Immagini dal vivo per studiare Microtubulo instabilità dinamica nei tumori al seno taxani resistente
20 febbraio 2017
In questo articolo, riportiamo un protocollo che descrive un metodo in vivo per misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel (MCF-7TXT). In questo metodo, viene utilizzato un sistema di imaging al microscopio a deconvoluzione per rilevare l'espressione della GFP-tubulina nelle cellule bersaglio.
L'obiettivo generale di questo esperimento è misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule di carcinoma mammario resistenti al docetaxel. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare sull'instabilità dinamica dei microtubuli in condizioni fisiologiche e dopo vari trattamenti farmacologici. I principali vantaggi di questa tecnica sono che fornisce un protocollo semplice, affidabile e fisiologicamente applicabile per lo studio della dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi.
Prima di iniziare la procedura, far crescere le cellule del cancro al seno in un terreno di coltura completo in piastre di coltura da 10 centimetri a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica al grado di confluenza appropriato. Il giorno prima dell'esperimento, sciacquare i vetrini di copertura in vetro rivestito di polietilene L-lisina da 24 millimetri con alcol al 70% ed esporre i vetrini ai raggi UV durante la notte. La mattina successiva, posizionare un vetrino di copertura in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Quindi lavare le colture con PBS e staccare le cellule in ogni piatto con 0,5 millilitri di tripsina EDTA. Quando le cellule hanno iniziato a sollevarsi dal fondo della piastra, neutralizzare la tripsina con cinque millilitri di terreno di coltura fresco e contare le cellule. Quindi aggiungere circa una volta 10 le quinte cellule a ciascun vetrino coprioggetti, agitare delicatamente la piastra e rimettere le cellule nell'incubatrice per almeno 36 ore.
Per analizzare la dinamica dei microtubuli delle cellule, mescolare più volte la soluzione madre di alfa tubulina marcata con GFP mediante inversione per garantire una soluzione omogenea senza vortici. Quindi sostituire il terreno di coltura in ciascun pozzetto con due millilitri di terreno fresco contenente 40 microlitri di tubulina. Agitare delicatamente la piastra per consentire la miscelazione completa del marcatore con il terreno di coltura e rimettere la piastra nell'incubatore per altre 24 ore.
Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con un terreno fresco contenente docetaxel e rimettere la piastra nell'incubatore per 30 minuti. Mentre le cellule vengono inibite, accendere il microscopio a fluorescenza invertito e preriscaldare il supporto del campione a 37 gradi Celsius. Quindi selezionare la lente dell'obiettivo dell'olio 60X 1.42 NA e montare il primo vetrino coprioggetto sul supporto del campione.
Coprire il campione con un millilitro di terreno fresco contenente docetaxel a 37 gradi Celsius e individuare un gruppo di cellule piatte che mostrano un'elevata intensità di fluorescenza dell'alfa tubulina marcata GFP con strutture di microtubuli chiaramente visibili. Mettere a fuoco l'area periferica di una delle celle del cluster e impostare il tempo di esposizione appropriato nella frequenza di acquisizione dell'immagine. Esattamente 50 minuti dopo l'aggiunta della prima aliquota di docetaxel iniziare a registrare la dinamica dei microtubuli per due minuti, ottenendo una foto ogni due secondi.
Una volta acquisite tutte le immagini, acquisire l'immagine della cellula successiva come appena dimostrato, fino a quando non sono state acquisite le immagini per un totale di cinque cellule da tutti e tre i pozzetti di ciascuna concentrazione di docetaxel. Quando tutte le immagini sono state acquisite per ogni concentrazione di inibitore, aprire il programma di deconvoluzione, all'interno del sistema del microscopio e il processo di clic. Quindi, seleziona deconvolve e trascina il file immagine nella finestra di input.
Fare clic su Esegui per deconvolgere l'immagine e aprire il file dell'immagine deconvoluta all'interno del software del microscopio. Fare clic su File e salvare come filmato. Imposta il formato del filmato come AV e lo stile di animazione come avanti.
Imposta la qualità di compressione su 100% e la frequenza dei fotogrammi su cinque al secondo. Quindi seleziona la casella Anima nel tempo e fai clic su Fallo per generare il video. In questo esperimento rappresentativo, le cellule normali e resistenti al docetaxel sono state trattate con docetaxel e sono state sottoposte a imaging come appena dimostrato, ma gli effetti del trattamento sulla crescita e l'accorciamento dei microtubuli, sono più evidenti nelle cellule non resistenti al docetaxel.
Infatti, la misurazione del tasso di crescita e accorciamento dei microtubuli in condizioni di trattamento con docetaxel 0,5 micromolari rivela una forte inibizione della dinamica delle tubuline delle cellule parentali ma non resistenti al docetaxel. Una volta padroneggiato, l'intero processo può essere completato entro 60 ore se le tecniche vengono eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare celle piatte, con un'elevata intensità di fluorescenza della tubulina GFP, e di ridurre sia l'intensità della fluorescenza di eccitazione che la durata dell'esposizione per evitare lo sbiadimento della fluorescenza GFP.
Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e del cancro per valutare gli effetti di vari agenti mirati ai microtubuli sulle cellule normali e cancerose. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'instabilità dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi in una varietà di condizioni.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la misurazione dell'instabilità dinamica dei microtubuli in cellule tumorali del seno resistenti al docetaxel mediante microscopia a deconvoluzione. Il metodo si concentra sull'espressione della tubulina GFP in cellule vive, fornendo informazioni sul comportamento dei microtubuli in seguito al trattamento farmacologico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Ricerca sul cancro
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale nella struttura e nella funzione cellulare.
