Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare nanotubi di carbonio fluorescenti a parete singola nel vicino infrarosso per il rilevamento molecolare che sono stati funzionalizzati utilizzando polimeri biomimetici. Questi nanosensori possono consentire l'imaging risolto nel tempo nei tessuti viventi. Ad esempio, possono essere utilizzati per rilevare la dopamina nel cervello.

Il vantaggio principale di questi sensori è la loro intrinseca fluorescenza nel vicino infrarosso, che consente l'imaging più profondo nei tessuti. I sensori sintetici consentono il rilevamento di molecole senza elementi di riconoscimento molecolare naturali, rendendo questo metodo generico di sviluppo dei sensori particolarmente utile per il rilevamento di piccole molecole. Per preparare una sospensione di acidi nucleici di SWNT, sciogliere prima gli acidi nucleici in cloruro di sodio 0,1 molare a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

In una cappa aspirante, rimuovere l'elettricità statica dalla spatola usa e getta, dalle provette da microcentrifuga e dal calcio SWMT, utilizzando una pistola antistatica. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione di acido nucleico a 980 microlitri di cloruro di sodio 0,1 molare. Quindi aggiungere 1 milligrammo di SWNT lavati alla soluzione di acido nucleico risultante prima di sonicare la miscela.

Il posizionamento della punta della sonda durante la sonicazione è fondamentale. In caso di formazione di schiuma, riposizionare la punta della sonda e provare a ridurre l'ampiezza. In alternativa, è possibile provare gli impulsi di sonicazione o la sonicazione a bagno se la sospensione rimane scarsa.

Utilizzando un ultrasuonatore con punta di 3 millimetri di diametro, sonicare la soluzione per 10 minuti al 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. Centrifugare la soluzione di DNA SWNT due volte per 90 minuti a 16, 100 xg. Raccogliere e conservare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente fasci e aggregati di nanotubi di carbonio.

Smaltire il pellet in conformità con le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi appropriate per i nanomateriali. Misurare l'assorbanza della soluzione a 632 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS per determinare la concentrazione approssimativa di SWNT sospesi, in conformità con la legge di Lambert-Beer, e il fattore di diluizione appropriato. Per le sospensioni di polimeri anfifilici, rimuovere prima l'elettricità statica dalla spatola monouso, dalle provette per microcentrifuga e dal calcio SWNT.

In una cappa aspirante, aggiungere cinque milligrammi di SWNT a cinque millilitri di soluzione di colato di sodio al 2%. Utilizzando un ultrasuonatore con una punta di sei millimetri di diametro, sonicare la soluzione per un'ora al 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio. Centrifugare il campione a 150.000 xg per quattro ore utilizzando un'ultracentrifuga, prima di raccogliere con cura il surnatante.

Quindi, sciogliere l'1% in peso di polimero anfifilico nella soluzione scSWNT. Quindi, dializzare la soluzione polimerica scSWNT utilizzando una membrana per dialisi da 3,5 kilodalton contro un litro di acqua deionizzata o tampone per cinque giorni. Cambia l'acqua o il tampone alla seconda ora e alla quarta ora.

Misurare l'assorbanza della soluzione a 632 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis per determinare la concentrazione approssimativa di SWNT sospesi. Per preparare i vetrini rivestiti di BSA-biotina, pulire un vetrino da microscopio e un vetro di copertura da 0,17 millimetri con acqua deionizzata, quindi metanolo, acetone e un risciacquo finale di acqua deionizzata. Crea canali posizionando diversi pezzi di nastro biadesivo a circa cinque millimetri di distanza sul vetrino pulito del microscopio.

Sigillare i canali prendendo un lungo vetrino coprioggetto e premendolo sulla parte superiore del nastro biadesivo. Assicurarsi di centrarlo sul vetrino del microscopio in modo che i bordi del vetrino coprioggetto e del vetrino non siano a filo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione madre di BSA-biotina a 900 microlitri di tampone Tris 1x fino a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.

