Name: Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri la regolazione del tropismo dei picornavirus basata su microRNA. Questo metodo migliora la sicurezza virale con minima ingegneria del genoma e offre versatilità per diverse firme di microRNA cellulari.

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Al e Mary Agnes McQuinn, la Richard M. Schulze Foundation, e un NIH Relief Grant dalla Mayo Clinic hanno finanziato il lavoro rappresentativo descritto qui.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il design, la composizione e la localizzazione degli elementi di risposta microRNA all&#39;interno del genoma virale detterà mira efficacia e specificità. Ottimizzazione questi richiederà tentativi ed errori. Tuttavia, progettazione razionale sulla base di RNA analisi strutturale e studi precedenti di replicazione virale e microRNA firme aiuti per l&#39;attuazione di questa tecnica con l&#39;ottimizzazione minimo 10, 11, 12,</su...

Lo sviluppo di un metodo ampiamente applicabile, facile ed efficace per ingegneria un vettore con tropismo limitata offre una grande opportunità per migliorare la sicurezza, la comprensione biologica e l&#39;utilità terapeutica del virus. Diversi meccanismi esistono per indirizzare tropismo virale tra cui trasduzionali, trascrizione, e le tecniche di traslazionali-based. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente applicabili a tutti i sistemi vettoriali, può richiedere vie di segnalazione difettosi in cellule bersaglio o richiedere l&#39;inserimento di grandi sequenze codificanti nel genoma virale. Inoltre, questi metodi possono provocare un&#39;attenuazione del virus, ostacolando significativamente la loro attività terapeutica e limitando la visibilità nel sistema non modificato. I microRNA sono piccole (22-25 nucleotidi), RNA non codificanti che mediano silenziamento genico nelle cellule eucariotiche. funzione di microRNA legandosi sequenze target complementari (elementi di risposta) in RNA messaggero (mRNA) resulti<html> ng in trascrizione di destabilizzazione, il degrado o la repressione traslazionale. I microRNA normalmente si legano elementi di risposta con complementarità parziale e cedono piccole modifiche nell&#39;espressione genica 1, 2, 3, 4, 5. Più significative alterazioni nell&#39;espressione genica possono essere realizzati aumentando complementarietà dell&#39;elemento risposta 6. Migliaia di microRNAs mature sono state identificate in una varietà di specie e molti modelli di espressione mostra differenziali in una varietà di cellule e tessuti tipi 7, 8, 9. Queste firme microRNA possono essere sfruttati per la restrizione specifica delle cellule di amplificazione del virus, incorporando elementi di risposta perfettamente complementari nel genoma virale 10,= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13. L&#39;obiettivo generale di questa tecnica di microRNA-targeting è quello di controllare il tropismo di un genoma vettore senza attenuazione supplementare. L&#39;utilità di questo metodo per regolare tropismo virale è stato originariamente dimostrata in vettori lentivirali per limitare l&#39;espressione del transgene in tessuti specifici 14, 15, 16. Questa tecnica è stata successivamente applicato ad un&#39;ampia gamma di replicare e non replicanti vettori virali per la terapia genica intenso nonché per migliorare i profili di sicurezza di molti virus oncolitici eliminando tossicità indesiderati nei tessuti normali 10, 11, 12, 13, 17 . E &#39;stato anche utilizzato per generare e sicura effective vaccini vivi attenuati, nonché per migliorare virus e produzione di vaccini processi 18, 19, 20, 21. MicroRNA-targeting di un vettore può consentire per l&#39;attenuazione in ospiti vaccinati o sistemi mirati, pur mantenendo livelli di crescita wild-type in sistemi di produttori. MicroRNA targeting può essere utilizzato anche per migliorare la sicurezza biologica del virus per scopi di ricerca, limitando la trasmissione in una specie (ad esempio, gli esseri umani), pur mantenendo la trasmissione in altri host 22. Infine, microRNA-targeting possono consentire approfondite analisi del ciclo di vita virali e ruoli specifici di tipi di cellule nella patogenesi e immunità segregando crescita virale 23, 24, 25, 26. Questa tecnica offre un alternative metodo che viene facilmente implementata e applicabile il targeting per tutti i sistemi di virus. Inoltre, la collezione in continua espansione dei microRNA maturi con pattern di espressione differenziali in specifici tipi cellulari rende questa tecnica molto versatile. MicroRNA basata Targeting è dimostrato efficace per una varietà di sistemi di virus senza compromettere la funzione di sistema. I principali limiti di questa tecnica sono tentativi ed errori di ottimizzazione, il potenziale di mutazioni di fuga, e potenziali effetti fuori bersaglio sulla trascrizioni endogene. Tuttavia, queste limitazioni possono generalmente essere superati con design ottimizzato e razionale elemento di risposta. virus a RNA positivo-senso tendono ad essere particolarmente sensibili alle microRNA-targeting causa dell&#39;orientamento positivo-senso della loro genoma e la disponibilità dei trascritti ai macchinari microRNA durante il ciclo di replica completamente citoplasmatica. Qui si descrive un protocollo per la generazione di Picornavirus microRNA-mirata e la sperimMetodi ental per verificare l&#39;efficienza e la specificità di tale targeting in vitro.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotidi codificanti per RE Sequenza</td><td>ultramerica purificata</td><td>IDT</td> PAGE <td>progettata dallo sperimentatore</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi che codificano un sito di restrizione unico</td> Sequenza <td>IDT</td><td>25nM</td><td>progettata dallo sperimentatore</td></tr><tr><td>Espandi il kit PCR ad alta fedeltà</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Molti altri kit PCR per polimerasi ad alta fedeltà disponibili</td></tr><tr><td>Sistema T4 DNA Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAscript</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAclear</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Senza RNasi</td></tr><tr><td>5 M NH4 Acetato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>viene fornito in kit MEGAclear</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>ThermoFisher Scientific BP2818100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Reagente di trasfezione</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Reagente di trasfezione</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m filtro per siringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Provette con tappo a vite</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Raschietti cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA imita</td><td>Dharmacon</td><td>Variazione</td><td></td></tr><tr><td>MTT Saggio di proliferazione cellulare</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Efficienza di subclonaggio DH5&alfa; Cellule competenti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vettori</td><td>Tecnologie Agilent Variabile</td><td>(ad es. 212205)</td><td>Esistono diversi plasmidi con promotori T7 o T3 e siti di clonazione variabili per consentire il clonaggio e la trascrizione dell'RNA.</td></tr></tbody></table>

