Name: Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri come preparare nanosensori a fluorescenza nell'infrarosso vicino usando nanotubi di carbonio a parete singola funzionalizzati con polimeri anfifilici e DNA. Questo metodo consente il rilevamento di molecole come la dopamina nei tessuti viventi.

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Questo lavoro è stato supportato dal Burroughs Wellcome Fund Career Award presso la Scientific Interface (CASI), da una sovvenzione della Simons Foundation e da una sovvenzione per giovani ricercatori della Brain and Behavior Research Foundation.

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (SDS) prima dell&#39;uso. I nanomateriali possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte materiale sfuso. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate, tra cui i controlli tecnici (cappa aspirante, custodia rumore) e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, occhiali di protezione, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe). 1. Preparazione del tampone, tensioattivo, e Polymer Solutions <ol><li> Preparazione della soluzione 100 mM NaCl <ol><li> Sciogliere 584 mg di NaCl in 80 mL di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparazione di 3% dodecil solfato di sodio soluzione (SDS) <ol><li> Sciogliere 3 g di SDS in 80 ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparazione di colato di sodio 2% di soluzione (SC) <ol><li> Sciogliere 2 g di SODIUM cholate idrato in 80 ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL. </li></ol></li><li> Preparazione di tampone di immagini (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl) <ol><li> Sciogliere 22.23 g di Tris base e 58,44 g di NaCl in 500 ml di acqua deionizzata utilizzando un ancoretta magnetica e piatto. </li><li> Aggiungere con cautela HCl concentrato fino a raggiungere un pH di 8,1. </li><li> Aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume finale di 1 L. </li></ol></li><li> Sintesi di polimero RITC-PEG-RITC <ol><li> Sciogliere ammina difunctionalized polietilene glicole (PEG) (5 kDa o 20 kDa, 0,1 mol / L) e rodamina isotiocianato (RITC, 0,2 mol / L) in 1 mL di una miscela 1: 1 di diclorometano e dimetilformammide (DMF). </li><li> Aggiungere 0,2 mol / L di N, N -diisopropylethylamine (DIEA). </li><li> Dopo 3 h, precipitato con 10x volume di etere etilico seguita da filtrazione sotto vuoto. </li><li> Riprendere in DMF e ripetere l&#39;etere Follo precipitazionisposare per filtrazione a vuoto. NOTA: Altre molecole modificate isotiocianato (ad esempio, isotiocianato di fluorescina, FITC) possono essere collegati a PEG o altri polimeri ammine modificata utilizzando un metodo simile. </li></ol></li><li> Preparazione di pegilato-DNA (PEG-DNA) <ol><li> Combinate 100 ml di Tris (2-carbossietil) soluzione di fosfina cloridrato (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) con 44,9 ml di 5&#39;-tiolo-modificato il DNA (1 mg / 10 ml in 0,1 M NaCl) e aggiungere a 4.855 ml di acqua deionizzata. </li><li> Mescolare per 1 h. </li><li> Sciogliere 500 mg di metossipolietilen glicole maleimmide in 5 mL di tampone fosfato. </li><li> Combinare soluzioni di DNA e PEG (10 ml totale) e mescolare per 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di Single Walled Nanotubi di carbonio (SWNT) Sospensioni <ol><li> Wash di SWNTs per rimuovere catalizzatore e le impurità. <ol><li> Aggiungere 200-300 mg di SWNTs non lavati in un Conta provetta di plasticaining 45 ml di acqua deionizzata. </li><li> Vortex la soluzione per 2 minuti e sonicare utilizzando un bagno sonicatore per 5 min. Notare che sonicatore impostazioni variano da uno strumento all&#39;altro, in modo da verificare che la densità ottica dei SWNT aumenti soluzione (cioè, diventa nero) per assicurare che i SWNTs vengono dispersi. </li><li> Centrifugare la soluzione per 20 minuti a 16.100 xg e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere circa 45 ml di acqua fresca deionizzata. </li><li> Ripetere i punti 2.1.2-2.1.4 fino a 8 volte. