, parentali cellule MCF-7 CC 17, la dinamica dei microtubuli di cellule MCF-7 TXT docetaxel-resistenti sono insensibili al trattamento con docetaxel. Per capire meglio la funzione di MTA e l&#39;esatto meccanismo di taxano-resistenza in cellule cancerose, è essenziale misurare dinamica dei microtubuli. Qui riportiamo un metodo in vivo di farlo. Utilizzando immagini dal vivo, in combinazione con l&#39;espressione di tubulina GFP-tagged nelle cellule, siamo in grado di misurare la dinamica dei microtubuli di MCF-7 TXT e le cellule CC MCF-7 con e wisarie, senza trattamento con docetaxel. I risultati possono aiutarci a progettare farmaci più efficaci che possono superare la resistenza taxano.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>docetaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01885-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenolo senza rosso</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10613</td><td>Reagente chiave per l'espressione della tubulina GFP nelle cellule</td></tr><tr><td>Reagente CellLight *BacMam 2.0* GFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B10383</td><td>Controllo</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich+B9:AA9</td><td>472301</td><td>per dissoving decetaxel</td></tr><tr><td>22 mm vetro coveslip</td><td>Fisher Scientifics</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One International</td> Piastra <td></td>di <td>coltura Celi a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Sistemi di imaging per microscopia DeltaVision GE</td><td>Health</td><td></td><td>Questo sistema è dotato di stazione meteorologica per il controllo della temperatura e della CO2. Dotato inoltre di software Worx per la deconvoluzione e il controllo del time lapse.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td> Set di <td></td> ematocitometri <td>Bright-Line 25200056</td><td></td>ThermoFisher Scientific</tr><tr><td>, Hausser Scientific</td><td>Hausser Scientific, distribuito da VWR</td><td>N. fornitore: 1492 N. VWR:15170-172</td><td></td></tr></tbody></table>

immagini dal vivo per studiare microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

I taxani come il docetaxel appartengono a un gruppo di agenti mirati ai microtubuli (MTA) che sono comunemente utilizzati per trattare il cancro. Tuttavia, la resistenza ai taxani nelle cellule cancerose riduce drasticamente l'efficacia dell'uso a lungo termine dei farmaci. L'evidenza accumulata suggerisce che i meccanismi alla base della resistenza ai taxani includono sia meccanismi generali, come lo sviluppo di resistenza multifarmaco dovuta alla sovraespressione delle proteine di efflusso dei farmaci, sia meccanismi taxano-specifici, come quelli che coinvolgono la dinamica dei microtubuli. 
Poiché i taxani prendono di mira i microtubuli cellulari, misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli è un passo importante per determinare i meccanismi di resistenza ai taxani e fornisce informazioni su come superare questa resistenza. Nell'esperimento, è stato utilizzato un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli. La α-tubulina marcata con GFP è stata espressa e incorporata nei microtubuli nelle cellule MCF-7, consentendo la registrazione della dinamica dei microtubuli mediante time lapse utilizzando una fotocamera sensibile. I risultati hanno mostrato che, a differenza delle celluleCC MCF-7 parentali non resistenti, la dinamica dei microtubuli delle celluleTXT MCF-7 resistenti al docetaxel è insensibile al trattamento con docetaxel, che causa la resistenza all'arresto mitotico e all'apoptosi indotti dal docetaxel. Questo articolo illustrerà questo metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli.

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo studiato gli effetti del docetaxel sulla dinamica dei microtubuli del normale (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente (MCF-7 TXT), le cellule del cancro al seno. Due serie di immagini mostrano gli effetti di docetaxel (0,5 mM) sulla crescita microtubuli e accorciamento in MCF-7 CC e MCF-7 TXT cellule (Figura 1A). Abbiamo in...

In questo articolo, riportiamo un protocollo che descrive un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel (MCF-7TXT). In questo metodo, viene utilizzato un sistema di imaging al microscopio a deconvoluzione per rilevare l'espressione della GFP-tubulina nelle cellule bersaglio.

Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare sull'instabilità dinamica dei microtubuli in condizioni fisiologiche e dopo vari trattamenti farmacologici. I principali vantaggi di questa tecnica sono che fornisce un protocollo semplice, affidabile e fisiologicamente applicabile per lo studio della dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi.Prima di iniziare la procedura, far crescere le cellule del cancro al seno in un terreno di coltura completo in piastre di coltura da 10 centimetri a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica al grado di confluenza appropriato. Il giorno prima dell'esperimento, sciacquare i vetrini di copertura in vetro rivestito di polietilene L-lisina da 24 millimetri con alcol al 70% ed esporre i vetrini ai raggi UV durante la notte. La mattina successiva, posizionare un vetrino di copertura in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Quindi lavare le colture con PBS e staccare le cellule in ogni piatto con 0,5 millilitri di tripsina EDTA. Quando le c

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Un modello murino sperimentale di metastasi ossee è stata fondata dopo la consegna intracardiaca di cellule tumorali che esprimono luciferasi mammarie. Sviluppo del tumore e ha portato lesione osteolitica sono stati monitorati longitudinalmente con bioluminescenza e micro-TC.

Monitoraggio metastasi tumorali e lesioni osteolitiche con bioluminescenza e Micro CT Imaging

L'imaging bioluminescenza di ipossia-inducibile fattore 1α attività è applicata a monitorare lo sviluppo del tumore ipossia cerebrale in un modello di cancro al seno del mouse metastasi al cervello.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

Si descrive un metodo per l'imaging di risposta...

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Utilizzando topi reporter transgenici ed etichette fluorescenti iniettabili, la microscopia confocale a disco rotante intravitale a lungo termine consente la visualizzazione diretta del comportamento delle cellule mieloidi nell'adenoma intestinale nel modello di cancro colorettale ApcMin/+.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in Apc Min / + Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Qui, descriviamo un metodo di microscopia time-lapse a lungo termine per tracciare longitudinalmente singole cellule in risposta a terapie antitumorali.

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

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Live-imaging della migrazione delle cellule epiteliali della mammella dopo lo svuotamento transitorio di TIP60

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Scopri come misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli in cellule di cancro al seno resistenti al docetaxel utilizzando la microscopia a deconvoluzione con GFP-tubulina. Questo metodo permette di studiare il comportamento dei microtubuli in vivo sotto trattamento farmacologico.

Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente

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