- La resistenza al docetaxel rappresenta una sfida significativa nel trattamento del cancro al seno.
- Comprendere la dinamica dei microtubuli può orientare le strategie terapeutiche.
- La tubulina GFP consente la visualizzazione in tempo reale del comportamento dei microtubuli.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per lo studio della dinamica dei microtubuli in cellule vive.
- Indagare gli effetti di trattamenti farmacologici sull'instabilità dei microtubuli.
- Migliorare la comprensione della biologia delle cellule tumorali.
Metodi Utilizzati
- Immagini in vivo dei microtubuli mediante microscopia a deconvoluzione.
- Coltura di cellule di cancro al seno resistenti al docetaxel (MCF-7 TXT).
- Espressione della tubulina-GFP per la visualizzazione.
- Preparazione di coprivetrini rivestiti con poli-L-lisina per l'adesione cellulare.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della dinamica dei microtubuli in cellule vive.
- Dimostrazione dell'instabilità dei microtubuli in risposta al trattamento farmacologico.
- Stabilimento di un protocollo applicabile a diversi tipi cellulari.
- Conoscenze sui meccanismi di resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per lo studio della dinamica dei microtubuli.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del comportamento delle cellule tumorali durante il trattamento.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo metodo per esplorare altre strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione dell'instabilità dinamica dei microtubuli in cellule tumorali vive fornisce un saggio fisiologicamente rilevante per valutare i meccanismi di resistenza agli agenti che bersagliano i microtubuli (MTA). Questo approccio consente la validazione del bersaglio collegando il comportamento dei microtubuli alla risposta al farmaco, supportando una previsione affidabile nella selezione preclinica di MTA. Il metodo aiuta a ridurre i rischi associati alle terapie a base di taxani identificando precocemente i fenotipi di resistenza durante la fase di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica quantificando le velocità di crescita e accorciamento dei microtubuli in seguito all'esposizione al docetaxel.
- Valore operativo: Utilizza l'espressione di tubulina marcata con GFP in cellule vive per consentire un'analisi in tempo reale e fisiologicamente rilevante, senza artefatti da fissazione.
- Valore predittivo: Distingue i fenotipi sensibili al docetaxel da quelli resistenti in base all'inibizione della dinamica dei microtubuli, supportando la valutazione dell'affidabilità del bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Stabilisce un protocollo standardizzato per misurare la dinamica dei microtubuli in cellule tumorali della mammella aderenti mediante microscopia di deconvoluzione.
- Output quantitativo: Genera dati in time-lapse che permettono di misurare le velocità di crescita e accorciamento dei microtubuli come letture funzionali.
- Applicazione per screening: Consente la valutazione degli effetti degli agenti che alterano i microtubuli (MTA) sull'instabilità dei microtubuli in cellule vive, facilitando lo screening di composti o genotipi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la resistenza ai taxani in cellule tumorali del seno derivate da MCF-7, riflettendo meccanismi di resistenza osservati clinicamente.
- Continuità traslazionale: Collega le alterazioni della dinamica dei microtubuli all'arresto mitotico indotto da docetaxel e alla resistenza all'apoptosi.
- Decisioni basate sul rischio: Permette l'identificazione precoce di fenotipi di resistenza, informando decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di sviluppo di agenti terapeutici mirati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, in particolare per agenti che agiscono sui microtubuli, in cui il meccanismo di resistenza è associato a modifiche della dinamica dei microtubuli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul comportamento dei microtubuli come determinante della risposta ai farmaci in cellule vive.
- Screening: Fornisce un sistema pronto all'uso per quantificare le variazioni dell'instabilità dei microtubuli in seguito a perturbazioni chimiche o genetiche.
- Analisi: Consente la misurazione delle velocità di crescita e accorciamento dei microtubuli come parametri quantitativi risolti nel tempo, utili per il confronto tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le misurazioni dell'instabilità dinamica a esiti funzionali come l'arresto mitotico e l'apoptosi in cellule resistenti rispetto a quelle sensibili.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile, applicabile a diverse classi di agenti antimicrotubulari e modelli cellulari oltre al carcinoma mammario resistente al docetaxel.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi collegando la dinamica dei microtubuli al fenotipo del farmaco in un contesto fisiologico.
- Valore operativo: Offre un protocollo affidabile e standardizzato per l'immagineggiamento di cellule vive, richiedendo un equipaggiamento specializzato minimo oltre al microscopio a fluorescenza.
- Valore strategico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella resistenza agli agenti antimitotici (MTA), consentendo una riduzione precoce dei rischi e un miglioramento dell'efficienza del capitale nei programmi oncologici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei candidati MTA in base al rischio identificando i meccanismi di resistenza prima degli studi in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive, nella microscopia a fluorescenza e nella biologia dei microtubuli.
- Presuppone l'accesso a un microscopio a fluorescenza invertito dotato di obiettivo ad immersione in olio, camera ambientale e software di deconvoluzione.
- Necessita della standardizzazione della semina cellulare, dell'espressione della tubulina-GFP e dei tempi di trattamento farmacologico tra diversi esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari, marcatori dei microtubuli o modalità di acquisizione delle immagini.
- È limitato dai rischi di fotodegradazione, che richiedono un attento controllo dell'intensità di eccitazione e della durata dell'esposizione, come indicato nel protocollo.