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua il più possibile facendo attenzione a non disturbare SWNTs pellettato e consentire SWNT pellet asciugare all&#39;aria. </li></ol></li><li> Sospensioni degli acidi nucleici di SWNTs <ol><li> Sciogliere acidi nucleici (NA) in 0,1 M NaCl ad una concentrazione di 100 mg / mL. </li><li> Rimuovere l&#39;elettricità statica spatola monouso, provette da microcentrifuga e SWNT magazzino utilizzando una pistola antistatico. In una cappa aspirante, aggiungere 20 ml di soluzione di NA di 980 ml di 0.1 M NaCl seguita dalla aggiunta di 1 mg SWNTs. </li><li> Utilizzando un ultrasonicatore con punta 3 mm di diametro, sonicare la soluzione per 10 min a 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. </li><li> Centrifugare la soluzione di DNA-SWNT DUE VOLTE per 90 min a 16.100 x g. Se si utilizza PEG-DNA, purificare in eccesso e il DNA non reagito e PEG utilizzando uno spin-filtro di 100 kDa. Aggiungere abbastanza PBS per riempire lo spin-filtro e far girare a 9.300 g per 1,5 min, ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte. </li><li> Raccogliere e conservare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente fasci CNT e aggregati. Eliminare il pellet in conformità con le procedure di rifiuti pericolosi istituzionali appropriate per i nanomateriali. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza soluzione a 632 nm usando un UV / Vis spettrofotometro per determinare la concentrazione approssimativa di SWNTs sospesi con ε = 0.036 L / cm · mg in accordo con la legge di Lambert-Beer e il fattore di diluizione appropriata. </li></ol></li><li> Sospensioni polimeri anfifilicidi SWNTs <ol><li> Rimuovere l&#39;elettricità statica spatola monouso, provette da centrifuga micro e SWNT magazzino. In una cappa aspirante, aggiungere 5 mg SWNTs a 5 ml di soluzione SC 2% (in alternativa, soluzione di SDS può essere utilizzato). </li><li> Utilizzando un ultrasonicatore con punta di diametro 6 mm, sonicare la soluzione per 1 ora a 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. </li><li> campione centrifugare a 150.000 xg per 4 h utilizzando un&#39;ultracentrifuga e raccogliere accuratamente surnatante. </li><li> Sciogliere 1% in peso di polimero amfifilico (ad esempio, RITC-PEG-RITC) in soluzione SC-SWNT. </li><li> Dializzare soluzione polimerica-SC-SWNT utilizzando una membrana di dialisi 3,5 kDa contro 1 L di acqua deionizzata o tampone per 5 giorni. Cambiare l&#39;acqua o buffer dopo un&#39;ora e 2 ore 4. Una membrana di dialisi più grande può essere utilizzato, purché permette la rimozione del tensioattivo di scelta, ma di mantenimento sia della SWNT e polimero amfifilico. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza soluzione a 632 nm usando un UV / Vis spettrofotometro per determinareconcentrazione approssimativa di SWNTs sospesi con ε = 0.036 L / cm * mg in accordo con la legge di Lambert-Beer e il fattore di diluizione appropriata. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione della superficie Immobilizzato sensori SWNT <ol><li> Preparazione di BSA-biotina e soluzioni di riserva neutravidina <ol><li> Sciogliere 10 mg liofilizzato BSA-biotina in 1 ml di acqua deionizzata per fare un / ml soluzione madre di 10 mg e conservare a 4 ° C. </li><li> Sciogliere 10 mg neutravidina proteine ​​(NAV, deglicosilata proteina avidina) in 2 ml di acqua deionizzata per fare un / magazzino soluzione 5 mg ml. aliquote conservare a -20 ° C. aliquote scongelati possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare BSA-biotina vetrini da microscopio rivestito <ol><li> Pulire un vetrino da microscopio ed allo 0,17 millimetri di vetro di copertura (o come appropriato per l&#39;obiettivo microscopio) con acqua deionizzata, seguito da metanolo, acetone e un risciacquo finale di acqua deionizzata. </li><li&gt; Crea canali mettendo alcuni pezzi di nastro biadesivo circa 5 mm sul vetrino da microscopio pulito. Sigillare i canali prendendo un coprioggetto vetro lungo e premendolo sulla parte superiore del nastro biadesivo. Assicurarsi che sia centrato sul vetrino da microscopio in modo che i bordi del vetrino e scivolo non sono a filo. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione BSA-biotina a 900 microlitri di buffer di 1x Tris ad una concentrazione finale di 1 mg / mL. </li><li> Flusso 50 ml della soluzione di BSA-biotina nel canale pipettando la soluzione in una estremità e che la migrazione di distanza soluzione all&#39;altro usando un tessuto. Incubare per 5 minuti seguita da 3-5 vampate con 50 ml di 0,1 M NaCl. </li><li> Diluire 40 ml di 5 mg / ml NAV magazzino in 960 microlitri di buffer 1x Tris ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. </li><li> Flusso 50 microlitri della soluzione VPN nel canale pipettando la soluzione in una estremità e che la migrazione di distanza soluzione all&#39;altro usando un tessuto. Incubare per 2-5 minutiseguiti da 3-5 vampate con 50 ml di 0,1 M NaCl. </li><li> Diluire le soluzioni stock di SWNTs sospese in tampone di imaging ad una concentrazione di 1-10 mg / L e di flusso 50 microlitri della soluzione nel canale e incubare per 5 min. </li><li> Delicatamente lavare via SWNTs eccesso con 50 ml di tampone di imaging. </li></ol></li><li> Preparazione di APTES silanizzata vetrini da microscopio NOTA: APTES silanizzazione diapositive permettono un modo per immobilizzare SWNTs DNA avvolto carica negativa sulla superficie di un substrato di vetro. <ol><li> Preparare una soluzione al 10% di (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) in etanolo. </li><li> Utilizzando i canali realizzati con la procedura descritta in 3.2.2, il flusso in 100 microlitri di buffer di 1x Tris. </li><li> Lavare il canale con soluzione APTES e incubare per 5 min. Lavare con tampone 1x Tris. </li><li> Diluire le soluzioni madre delle sospesi DNA SWNTs nel buffer di imaging per una concentrazione di flusso / Terra 1-10 mg 50 ml di soluzione nel canale e incubmangiato per 5 min. </li><li> Delicatamente lavare via SWNTs eccesso con 50 ml di tampone di imaging. </li></ol></li></ol> 4. spettroscopia di fluorescenza e microscopia di SWNT Sensori <ol><li> Nir microscopia a fluorescenza <ol><li> Eseguire l&#39;imaging di SWNTs immobilizzati superficie con eccitazione laser e un microscopio invertito dotato di una matrice di sensori InGaAs per l&#39;imaging. </li><li> Dirigere il raggio laser ad entrare nel porto di illuminazione posteriore di un microscopio invertito utilizzando specchi su supporti regolabili cinematiche e un paio di iridi post-montato impostati per l&#39;altezza della porta. Assicurarsi che il fascio sia in piano e rettilineo confermando che passa attraverso entrambi iridi quando posto tra gli specchi successivi e prima che entri porta illuminazione. Se necessario, regolare l&#39;altezza del fascio con un gruppo di periscopio. Rimuovere eventuali filtri di calore passa-corto sulla porta di illuminazione che attenuare il fascio. </li><li> Inserire un cubetto di filtro appropriato nel microscopioper riflettere la luce di eccitazione nell&#39;obiettivo e raccogliere la luce di emissione. Questo tipicamente costituito da un filtro dicroico passaggio lungo con un cutoff sopra la lunghezza d&#39;onda di eccitazione, (ad esempio, 750 LP) ed un filtro lungo in emissione (ad esempio, 850 LP) per minimizzare ulteriormente luce di eccitazione diffusa da colpire il sensore. Inoltre, il filtro per le emissioni può essere scelto per essere selettivo per l&#39;emissione di SWNTs di un particolare chiralità. </li><li> Eseguire regolazioni di precisione per l&#39;allineamento del fascio con l&#39;inserimento di un cubetto di allineamento adeguato sostituire l&#39;obiettivo con due offset, dischi smerigliato contenenti 1 mm fori di spillo. Allineare il fascio al centro di entrambi i dischi di allineamento inferiore e superiore. </li><li> Attaccare una serie di sensori 2D InGaAs al porto di imaging laterale del microscopio utilizzando un apposito adattatore e una lente 0,5X se necessario, per adattarsi alle dimensioni del sensore. </li><li> Utilizzando un obiettivo ad immersione 100X (1.4 NA), applicare l&#39;olio di immersione senza fluorescenza e posizionare il immobicampione SWNT zato sul palco microscopio. </li><li> Sollevare l&#39;obiettivo finché la petrolifere inferiore del vetro di copertura (# 1.5, 170 spessore micron). Effettuare le regolazioni al collare obiettivo, se necessario, per le condizioni di imaging, ad