regolamento microrna basata su picornavirus tropismo

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

La restrizione cellulo-specifica della replicazione virale senza attenuazione concomitante può giovare allo sviluppo di vaccini, alla terapia genica, alla viroterapia oncolitica e alla comprensione delle proprietà biologiche dei virus. Esistono diversi meccanismi per regolare il tropismo virale, tuttavia tendono ad essere specifici della classe virale e molti provocano l'attenuazione del virus. Inoltre, molti virus, inclusi i picornavirus, mostrano vincoli di dimensioni che non consentono l'incorporazione di grandi quantità di materiale genetico estraneo necessario per alcuni metodi di targeting. I microRNA sono RNA corti e non codificanti che regolano l'espressione genica nelle cellule eucariotiche legando sequenze bersaglio complementari negli RNA messaggeri, impedendone la traduzione o accelerandone la degradazione. Cellule diverse mostrano firme distinte di microRNA e molti microRNA fungono da biomarcatori. Questi modelli di espressione differenziale possono essere sfruttati per limitare l'espressione genica nelle cellule che esprimono specifici microRNA, mantenendo l'espressione nelle cellule che non lo fanno. Per quanto riguarda la regolazione del tropismo virale, sequenze complementari a specifici microRNA sono incorporate nel genoma virale, generalmente nelle regioni 3' non codificanti, mirando alla loro distruzione in presenza dei microRNA affini, impedendo così l'espressione e/o la replicazione genica virale. Il targeting dei microRNA è una tecnica che teoricamente può essere applicata a tutti i vettori virali senza alterare la potenza del virus in assenza dei corrispondenti microRNA. Qui descriviamo i metodi sperimentali associati alla generazione di un picornavirus mirato al microRNA e valutiamo l'efficacia e la specificità di tale targeting in vitro. Questo protocollo è progettato per un virus a replicazione rapida con un ciclo di replicazione litica, tuttavia, la modifica dei punti temporali analizzati e le letture specifiche della titolazione del virus utilizzate aiuteranno nell'adattamento di questo protocollo a molti virus diversi.

