Name: Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri come stabilire cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani non trasformati usando demecolcina e il metodo shake-off. Questa tecnica semplice facilita la ricerca sulla carcinogenesi e l'instabilità cromosomica.

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Ringraziamo la signora Matsumoto per l'assistenza tecnica.

Cultura 1. cellulare <ol><li> Ottenere le cellule per indurre tetraploidia. Fino ad oggi è stato confermato che questa tecnica può essere applicata alle linee cellulari di fibroblasti umani TIG-1, BJ, IMR-90 e telomerasi immortalizzate TIG-1 (TIG-HT). </li><li> Crescere le cellule in terreno minimo essenziale con modificazione α o qualsiasi altro mezzo di coltura cellulare adatto per il tipo di cellula da studiare supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) incubando in un 5% (v / v) di CO 2 nell&#39;atmosfera a 37 ° C. cellule di passaggio ogni 3 o 4 giorni di non superare la densità subconfluenti. NOTA: livello di raddoppio della popolazione (PDL) deve essere calcolato di volta in volta a passaging per valutare la crescita delle cellule e l&#39;età delle cellule. PDL può essere calcolato dal numero di cellule seminate in una piastra (N1) e il numero di cellule raccolte al successivo passaging (N2) mediante la seguente formula (X è l&#39;iniziale PDL). PDL = X + (log N1 - N2 log) / log 2 </li></ol> 2. Induzione e Establishment di cellule tetraploidi da diploidi fibroblasti <ol><li> Indurre tetraploidia senza shake-off. NOTA: Alcuni ceppi di cellule (ad esempio TIG-1) può diventare quasi completamente tetraploide dal trattamento continuo con demecolcine (DC) come segue. <ol><li> cellule passaggio nella uno o due piatti di 100 mm il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Di solito, preparare 5 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule per piatto per l&#39;induzione delle cellule tetraploidi. </li><li> Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 4 giorni. </li><li> Sostituire DC contenenti media con terreno privo di droga e incubare cellule in un 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Le cellule di solito riprendono proliferazione entro 1 settimana. </li></ol></li><li> Indurre tetraploidia con shake-off. NOTA: La maggior parte delle cellule diventano una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi come risultato del semplice trattamento con DC sopra descritto (2.1). Pertanto, alcune modifiche della pROCEDURA per eliminare sono necessarie una popolazione diploide come segue (Figura 1). <ol><li> cellule Passage in diverse T75 Borraccie il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Solitamente, preparare almeno 5 x 10 6 cellule (1 x 10 6 cellule per pallone) per l&#39;induzione di cellule tetraploidi. </li><li> Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 16 - 18 h per arrestare le cellule in mitosi. Il tempo necessario per arrestare le cellule in mitosi può dipendere da cellule bersaglio e deve essere determinato da esperimenti preliminari per ottenere il maggior numero di cellule in mitosi possibile. Ad esempio, le cellule che crescono più lenti devono essere trattati con DC per un tempo più lungo di cellule in crescita più veloce. NOTA: Se le cellule vengono trattate per troppo tempo in questa fase, potrebbero subire lo slittamento mitotico e aderire alla superficie piatto, rendendo impossibile per raccogliere le cellule in mitosi di shake-off nella fase successiva. </li><li> Raccogliere le cellule in mitosi DC-arrestati con il metodo shake-off, in which cellule mitotiche liberamente aderito sono raccolti da un leggero scuotimento di flaconi e lavaggio con media seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Contare il numero di cellule in modo appropriato in questa fase. </li><li> Reseed cellule mitotiche raccolti in capsule di Petri da 60 mm e il trattamento di cellule con 0,1 mg / ml DC per altri 3 giorni. Seed più di 1 x 10 6 cellule mitotiche per piatto, perché meno del 10% delle cellule può sopravvivere a questo trattamento. </li><li> Sostituire DC contenenti media con media libera dalla droga e aspettare che le cellule a riprendere la proliferazione, che di solito si verifica entro 1 settimana. </li></ol></li><li> cellule di passaggio in modo simile alle cellule diploidi originali. </li></ol> 3. Esame del DNA Ploidia NOTA: Questa è una procedura consolidata e un manuale tecnico deve essere affidata a procedure dettagliate e suggerimenti tecnici. <ol><li> Celle di raccolta (5 x 10 5 - 1 x 10 6) dalle cellule incubazione con una soluzione concontenente 0,05% tripsina e 0,02% EDTA per 10 min a 37 ° C, e neutralizzare tripsina da medium contenente 10% FBS. </li><li> Centrifugare le cellule a medio e lavarli risospendendo in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). </li><li> Preparare cellule per analisi del DNA da uno dei seguenti due metodi <ol><li> Un metodo per analizzare le cellule non fissate 10 NOTA: Questo metodo può essere eseguita utilizzando un kit disponibile in commercio per l&#39;analisi del ciclo cellulare. I campioni preparati con questo metodo dovrebbero essere analizzati immediatamente, perché le cellule non sono fissi nella procedura e colorate nuclei diventeranno danneggiato nel corso del tempo. <ol><li> Lavare le cellule con 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio. Successivamente il trattamento di cellule con 250 ml di 0,1% (v / v) Nonidet P40 e 30 mg / ml di tripsina in 200 ml di 40 mM tampone citrato contenente 250 mM di saccarosio per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 200 ml di 0,5 mg / ml inh tripsinacellule ibitor e 0,1 mg / ml RNasi A a 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 200 ml di 0,4 mg / ml di ioduro di propidio (PI) in tampone citrato 40mM, contenente 250 mM di saccarosio, e incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente per colorare nuclei cellulari. </li></ol></li><li> Un metodo per analizzare cellule fissate <ol><li> Fissare le cellule con 80% etanolo sospendendo cellule in 1 ml di PBS, aggiungere 4 ml di EtOH 100% goccia a goccia sotto agitazione la sospensione cellulare e lasciandolo a temperatura ambiente per 30 min. Le cellule in questo fissativo possono essere conservati a -20 ° C per diverse settimane. </li><li> Lavare le cellule da essi risospendere in 5 ml di PBS seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Trattare cellule con 0,5 mg / ml RNasi A e macchiare con 50 ug / ml di ioduro di propidio (PI) (475 ml di 0,5 mg / ml RNasi A e 25 ml di 1 mg / mL PI) per 30 min a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol></li><li> Analizzare contenuto di DNA di tegli cellule utilizzando un citofluorimetro con un laser 488 nm e filtro del canale rosso (passare lungo&gt; 610 nm). Analizzare un campione di riferimento preparata da cellule diploidi originali allo stesso tempo di valutare ploidia delle cellule bersaglio. <ol><li> In alternativa, aggiungere perline standard di fluorescenza per valutare il rapporto tra intensità di fluorescenza delle cellule diploidi contro le perline. Utilizzare il &#39;altezza degli impulsi di larghezza di impulso contro&#39; opzione del citofluorimetro di discriminare tra cellule tetraploide singole e gruppi di cellule diploidi 11. </li></ol></li></ol> 4. Esame dei Conti cromosomiche e analisi del cariotipo NOTA: Queste sono tutte le procedure consolidate e un manuale tecnico o di protocolli del produttore dovrebbero essere indicati per le procedure dettagliate e suggerimenti tecnici. <ol><li> Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con 0,1 mg / ml DC per 4 ore per arrestare le cellule in metafase. </li><li> Preparare vetrini cromosomiche. <ol><li&gt; Celle di raccolta (almeno 5 x 10 5 cellule) per tripsinizzazione e sospendere in mezzo contenente FBS. </li><li> Centrifugare le cellule in terreno (300 xg, 5 min) e trattare con soluzione ipotonica (5 mL di 0,075 M KCl) a 37 ° C per 10 min. </li><li> Fissare e di sospendere le cellule in fissativo di Carnoy (metanolo: acido acetico = 3: 1). </li><li> Stendere le cellule su un vetrino facendo cadere un piccolo volume (25 - 35 ml) di sospensione cellulare. potrebbero essere necessarie misure aggiuntive, come l&#39;esposizione al vapore caldo per migliorare cromosoma diffusione. </li></ol></li><li> Cellule colorare per i conteggi cromosomici o analisi del cariotipo o multicolore ibridazione in situ fluorescente (mFISH). <ol><li> conta cromosomiche. <ol><li> cellule macchia con soluzione Giemsa 5% (o 5 mg / mL PI contenente 0,5 mg / ml RNasi A per microscopia a fluorescenza) per 15 - 20 min. </li><li> fotografare digitalmente almeno 50 cellule in metafase. </li><li> Contare il numero dei cromosomi per cella utilizzando un softwa analisi delle immaginire dopo la separazione manuale di toccare e sovrapponendo i cromosomi utilizzando un software di fotoritocco. Anche se il numero dei cromosomi può essere segnata manualmente, si consiglia di punteggio computerizzato. </li></ol></li><li> analisi del cariotipo NOTA: Questa analisi deve essere eseguita da un tecnico qualificato o di una società di professionisti. <ol><li> Cellule Stain secondo una tecnica G-banding standard di 12. </li><li> Analizzare i cromosomi per fare karyograms standard da 12. </li></ol></li><li> mFISH NOTA: Questo passaggio è facoltativo e dovrebbe essere eseguita se necessario. <ol><li> Cellule macchia con sonde FISH multicolore di cromosomi umani secondo il protocollo 13 del produttore. </li><li> Analizzare i cromosomi utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri idonei e di un software per l&#39;analisi mFISH 13. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rabinovitch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+progression+in+Barrett%27s+esophagus+III%3A+baseline+flow+cytometric+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables.</a> Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).</li>