esempio, temperatura, spessore del vetro, etc. </li><li> Lentamente sollevare l&#39;obiettivo con la sorgente di eccitazione e tenere sotto controllo il segnale di fluorescenza della telecamera InGaAs. L&#39;intensità della fluorescenza deve aumentare gradualmente il piano focale avvicina alla superficie ed i sensori immobilizzati venire a fuoco. </li></ol></li><li> NIR spettroscopia di fluorescenza NOTA: spettroscopia di fluorescenza può essere eseguita utilizzando la stessa configurazione microscopio ma dirigendo la luce raccolta dal corpo microscopio e in uno spettrometro e InGaAs rivelatore lineare. <ol><li> Utilizzando supporti cinematiche e specchi classificati per NIR, indirizzare il percorso della luce verso la fessura d&#39;ingresso dello spettrometro. Mettere a fuoco la luce verso il basso per un POInt sulla fessura d&#39;ingresso utilizzando una lente di focalizzazione (ad esempio, piano-convessa, f = 150 mm). Questo allineamento si ottiene attenuando la potenza del laser &lt;1 mW e sostituendo l&#39;obiettivo microscopio con uno specchio 1 &quot;e usando un cubo filtro 50/50 beam-splitting. La luce di eccitazione viene poi lasciare il microscopio attraverso l&#39;apertura di uscita e da poter essere essere utilizzato per regolare gli specchi e lenti per focalizzare il fascio sulla fenditura d&#39;ingresso. </li><li> Dopo aver sostituito l&#39;obiettivo microscopio e filtro passa lungo, mettere un piatto ben sul palco e registrare gli spettri di un campione di messa a fuoco utilizzando lo spettrometro e la matrice InGaAs. </li></ol></li><li> Misurare la risposta reversibile (GT) 15 DNA SWNTs a dopamina <ol><li> Montare il sensore canali rivestito sul palco microscopio e mettere a fuoco usando un obiettivo olio 100X e la macchina fotografica InGaAs. Aggiungere 50 ml di soluzione di 100 micron dopamina nel tampone fosfato (PBS) per il canale di flusso e registrarela variazione di intensità di fluorescenza. </li><li> Lavare la soluzione di dopamina con tampone fosfato e osservare il cambiamento di fluorescenza dei singoli sensori SWNT. </li></ol></li><li> Lo screening Ben-plate per la risposta analiti di sensori SWNT NOTA: Screening di diversi analiti può essere eseguita utilizzando una piastra ben trasparente controllata mediante uno stadio motorizzato. Una piastra ben ideale è trasparente visibile e IR ed ha pareti laterali nere per minimizzare la diafonia tra i pozzetti. <ol><li> Pipettare volumi uguali di sensore SWNT sospensione (ad esempio, 5 mg / L concentrazione) in ogni pozzetto, sufficiente a coprire il fondo del pozzo uniformemente, tipicamente&gt; 100 ml per una piastra a 96 pozzetti e&gt; 30 ml per una piastra a 384 pozzetti . </li><li> Analiti pipetta (ad esempio, 2 microlitri, 100 micron volume finale) da screening di librerie nei pozzetti. Preparare ciascun analita in triplice copia per tenere conto di potenziale well-to-ben variazione, Fluctuationi di intensità di eccitazione, o di temperatura. </li><li> Sollevare l&#39;obiettivo (per esempio, 20X Achroplan, 0,45 NA) durante il monitoraggio gli spettri di emissione utilizzando lo spettrometro e la matrice InGaAs. Posizione ottimale dell&#39;obiettivo metterà piano focale circa a metà del volume del campione nel pozzetto, che dovrebbe corrispondere a un massimo di intensità misurata. </li><li> Per ciascun pozzetto, registrare un 1-10 s esposizione a raccogliere uno spettro. </li><li> Confrontare gli spettri di emissione per ciascun pozzetto per un controllo contenente solo SWNTs senza analita aggiuntivo per quantificare la risposta di fluorescenza. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

SWNTs sono prontamente sospesi in soluzione acquosa tramite sonicazione diretta con SDS o ssDNA, come indicato da un aumento della densità ottica forniti dalla dispersione colloidale della risultante ibrido SWNT-polimero. SDS e ssDNA disperde e solubilizza fasci di SWNT assorbendo sulla superficie SWNT attraverso interazioni idrofobiche o pi-pi. Inoltre, altri polimeri, come DNA genomico, polimeri anfifilici, polimeri coniugati e lipidi, possono essere adsorbiti sulla superficie del SWNTs mediante dialisi di campioni so...

