Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono la raccolta di terreno condizionato da cellule staminali embrionali di topo in condizioni di coltura priva di siero e feeder e la caratterizzazione delle funzioni biologiche di questo terreno. Questa procedura fornisce informazioni sull'attività antisenescenza di fattori solubili secreti da cellule staminali embrionali di topo per lo sviluppo di un approccio terapeutico sicuro e privo di cellule per le malattie legate all'età. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Yun-Ui Bae, un professore di ricerca del mio laboratorio.

In una cappa di sicurezza biologica, trattare un fibroblasto embrionale di topo o una coltura cellulare MEF con 20 millilitri di terreno MEF integrato con mitomicina C in una piastra di coltura cellulare di 15 centimetri per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS e staccarle con tre millilitri di tripsina EDTA per tre minuti a 37 gradi Celsius. Neutralizzare la tripsina con sei millilitri di terreno MEF fresco quando le cellule si sono sollevate dal fondo della piastra.

Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno MEF e impiattare due volte da 10 al sesto MEF inattivato per piatto di coltura da 10 centimetri in terreno MEF fresco. Coltivare le cellule di alimentazione per 24 ore. Quindi sostituire il terreno MEF con un terreno di cellule staminali embrionali di topo e seminare due volte da 10 alla sesta cellula staminale embrionale di topo sugli alimentatori per almeno 48 ore di co-coltura.

In una cappa di sicurezza biologica, sciacquare una piastra di cellule staminali embrionali di topo con cinque millilitri di PBS e staccare le cellule con tripsina più EDTA come appena dimostrato. Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, risospendere il pellet di cellule staminali in cinque millilitri di terreno di coltura di cellule staminali fresche e preparare un millilitro di cellule per piatto in terreno di cellule staminali embrionali fresche su cinque piastre di coltura cellulare rivestite di gelatina. Rimettere le cellule nell'incubatore fino a quando le colture non raggiungono l'80-85% di confluenza.

Quindi sciacquare le cellule in almeno otto millilitri di PBS per piastra per tre lavaggi di 10 minuti seguiti da un'incubazione di 24 ore in terreno di siero ridotto. Dopo non più di 24 ore, trasferire il surnatante in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione. Segue la filtrazione attraverso un colino da 0,2 micrometri.

Per testare gli effetti del terreno condizionato con cellule staminali embrionali mediante un saggio della beta galattosidasi associata alla senescenza, seminare fibroblasti dermici umani in una piastra a sei pozzetti in un mezzo di fibroblasti dermici umani. Dopo un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituire metà del terreno con un terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo fresche per un'altra coltura di 72 ore. Il terzo giorno di coltura, sciacquare le cellule in due millilitri di PBS per pozzetto per due lavaggi di 30 secondi.

Quindi, fissare le celle in paraformaldeide al 3,7% per cinque minuti a temperatura ambiente in una cappa aspirante. Dopo il fissaggio, lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS, come appena dimostrato ed etichettare le cellule con uno o due millilitri di soluzione SA beta gal per 17 ore e mezza a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica. Al termine del periodo di colorazione, lavare le cellule due volte con PBS come appena dimostrato.

Quindi, contromacchiare con Eosen per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo un'altra serie di lavaggi PBS, visualizzare le cellule con un ingrandimento di 100 volte al microscopio ottico. Per l'analisi del ciclo cellulare, seminare otto volte 10 al quarto fibroblasto dermico umano per pozzetto in un piatto di coltura cellulare di sei centimetri in terreno di coltura dermico umano fresco per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

La mattina successiva, sostituire metà del terreno con un terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo e rimettere le cellule nell'incubatore. Dopo 24 ore, raccogliere le cellule mediante dissociazione con tripsina EDTA seguita da due lavaggi in un millilitro di soluzione di PBS. Risospendere il pellet in 100 microlitri di soluzione fredda di PBS dopo il secondo lavaggio.

Quindi, fissare le celle con l'applicazione goccia a goccia a 200 microlitri di etanolo freddo durante il vortex. Conservare le celle a quattro gradi Celsius per almeno un'ora. Quindi, lavali in una soluzione PBS fresca.

Dopo la seconda centrifugazione, trattare il pellet con 250 microlitri di tampone citrato di sodio integrato con RNasi per 30 minuti a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule con 250 microlitri di tampone citrato di sodio contenente ioduro di propidio per 20 minuti. Quindi, valutare le fasi del ciclo cellulare di ciascun campione mediante citometria a flusso.

Per l'analisi quantitativa della PCR con trascrittasi inversa, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA per isolare l'RNA totale da fibroblasti dermici umani trattati con cellule staminali embrionali di topo condizionate con terreno secondo il protocollo del produttore. Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare l'RNA totale estratto. Quindi, formulare la miscela di reazione contenente i primer oligo deossitimidina e la trascrittasi inversa M-MLV secondo il protocollo del produttore.

Quindi aggiungere un microgrammo di RNA totale alla provetta PCR contenente la miscela di reazione. Infine, misurare l'amplificazione del CDNA con una macchina per PCR in tempo reale utilizzando la miscela master PCR verde e i primer genici appropriati. Le cellule staminali embrionali di topo coltivate in normali condizioni di coltura di cellule staminali embrionali di topo su uno strato di cellule alimentatrici di MEF mostrano una forma ovale e un aspetto lucido.

Mentre le cellule staminali embrionali di topo cresciute in condizioni di coltura senza siero e feeder dimostrano una morfologia appiattita e irregolare. Il trattamento del fibroblasto dermico umano senescente con terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo riduce il numero di cellule betagalattosidasi positive associate senescenti. Inoltre, l'analisi del ciclo cellulare di queste cellule rivela che il trattamento con terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo aumenta notevolmente il numero di cellule nelle fasi S e G2/M, riducendo al contempo il numero di cellule nella fase G0/G1.

Inoltre, il trattamento con terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo riduce l'espressione dei geni associati alla senescenza e delle citochine secretarie associate al fenotipo senescente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordarsi di raccogliere il siero e il terreno libero dall'alimentatore dopo 24 ore, poiché una lunga incubazione aumenta la possibilità di autolisi cellulare o di apoptosi per fame. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere il siero e il terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo senza alimentatore per un approccio privo di cellule.

Non dimenticare che lavorare con reagenti come la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come maneggiare questo reagente in una cappa aspirante.