<li>Galipeau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+modulate+CDKN2A%2C+TP53%2C+and+DNA+content+risk+for+progression+to+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma.</a> PLoS Med. 4 (2), e67(2007).</li>
<li>Olaharski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploidy+and+chromosomal+instability+are+early+events+during+cervical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-independent+abrogation+of+a+postmitotic+checkpoint+contributes+to+human+papillomavirus+E6-induced+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy.</a> Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+and+consequences+of+polyploidy+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Fox, D., Duronio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreplication+and+polyploidy%3A+insights+into+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease.</a> Development. 140, 3-12 (2013).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437, 1043-1047 (2005).</li>
<li>Ganem, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+triggers+hippo+tumor+suppressor+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation.</a> Cell. 158 (4), 833-848 (2014).</li>
<li>Kuznetsova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).</li>
<li>Vindeløv, L., Christensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+and+proteolytic+enzyme-based+techniques+for+nuclear+isolation+and+DNA+content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Juan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+measurement+for+DNA+ploidy+and+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.</a> Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).</li>
<li>Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+guidelines+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis guidelines preliminary report.</a> Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).</li>
<li>Liehr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+FISH+probe+sets+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Multicolor FISH probe sets and their applications.</a> Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bipolar+spindles+with+two+centrosomes+in+tetraploid+cells+established+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts.</a> Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts.</a> Front. Oncol. 3, 198(2013).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+telomerase-immortalized+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosome+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts.</a> Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).</li>
<li>Di Leonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rereplication+in+the+presence+of+mitotic+spindle+inhibitors+in+human+and+mouse+fibroblasts+lacking+either+p53+or+pRb+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function.</a> Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).</li>
<li>Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+state+induces+p53-dependent+arrest+of+nontransformed+mammalian+cells+in+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+of+the+mitotic+spindle+assembly+checkpoint+with+p53+to+prevent+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy.</a> Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).</li>
<li>Aylon, Y., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+Guardian+of+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">p53: Guardian of ploidy.</a> Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).</li>
<li>Uetake, Y., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+after+cleavage+failure+%3A+mammalian+somatic+cells+do+not+possess+a+%26%2334%3Btetraploidy+checkpoint%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a &#34;tetraploidy checkpoint&#34.</a> J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).</li>
<li>Ganem, N., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+proliferation+of+polyploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting the proliferation of polyploid cells.</a> Cell. 131, 437-440 (2007).</li>
<li>Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+p53+for+maintaining+chromosomal+stability+during+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization.</a> Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Un grave problema nel induzione di tetraploidia da cellule diploidi di agenti chimici, sia da inibitori Citochinesi o con inibitori del fuso, è che le cellule diventano spesso un miscuglio di popolazioni diploidi e tetraploidi, e le cellule tetraploidi devono essere separati dalle cellule diploidi. approcci più comuni per l&#39;isolamento di una popolazione tetraploide privo di cellule diploidi utilizzano FACS o clonazione, limitando la diluizione. Tuttavia, queste procedure sono laboriosa e non facile da eseguire. In q...