nanotubi a parete singola di carbonio (SWNT) sono atomicamente sottili strati di atomi di carbonio arrotolati in lunghe, sottili cilindri che esibiscono uniche proprietà elettroniche e ottiche. 1 Tali proprietà includono una band-gap produzione vicino (NIR) emissione di fluorescenza a raggi infrarossi tramite ricombinazione eccitone che è molto sensibile al suo ambiente locale. L&#39;emissione NIR di SWNTs rientra nella finestra del vicino infrarosso in cui la profondità di penetrazione della luce è massima per tessuto biologico. 2,3 Inoltre, SWNTs esibiscono diverse caratteristiche uniche atipiche in contrasto con fluorofori organici: SWNT mostra un grande spostamento di Stokes, non photobleach, e non lampeggiano. 4 Recentemente, sfruttando queste caratteristiche ha portato allo sviluppo di un assortimento di sensori molecolari con applicazioni alla biologia. 5,6 non modificato, tuttavia, SWNTs sono insolubili in acqua, e ottenendo sospensioni di singole SWNTs può essere una sfida. 7,8 Bundling e aggregazione di SWNTs in soluzione possono offuscare la loro fluorescenza band-gap, 2 rendendoli adatti per applicazioni di rilevamento. Disperdendo i singoli nanotubi di carbonio in soluzione acquosa richiede di modificare la loro superficie per impedire l&#39;aggregazione idrofobicità-driven. 9 Mentre modificazione covalente può rendere SWNTs idrosolubile, 10 nonché impartire specifica chimica di legame, siti di difetti nel reticolo SWNT ridurre o abate loro emissione di fluorescenza. Invece, SWNT funzionalizzazione può essere realizzato utilizzando tensioattivi, lipidi, polimeri e DNA 9,11 - 13 che adsorbono alla superficie nanotubo attraverso interazioni idrofobiche e impilamento pi-pi. L&#39;ambiente chimico risultante circostante SWNTs superficie funzionalizzato viene indicato come sua fase corona. Perturbazioni alla fase corona possono avere un grande impatto sul eccitoni che viaggiano sulla superficie di nanotubi, causando modulazioni di SWNT Fluorescence emissioni. E &#39;questo rapporto sensibile tra la fase della corona e la fluorescenza SWNT che può essere sfruttato per sviluppare nuovi sensori molecolari incorporando modalità specifiche vincolanti sulla grande superficie di SWNT. Perturbazioni alla fase corona SWNT upon analita legame può portare a cambiamenti nell&#39;ambiente dielettrico locale, caricare trasferimento, o introdurre difetti reticolari, ognuno dei quali può modulare l&#39;emissione di fluorescenza dei SWNTs per servire come meccanismo di trasduzione del segnale. 14 Questo approccio viene utilizzato nello sviluppo di sensori fluorescenti innovative per la rilevazione di diverse classi di molecole compreso DNA, 15,16 glucosio 17 e piccole molecole come ATP, 18 specie reattive dell&#39;ossigeno 19 e di ossido nitrico. 20,21 Tuttavia, questi approcci sono limitate dal fatto che essi si basano sull&#39;esistenza di una modalità di legame noto per l&#39;analita bersaglio. Recentemente, una applicazione più genericoRoach per la progettazione di sensori fluorescenti è stato sviluppato utilizzando SWNTs non covalente funzionalizzati con eteropolimeri anfifilici, fosfolipidi e acidi polynucleic. Queste molecole aderire a superfici di nanotubi di carbonio per la produzione di sospensioni altamente stabili di singoli SWNTs 22 - 25 con fasi corona uniche che possono specificamente legano le proteine 26,27 o piccole molecole, tra cui il neurotrasmettitore dopamina. 28 - 30 Ingegneria fase corona per disperdere SWNTs e specificamente analiti target si legano si riferisce al riconoscimento molecolare fase come corona (CoPhMoRe). 28 Le piccole dimensioni, bassa tossicità, elevata stabilità e unbleaching Nir fluorescenza dei sensori CoPhMoRe SWNT li rendono ottimi candidati per il rilevamento in vivo per misure risolte nel tempo prolungati. 6 Studi recenti hanno dimostrato le loro applicazioni nei tessuti vegetali per la rilevazione ottica di specie reattive di ossigeno e azoto. 