Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire cellule tetraploidi proliferative, prive di una popolazione diploide, da fibroblasti umani normali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla cancerogenesi, come ad esempio il modo in cui le cellule aneuploidi si sviluppano nelle prime fasi della carcinogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule tetraploidi proliferative, prive di una popolazione diploide, possono essere stabilite con procedure relativamente semplici.

Mentre alcuni ceppi diventano completamente tetraploidi con un semplice trattamento con veleno per fuso, la demecolcina, la maggior parte deve essere maneggiata con il metodo dello shake-off durante quel trattamento per emulare una popolazione diploide. Per iniziare l'induzione della tetraploidia senza il metodo shake-off, passare circa cinque volte 10 alle cellule coltivate in 1/5 in un piatto da 100 millimetri. Incubare la capsula in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Successivamente, trattare le cellule in crescita esponenziale con un terreno contenente 0,1 microgrammi per millilitro di CC Incubare in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Quindi sostituire il terreno contenente DC con un terreno privo di farmaci. Incubare in anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius fino alla ripresa della proliferazione.

Per indurre la tetraploidia utilizzando il metodo dello shake-off, far passare le cellule coltivate in fiasche T-75, assicurandosi che ogni fiaschetta contenga almeno una volta da 10 a 1/6 di cellule. Incubare i palloni in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, trattare le cellule con terreno contenente DC per 16-18 ore per arrestarle in mitosi come indicato nel protocollo di testo.

Dopo l'incubazione, controllare le cellule in un matraccio al microscopio a contrasto di fase invertito. E poi agitare delicatamente ogni pallone per iniziare la raccolta di cellule mitotiche a debole aderenza. Evitare una manipolazione negligente, come scuotere violentemente o toccare la superficie del pallone con la punta della pipetta.

Non contaminare le cellule mitotiche con cellule di interfaccia aderenti. Lavare delicatamente i palloni con un terreno caldo e trasferire le celle nelle provette da centrifuga. Utilizza un contatore di celle atomiche per contare il numero di celle.

Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare a 300 volte g per cinque minuti. Riseminare le cellule mitotiche raccolte in piastre di coltura da 16 millimetri. Quindi trattare le cellule piastrate con un terreno contenente 0,1 microgrammi per millilitro di CC Incubare in anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per tre giorni.

Successivamente, sostituire il terreno contenente CC con un terreno privo di farmaci. Incubare in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius fino alla ripresa della proliferazione. Per l'analisi della ploidia del DNA, lavare le cellule con PBS.

Quindi aggiungere alle cellule una soluzione contenente lo 0,05% di tripsina e lo 0,02% di EDTA. Incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.

E neutralizzare la tripsina aggiungendo un terreno contenente il 10% di siero fetale bovino. Centrifugare le cellule in terreno a 300 volte g per cinque minuti. Risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS.

Quindi centrifugare nuovamente a 300 volte g per cinque minuti. Quindi, risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Aggiungere quattro millilitri di etanolo al 100% goccia a goccia mescolando.

Lasciare riposare la sospensione a temperatura ambiente per 30 minuti per fissare le cellule. Successivamente, centrifugare le cellule in soluzione fissativa a 300 volte g per cinque minuti. E risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS.

Centrifugare la sospensione a 300 volte g per cinque minuti. Quindi trattare le cellule con 475 microlitri di soluzione di RNA da 0,5 milligrammi per millilitro. Aggiungere 25 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di iodio propidio per colorare le cellule.

E poi mescolare. Lasciare riposare la sospensione a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, utilizzare un citometro a flusso con un laser a 488 nanometri e un filtro di emissione a canale rosso per analizzare il contenuto di DNA delle cellule.

Analizza anche un campione di riferimento preparato da cellule diploidi autentiche per valutare la ploidia delle cellule bersaglio. Per iniziare, trattare le cellule a crescita esponenziale con terreno contenente 0,1 microgrammi per millilitro di DC per quattro ore per arrestare le cellule in metafase. Successivamente, raccogliere almeno cinque volte 10 su 1/5 di cellule mediante tripsinizzazione.

Sospendere le cellule raccolte in un terreno contenente FBS. Centrifugare la sospensione a 300 volte g per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di una soluzione di cloruro di potassio 0,075 molari.

Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare la sospensione a 300 volte g per cinque minuti. Risospendere le cellule in cinque millilitri di fissativo di Carnoy.

E poi centrifugare la sospensione a 300 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di fissativo di Carnoy. Far cadere 30 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino.

Infine, colora e analizza le cellule tramite la conta cromosomica o l'analisi del cariotipo. In questo studio, le cellule tetraploidi proliferative, prive di una popolazione diploide, sono coltivate da fibroblasti umani normali. Sebbene alcuni ceppi cellulari possano diventare completamente tetraploidi a causa del trattamento continuo con DC, la maggior parte delle cellule deve essere trattata con il metodo shake-off durante il corso del trattamento DC per eliminare una popolazione diploide.

I risultati rappresentativi per l'induzione della tetraploidia in tre ceppi di fibroblasti sono mostrati qui. Il ceppo TIG-1 diventa quasi interamente tetraploide attraverso un semplice trattamento continuo con DC.Tuttavia, questo trattamento fa sì che i ceppi BJ e TIG-hT diventino una miscela di popolazioni diploidi e tetrapodi. Pertanto, durante il processo di trattamento è necessario isolare le cellule mitotiche con il metodo dello shake-off.

La conta cromosomica viene eseguita nelle cellule tetraploidi stabilite. Come si può vedere, il numero di cromosomi modali è 92 sia per le cellule TIG-1 che per quelle BJ e 91 per le cellule TIG-hT. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di agitare delicatamente i palloni nella fase di shake-off, per non causare la contaminazione delle cellule mitotiche da parte di cellule di interfaccia aderenti.