Poliploidia è stata osservata non solo in tessuti specializzati di specie di mammiferi, ma anche in una varietà di condizioni patologiche, come il cancro e malattie degenerative. Poliploidi (per lo più tetraploide), le cellule sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche di tessuti umani, come l&#39;esofago 1,2 o squamose lesioni intraepiteliali di Barrett della cervice 3,4, e sono stati considerati per essere la fonte di cellule aneuploidi maligne in quei tessuti 5 , 6. Sebbene si suggerisce che la conversione di tetraploide di cellule aneuploidi potrebbe essere un evento cruciale nelle prime fasi della tumorigenesi, i meccanismi coinvolti in questo processo non sono pienamente compresi. Questo in parte perché nessun modello in vitro è stato disponibile dove non trasformate cellule umane poliploidi possono propagarsi. Alcuni ricercatori hanno indotto tetraploidia in cellule epiteliali umane non trasformate attraverso la generazione di cellule binucleate di inhibiting cytokinesis 7-9. In questo metodo, tuttavia, le cellule diploidi inutili devono essere eliminate mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 7,8 o la clonazione limitando la diluizione 9. Dato che queste procedure sono laboriose e non facile da eseguire, i metodi più semplici per stabilire le cellule non trasformate tetraploide si desiderano per la ricerca in questo campo. Nella presente relazione, si descrive un protocollo per stabilire le cellule proliferative tetraploide da fibroblasti umani normali o fibroblasti umani telomerasi-immortalata da procedure relativamente semplici. Le procedure vengono utilizzate mandrino veleno demecolcine (DC) per arrestare le cellule diploidi in mitosi, e le cellule mitotiche raccolti da scrollarsi di dosso sono ulteriormente trattati con DC. cellule mitotiche diploidi trattate con corrente continua per tempo prolungato convertire in cellule G1 tetraploide, e queste cellule proliferano le cellule come tetraploide dopo l&#39;arresto della crescita per diversi giorni dopo la rimozione di droga. Questo protocollo prevedeun metodo efficiente per la creazione di un modello utile per studiare la relazione tra il cromosoma instabilità e il potenziale oncogeno di cellule umane poliploidi.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di demecolina (10 &mu; g/mL in HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD CycleTES Plus Kit di reagenti DNA BD</td><td>Biosciences</td><td>#340242</td><td>Per l'esame della ploidia del DNA mediante citometria a flusso</td></tr><tr><td>Sonda FISH multicolore per cromosomi umani 24XCyte</td><td>MetaSystems</td><td>#D-0125-060-DI</td><td>Sono necessari un set di filtri specializzati e un software per l'analisi mFISH</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Isis con software mFISH&nbsp;</td>È <td>necessario un kit di sonde specializzato</td> <td>MetaSystems</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Le cellule poliploidi (per lo più tetraploidi) sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche dei tessuti umani e la loro instabilità cromosomica è stata considerata responsabile della carcinogenesi in tali tessuti. Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, la creazione di tali cellule da cellule umane non trasformate è piuttosto impegnativa. L'induzione della tetraploidia da parte di agenti chimici di solito si traduce in una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi, e la maggior parte degli studi ha impiegato la selezione o il clonaggio cellulare attivato dalla fluorescenza limitando la diluizione per separare le cellule tetraploidi da quelle diploidi. Tuttavia, queste procedure richiedono tempo e laboriose. Il presente rapporto descrive un protocollo relativamente semplice per indurre cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali con una contaminazione minima da parte di cellule diploidi. In breve, il protocollo comprende le seguenti fasi: arresto delle cellule in mitosi mediante demecolcina (DC), raccolta di cellule mitotiche dopo averlo scosso, incubazione delle cellule raccolte con DC per altri 3 giorni e incubazione delle cellule in terreno privo di farmaci (riprendono la proliferazione come cellule tetraploidi entro diversi giorni). A seconda del tipo di cellula, la raccolta delle cellule mitotiche mediante scrollandosi potrebbe essere omessa. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e fattibile per stabilire cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali. Le cellule tetraploidi stabilite con questo metodo potrebbero essere un modello utile per studiare l'instabilità cromosomica e il potenziale oncogenico delle cellule umane poliploidi.