Far fluire 50 microlitri della soluzione di BSA-biotina nel canale pipettando la soluzione a un'estremità e allontanando la soluzione dall'altra estremità con un fazzoletto. Dopo aver incubato la soluzione per cinque minuti, eseguire da tre a cinque lavaggi con 50 microlitri di cloruro di sodio molare 0,1. Successivamente, diluire 40 microlitri di cinque milligrammi per millilitro di soluzione madre di NAV in 960 microlitri di tampone Tris 1x, fino a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro.

Versare 50 microlitri della soluzione NAV nel canale pipettando la soluzione a un'estremità e allontanando la soluzione dall'altra estremità con un fazzoletto. Dopo aver incubato il vetrino per due-cinque minuti, eseguire da tre a cinque lavaggi con 50 microlitri di cloruro di sodio molare 0,1. Quindi, diluire le soluzioni madre degli SWNT sospesi e del tampone di imaging a una concentrazione compresa tra 1 e 10 milligrammi per litro.

Far scorrere 50 microlitri di questa soluzione nel canale e incubare per cinque minuti. Sciacquare delicatamente gli SWNT in eccesso utilizzando 50 microlitri di tampone di imaging. Per misurare la risposta reversibile dei DNA-SWNT GT15 alla dopamina, è necessario montare prima i canali rivestiti dal sensore sul tavolino del microscopio a fluorescenza.

Metti a fuoco i canali utilizzando un obiettivo a olio 100X e una fotocamera all'arseniuro di indio gallio. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di dopamina 100 micromolare in soluzione salina tamponata con fosfato al canale di flusso e registrare la variazione dell'intensità della fluorescenza. Lavare la soluzione di dopamina utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato e osservare la variazione della fluorescenza dei singoli sensori SWNT.

Per eseguire lo screening della piastra dei pozzetti per la risposta dell'analita dei SWNT in polimero biomimetico, pipettare volumi uguali del sensore SWNT sospeso in ciascun pozzetto. Usa un volume sufficiente per coprire uniformemente il fondo del pozzo. Quindi, pipettare gli analiti dalla libreria di screening nelle piastre a pozzetti.

Preparare ciascun analita in triplicato per tenere conto delle potenziali variazioni da pozzetto a pozzetto e delle fluttuazioni dell'intensità di eccitazione o della temperatura. Alzare l'obiettivo monitorando gli spettri delle emissioni utilizzando lo spettrometro e l'array di arseniuro di indio gallio. La posizione ottimale dell'obiettivo metterà il piano focale approssimativamente al centro del volume del campione nel pozzetto, che dovrebbe corrispondere a un massimo di intensità misurata.

Per ogni pozzetto del campione, registrare un'esposizione da uno a 10 secondi per raccogliere uno spettro. Confrontare gli spettri di emissione per ciascun pozzetto con un controllo contenente solo SWNT senza analita aggiuntivo, per quantificare la risposta alla fluorescenza. Lo spettro di assorbanza dei sensori di nanotubi di DNA GT15 mostra picchi multipli corrispondenti a nanotubi di carbonio ben dispersi di diversa chiralità.

Viene mostrata la fluorescenza nel vicino infrarosso dei sensori di nanotubi di DNA GT15. È interessante notare che l'intensità della fluorescenza raddoppia approssimativamente in risposta alla dopamina. In questa figura, la microscopia a fluorescenza nel vicino infrarosso rivela singoli sensori di nanotubi di DNA GT15 immobilizzati sulla superficie di un vetrino.

In futuro è importante testare il sensore per l'uso in vivo, ad esempio espandendo la libreria di analiti per includere concorrenti molecolari, testando la linearità della risposta nel regime di concentrazione biologicamente rilevante e anche testando la reversibilità. Una volta padroneggiato, questo approccio può essere utilizzato per creare una libreria di diversi sensori sintetici da molecole prive di elementi di riconoscimento molecolare noti.