La tabella 1 rappresenta i risultati tipici di un test di titolazione per Picornavirus e descrive come calcolare la dose infettante coltura tissutale del 50%. Una rappresentazione schematica del concetto generale di regolazione microRNA a base di tropismo virale descritto in questo manoscritto è mostrato in Figura 1. L&#39;orientamento di microRNA all&#39;elemento di risposta durante le interazioni intracellulari, corretta progettazione di oligonucleotid...

Descriviamo qui un metodo per regolare il tropismo del picornavirus incorporando sequenze complementari a specifici microRNA nel genoma virale. Questo protocollo può essere adattato a tutte le diverse classi di virus con modifiche in base alla lunghezza e alla natura del loro ciclo di vita.

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è valutare l'efficienza e la specificità della regolazione basata su microRNA del tropismo dei picornavirus in vitro. Questo viene ottenuto preparando picornavirus che codificano elementi di risposta ai microRNA nel loro genoma. Come secondo passaggio, utilizzare i virus per infettare cellule che esprimono o non esprimono i microRNA corrispondenti.Successivamente, valutare la cinetica di replicazione virale, la propagazione e la tossicità per determinare l'efficienza e la specificità del targeting. Questo metodo di targeting può essere utilizzato nel campo della virologia per migliorare la sicurezza, la produzione e l'utilizzo dei virus, oppure per facilitare ricerche mirate alla comprensione dei processi biologici coinvolti nell'infezione virale. I principali vantaggi di questa tecnica sono la necessità di modifiche minime al genoma virale e la notevole versatilità, poiché è stato identificato un numero significativo di firme di microRNA cellulari.Per iniziare questa procedura, seminare le cellule permissive in una piastra a 96 pozzetti con mezzo di crescita completo. Aggiungere mezzo senza siero, privo di virus, nella riga uno e nella

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La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

I Norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite ancora tecniche molecolari per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente nuovi. Riportiamo due diversi approcci di genetica inversa per il recupero efficiente dei norovirus murino (MNV), l'unico membro di questo genere che possono essere propagate in coltura cellulare.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

Fonte: Ruiz, A. J. e Russell, S. J. Regolazione basata sui microRNA del tropismo del Picornavirus. J. Vis. Exp. (2017)Questo video illustra l'uso di mimici sintetici di microRNA per inibire selettivamente la replicazione virale in cellule epiteliali coltivate. Mette in evidenza come il silenziamento del genoma indotto dai microRNA possa bloccare la diffusione del virus e confermare la specificità dell'interazione bersaglio-microRNA mediante analisi della infettività a valle.

Valutazione dell'inibizione della diffusione virale tramite il silenziamento genomico mediato da mimic di microRNA

Qui proponiamo una strategia per studiare l'effetto di un fattore di trascrizione di interesse sul trascrittoma del microRNA utilizzando dati pubblicamente disponibili, risorse computazionali e dati ad alto rendimento da array di microRNA dopo aver trasfettato cellule con una piccola forcina (sh)RNA mirata a un fattore di trascrizione di interesse.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

Segnaliamo che utilizzando un'artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l'infezione larvale.

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

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Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

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Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri la regolazione del tropismo dei picornavirus basata su microRNA. Questo metodo migliora la sicurezza virale con minima ingegneria del genoma e offre versatilità per diverse firme di microRNA cellulari.

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

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