31Un&#39;applicazione particolarmente interessante per i sensori CoPhMoRe SWNT è il potenziale per l&#39;etichetta Free Detection di neurotrasmettitori come la dopamina in vivo, dove altre tecniche, come ad esempio il rilevamento elettrochimico o immunoistochimica, soffrono di una mancanza di risoluzione spaziale, risoluzione temporale, e la specificità. Progettazione e scoprendo sensori CoPhMoRe SWNT è stato finora trattenuto dalle dimensioni e chimica diversità della biblioteca disperdente, limitando la probabilità di trovare un sensore per un particolare bersaglio. Fino ad oggi, i ricercatori hanno solo scalfito la superficie di coniugato disponibile, co-block, biologiche e polimeri biomimetici che potrebbero servire come disperdenti funzionalmente attivi per sensori SWNT. Qui, vi presentiamo diversi metodi sia per disperdere SWNTs e caratterizzare la loro fluorescenza per lo screening ad alto rendimento e per singola analisi sensore SWNT. In particolare, si delineano la procedura per SWNTs vernicanti oligom acido polynucleicERS utilizzando sonicazione diretta così come il modo di funzionalizzare SWNT con polimeri anfifilici attraverso lo scambio tensioattivo con la dialisi. Usiamo (GT) 15 -DNA e polietilene glicole funzionalizzata con rodamina isotiocianato (RITC-PEG-RITC) come esempi. Dimostriamo l&#39;uso di (GT) 15 -DNA SWNTs come un sensore CoPhMoRe per il rilevamento della dopamina. Infine, si delineano procedure per eseguire misure dei sensori molecola singoli, che possono essere utilizzate per la caratterizzazione o singola rilevamento molecola.

<table><tbody><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>sodio dodecil solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>sodio colato idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>tris base (Trizma base)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Ammina-PEG-ammina,NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>rodamina B isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>fluoresceina isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>etere dietilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA modificato con 5'-tiolo&nbsp;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metossipolietilenglicole maleimmide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di spin da 100 kDa</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Nanotubi di carbonio a parete singola super purificati</td><td>Integris</td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>pistola antistatica</td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ultra sonicatore</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr> cassette <tr><td>per dialisi</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotina</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin protein</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-amminopropil)trietossisilano (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>cinematidi</td><td>specchi ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>periscopio</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>olio da immersione</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>Plan-apochromat 100X olio, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 20X</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>dopamina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>telecamera array 2D a infrarossi</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>array di sensori 1D a infrarossi</td><td>Princeton Instruments</td><td>Spettrografo PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR</td><td>Princeton Instruments Lente</td> planoconvessa <td>SCT-320</td><td></td></tr> Piastre a pozzetti <tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>(fondo in vetro)</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli walled nanotubi di carbonio

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

I nanotubi semiconduttori di carbonio a parete singola (SWNT) sono una classe di nanomateriali otticamente attivi che emettono fluorescenza nel vicino infrarosso, in coincidenza con la finestra ottica dove i campioni biologici sono più trasparenti. Qui, descriviamo le tecniche per adsorbire polimeri anfifilici e acidi polinucleici sulla superficie degli SWNT per ingegnerizzare le loro fasi di corona e creare nuovi sensori molecolari per piccole molecole e proteine. Questi sensori SWNT funzionalizzati sono biocompatibili e stabili. I polimeri vengono adsorbiti sulla superficie dei nanotubi mediante sonicazione diretta di SWNT e polimero o sospendendo SWNT utilizzando un tensioattivo seguito da dialisi con polimero. L'emissione di fluorescenza, la stabilità e la risposta di questi sensori agli analiti bersaglio sono confermate utilizzando l'assorbanza e la spettroscopia di fluorescenza nel vicino infrarosso. Inoltre, dimostriamo l'immobilizzazione superficiale dei sensori su vetrini per consentire la microscopia a fluorescenza a singola molecola per caratterizzare l'adsorbimento del polimero e la cinetica di legame dell'analita.