Nella nostra esperienza, cellule TIG-1 possono essere realizzati quasi completamente tetraploid per semplice trattamento continuo con 0,1 mg / mL DC per 4 giorni (Figura 2A). Al contrario, altri ceppi di fibroblasti, come BJ o IMR-90, e le cellule TIG-HT, è diventato una miscela di diploide e popolazioni tetraploidi seguito lo stesso trattamento, e l&#39;isolamento di cellule mitotiche con il metodo shake-off è necessario durante il corso di trattamento DC (di solito 16 ...

Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, creare tali cellule da cellule umane non trasformate non è facile. Il presente rapporto descrive procedure relativamente semplici per stabilire cellule tetraploidi proliferative prive di una popolazione diploide da fibroblasti umani normali.

Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire cellule tetraploidi proliferative, prive di una popolazione diploide, da fibroblasti umani normali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla cancerogenesi, come ad esempio il modo in cui le cellule aneuploidi si sviluppano nelle prime fasi della carcinogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule tetraploidi proliferative, prive di una popolazione diploide, possono essere stabilite con procedure relativamente semplici.Mentre alcuni ceppi diventano completamente tetraploidi con un semplice trattamento con veleno per fuso, la demecolcina, la maggior parte deve essere maneggiata con il metodo dello shake-off durante quel trattamento per emulare una popolazione diploide. Per iniziare l'induzione della tetraploidia senza il metodo shake-off, passare circa cinque volte 10 alle cellule coltivate in 1/5 in un piatto da 100 millimetri. Incubare la capsula in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 24 ore.Successivamente, trattare le cellule in crescita esponenziale con un terreno contenente 0,1 microgrammi per millilitro di CC Incubare in

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Biologia dello sviluppo

Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Carcinoma associato fibroblasti (CAF), ricco di miofibroblasti presenti nello stroma del tumore, svolgono un ruolo importante nel guidare la progressione del tumore. Abbiamo sviluppato un tumore modello coimplantation xengraft per generare sperimentalmente CAF da fibroblasti umani mammaria. Il protocollo descrive come stabilire miofibroblasti CAF che acquisiscono la capacità di promuovere la tumorigenesi.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Qui descriviamo un metodo clinicamente rilevante, ad alta efficienza e privo di alimentatore per riprogrammare i fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando modificate mRNA che codificano per fattori di riprogrammazione e maturo microRNA-367/302 imita. Sono inoltre inclusi metodi per valutare l'efficienza di riprogrammazione, espandere le colonie clonali iPSC e confermare l'espressione del marcatore pluripotenza TRA-1-60.

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

In questo articolo viene descritto un metodo per generare un metodo per generare un sistema di cocoltura indotto da cellule staminali indotto specifico dell'antigene del tumore funzionale, cd8- singole cellule T positive utilizzando il sistema di co-coltura OP9/DLL1.

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

Questo protocollo dimostra l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti dermici umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione GATA2, GFI1B e FOS per generare cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Scopri come stabilire cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani non trasformati usando demecolcina e il metodo shake-off. Questa tecnica semplice facilita la ricerca sulla carcinogenesi e l'instabilità cromosomica.

Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

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