SWNTs sono state sospese in soluzione acquosa utilizzando sia tensioattivi e polimeri anfifilici per sonicazione diretta e di scambio di dialisi. La figura 1 mostra SWNTs, coltivato secondo il metodo catalizzata ferro carbonile (HiPCO), sospesa con SC, RITC-PEF20-RITC, e (GT) 15 -DNA. La densità ottica di una SWNTs con SDS (o polimero) aumenta drammaticamente dopo sonicazione e diminuisce alla rimozione degli aggregati e contaminanti attraverso la purificazion...

Presentiamo un protocollo per l'ingegnerizzazione della fase corona di nanotubi di carbonio fluorescenti a parete singola (SWNT) nel vicino infrarosso utilizzando polimeri anfifilici e DNA per sviluppare sensori per bersagli molecolari senza elementi di riconoscimento noti.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare nanotubi di carbonio fluorescenti a parete singola nel vicino infrarosso per il rilevamento molecolare che sono stati funzionalizzati utilizzando polimeri biomimetici. Questi nanosensori possono consentire l'imaging risolto nel tempo nei tessuti viventi. Ad esempio, possono essere utilizzati per rilevare la dopamina nel cervello.Il vantaggio principale di questi sensori è la loro intrinseca fluorescenza nel vicino infrarosso, che consente l'imaging più profondo nei tessuti. I sensori sintetici consentono il rilevamento di molecole senza elementi di riconoscimento molecolare naturali, rendendo questo metodo generico di sviluppo dei sensori particolarmente utile per il rilevamento di piccole molecole. Per preparare una sospensione di acidi nucleici di SWNT, sciogliere prima gli acidi nucleici in cloruro di sodio 0,1 molare a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.In una cappa aspirante, rimuovere l'elettricità statica dalla spatola usa e getta, dalle provette da microcentrifuga e dal calcio SWMT, utilizzando una pistola antistatica. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione di acido nucleico a 980 microlitri di cloruro di sodio 0,1 molare. Quindi aggiungere 1 milligrammo di SWNT lavati alla soluzione di acido nucleico risultante prima di sonicare la miscela.Il posizionamento della punta della sonda durante la sonicazione è fondamentale. In caso di formazione di schiuma, riposizionare la punta della sonda e provare a ridurre l'ampiezza. In alternativa, è possibile provare gli impulsi di sonicazione o la sonicazione a bagno se la sospensione rimane scarsa.Utilizzando un ultrasuonatore con punta di 3 millimetri di diametro, sonicare la soluzione per 10 minuti al 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. Centrifugare la soluzione di DNA SWNT due volte per 90 minuti a 16, 100 xg. Raccogliere e conservare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente fasci e aggregati di nanotubi di carbonio.Smaltire il pellet in conformità con le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi appropriate per i nanomateriali. Misurare l'assorbanza della soluzione a 632 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS per determinare la concentrazione approssimativa di SWNT sospesi, in conformità con la legge di Lambert-Beer, e il fattore di diluizione appropriato. Per le sospensioni di polimeri anfifilici, rimuovere prima l'elettricità statica dalla spatola monouso, dalle provette per microcentrifuga e dal calcio SWNT.In una cappa aspirante, aggiungere cinque milligrammi di SWNT a cinque millilitri di soluzione di colato di sodio al 2%. Utilizzando un ultrasuonatore con una punta di sei millimetri di diametro, sonicare la soluzione per un'ora al 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. Centrifugare il campione a 150.000 xg per quattro ore utilizzando un'ultracentrifuga, prima di raccogliere con cura il surnatante.Quindi, sciogliere l'1% in peso di polimero anfifilico nella soluzione scSWNT. Quindi, dializzare la soluzione polimerica scSWNT utilizzando una membrana per dialisi da 3,5 kilodalton contro un litro di acqua deionizzata o tampone per cinque giorni. Cambia l'acqua o il tampone alla seconda ora e alla quarta ora.Misurare l'assorbanza della soluzione a 632 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis per determinare la concentrazione approssimativa di SWNT sospesi. Per preparare i vetrini rivestiti di BSA-biotina, pulire un vetrino da microscopio e un vetro di copertura da 0,17 millimetri con acqua deionizzata, quindi metanolo, acetone e un risciacquo finale di acqua deionizzata. Crea canali posizionando diversi pezzi di nastro biadesivo a circa cinque millimetri di distanza sul vetrino pulito del microscopio.Sigillare i canali prendendo un lungo vetrino coprioggetto e premendolo sulla parte superiore del nastro biadesivo. Assicurarsi di centrarlo sul vetrino del microscopio in modo che i bordi del vetrino coprioggetto e del vetrino non siano a filo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione madre di BSA-biotina a 900 microlitri di tampone Tris 1x fino a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.Far fluire 50 microlitri della soluzione di BSA-biotina nel canale pipettando la soluzione a un'estremità e allontanando la soluzione dall'altra estremità con un fazzoletto. Dopo aver incubato la soluzione per cinque minuti, eseguire da tre a cinque lavaggi con 50 microlitri di cloruro di sodio molare 0,1. Successivamente, diluire 40 microlitri di cinque milligrammi per millilitro di soluzione madre di NAV in 960 microlitri di tampone Tris 1x, fino a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro.Versare 50 microlitri della soluzione NAV nel canale pipettando la soluzione a un'estremità e allontanando la soluzione dall'altra estremità con un fazzoletto. Dopo aver incubato il vetrino per due-cinque minuti, eseguire da tre a cinque lavaggi con 50 microlitri di cloruro di sodio molare 0,1. Quindi, diluire le soluzioni madre degli SWNT sospesi e del tampone di imaging a una concentrazione compresa tra 1 e 10 milligrammi per litro.Far scorrere 50 microlitri di questa soluzione nel canale e incubare per cinque minuti. Sciacquare delicatamente gli SWNT in eccesso utilizzando 50 microlitri di tampone di imaging. Per misurare la risposta reversibile dei DNA-SWNT GT15 alla dopamina, è necessario montare prima i canali rivestiti dal sensore sul tavolino del microscopio a fluorescenza.Metti a fuoco i canali utilizzando un obiettivo a olio 100X e una fotocamera all'arseniuro di indio gallio. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di dopamina 100 micromolare in soluzione salina tamponata con fosfato al canale di flusso e registrare la variazione dell'intensità della fluorescenza. Lavare la soluzione di dopamina utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato e osservare la variazione della fluorescenza dei singoli sensori SWNT.Per eseguire lo screening della piastra dei pozzetti per la risposta dell'analita dei SWNT in polimero biomimetico, pipettare volumi uguali del sensore SWNT sospeso in ciascun pozzetto. Usa un volume sufficiente per coprire uniformemente il fondo del pozzo. Quindi, pipettare gli analiti dalla libreria di screening nelle piastre a pozzetti.Preparare ciascun analita in triplicato per tenere conto delle potenziali variazioni da pozzetto a pozzetto e delle fluttuazioni dell'intensità di eccitazione o della temperatura. Alzare l'obiettivo monitorando gli spettri delle emissioni utilizzando lo spettrometro e l'array di arseniuro di indio gallio. La posizione ottimale dell'obiettivo metterà il piano focale approssimativamente al centro del volume del campione nel pozzetto, che dovrebbe corrispondere a un massimo di intensità misurata.Per ogni pozzetto del campione, registrare un'esposizione da uno a 10 secondi per raccogliere uno spettro. Confrontare gli spettri di emissione per ciascun pozzetto con un controllo contenente solo SWNT senza analita aggiuntivo, per quantificare la risposta alla fluorescenza. Lo spettro di assorbanza dei sensori di nanotubi di DNA GT15 mostra picchi multipli corrispondenti a nanotubi di carbonio ben dispersi di diversa chiralità.Viene mostrata la fluorescenza nel vicino infrarosso dei sensori di nanotubi di DNA GT15. È interessante notare che l'intensità della fluorescenza raddoppia approssimativamente in risposta alla dopamina. In questa figura, la microscopia a fluorescenza nel vicino infrarosso rivela singoli sensori di nanotubi di DNA GT15 immobilizzati sulla superficie di un vetrino.In futuro è importante testare il sensore per l'uso in vivo, ad esempio espandendo la libreria di analiti per includere concorrenti molecolari, testando la linearità della risposta nel regime di concentrazione biologicamente rilevante e anche testando la reversibilità. Una volta padroneggiato, questo approccio può essere utilizzato per creare una libreria di diversi sensori sintetici da molecole prive di elementi di riconoscimento molecolare noti.

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Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Scopri come preparare nanosensori a fluorescenza nell'infrarosso vicino usando nanotubi di carbonio a parete singola funzionalizzati con polimeri anfifilici e DNA. Questo metodo consente il rilevamento di molecole come la dopamina nei tessuti viventi.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

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