Name: Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Impara a raccogliere il medium condizionato da cellule staminali embrionali di topo in condizioni senza siero né alimentatore. Questo metodo caratterizza i fattori solubili anti-senescenza per approcci terapeutici senza cellule nelle malattie legate all'invecchiamento.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla scienza Basic Program Research (2013R1A1A2060930) e il Medical Research Programma Center (2015R1A5A2009124) attraverso la Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT, e la pianificazione futura. Questa ricerca è supportata anche da una start-up sovvenzione di funzionamento dalla Hospital for Sick Children (HK Sung). Vorremmo ringraziare Laura e Sarah Barwell JS Kim per la loro eccellente aiuto nella redazione di questo manoscritto e il Dr. Andras Nagy per la fornitura della linea G4 Mesc.

NOTA: Uno schema del sierica- e protocollo di raccolta CM-free alimentatore è mostrato in Figura 1. 1. Materiali (Preparazione del MEF, Medium, piatti, e Solutions) <ol><li> Preparare 500 ml di terreno alla cultura i MEF. Supplemento Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con 10% FBS (ESC qualità), 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina. </li><li> Isolare MEF da embrioni a seguito di un protocollo di routine consolidata 13 e mantenerli in media MEF. </li><li> Preparare 500 ml di terreno alla cultura i mESCs. DMEM è completato con 15% FBS e 2 mM L-glutammina, 100 mM aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 mM β-mercaptoetanolo, 100 unità / ml fattore inibitorio della leucemia (LIF), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina. </li><li> Preparare i piatti gelatinizzati (5 piastre gelatinizzati / 1 Mesc piastra) rivestendo 10 cm piatti di coltura di cellule con 5 ml di soluzione di gelatina 0,1%. Incubare per almeno 10 min<html> a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 500 ml di siero ridotto media per una condizione senza siero di mESCs. Supplemento ridotto siero di media con 1,2 g di sodio bicarbonato (pH 7,0). Filtrare su filtro bottiglia-top 0,2 micron. </li><li> Preparare la senescenza associata β-galattosidasi (SA β-gal) soluzione colorante per la rilevazione di cellule senescenti: 1 mg / ml di X-gal (sciolto in dimetilformammide, DMF), acido citrico 40 mM / tampone fosfato di sodio (pH 6,0) , 5 mM di potassio ferricianuro, 5 mM ferrocianuro di potassio, 150 mM NaCl, e 2 mM MgCl 2 14. ATTENZIONE: (pericolosi) DMF è una soluzione tossico e corrosivo. Indossare indumenti di protezione individuale (guanti per esempio, nitrile o in lattice, un camice da laboratorio e occhiali) nel maneggiare soluzione. Utilizzare una cappa aspirante. </li><li> Preparare 500 ml di terreno alla cultura umana fibroblasti dermici (HDFS, NHDF-Ad-Der-fibroblasti). Supplemento DMEM con 10% FBS e 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Cultura del mouse cellule staminali embrionali (Figura 1A e 2A) NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa di sicurezza biologica coltura cellulare. <ol><li> Trattare i MEF con 20 ml di terreno MEF contenente 10 ug / ml di mitomicina C in 15 centimetri piatto di coltura cellulare. Incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aspirare il supporto dal MEF. Lavare le cellule con PBS per tre volte. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA (TE, 1x) e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 3 minuti, neutralizzare la TE con 6 ml di terreno MEF e centrifugare per 3 min a 300 x g. </li><li> Risospendere in 5 ml di terreno MEF. Determinare il numero di cellule in sospensione cellulare risultante utilizzando trypan colorazione blu e un emocitometro. Piatto MEF inattivati (alimentazione) ad una densità di 2 x 10 6 cellule per 10 cm piatto di coltura di cellule in medium MEF. Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Sostituire il medium MEF con il mezzo Mesc 24 ore dopo la placcatura l&#39;alimentatore (sullagiorno seguente). </li><li> Piatto le mESCs (G4 ibrido F1 cellule ES) ad una densità di 2 x 10 6 cellule sull&#39;alimentatore con mezzo MESC. Incubare per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2. NOTA: L&#39;effetto anti-invecchiamento della Mesc-CM è probabile più forte quando il numero di passaggio inferiore mESCs vengono utilizzati 15-17. Abbiamo acquisito una linea G4 Mesc dal Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. </li><li> Mantenere le cellule ad una densità relativamente elevata e il passaggio ad uno stato sub-confluenti 70-80%. Sostituire il supporto con il mezzo Mesc fresco tutti i giorni. </li></ol> 3. Raccolta di di siero e senza alimentatore mezzo condizionato (Figura 1B e 2B) NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa di sicurezza biologica coltura cellulare. <ol><li> Sciacquare la piastra Mesc con 5 ml di PBS. Aggiungere 1 ml di TE (2,5x) e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 3 minuti, neutralizzare il TE con 2 ml di Mesc medium e centrifugare per 3 min a 300 x g. </li><li> Risospendere in 5 ml di terreno Mesc e piastra di 1 ml in ciascuna di gelatina rivestite cultura piatto (5 piastre gelatinizzati / 1 Mesc piatto) in media Mesc. Coltura a 37 ° C e 5% CO 2 fino 80-85% di confluenza viene raggiunto. </li><li> Lavare mESCs con sufficienti PBS a coprire le cellule (8 ml per 10 cm Piatto) per 10 minuti per lavaggio, per un totale di tre lavaggi. Incubare a ridotto siero media per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. NOTA: La fase di lavaggio è importante per prevenire la contaminazione FBS. E &#39;importante seguire il tempo di incubazione 18,19. </li><li> Raccogliere Mesc-CM in un tubo da 50 ml e centrifugare per 20 minuti a 2500 x g. Raccogliere il surnatante (CM) dopo la centrifugazione. Filtrare su filtro bottiglia-top 0,2 micron. </li></ol> 4. Effetti staminali embrionali di topo-Cell condizionata Medium (Mesc-CM) NOTA: Gli effetti della Mesc-CM sono stati convalidati da diversi metodi, come ad esempioSA test β-gal, analisi del ciclo cellulare, e qRT-PCR. <ol><li> SA β-gal Assay (Figura 3A) <ol><li> HDFs Seed ad una densità di 2 x 10 4 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in terreno HDF. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> A seguito di una notte di incubazione, scartare la metà del mezzo HDF e aggiungere Mesc-CM e mezzo di controllo. Incubare per 72 ore a 37 ° C e 5% CO 2. mezzo di controllo è derivato dal terreno privo di siero (Reduced Serum media) in un piatto di gelatina rivestita in assenza di mESCs. </li><li> Lavare le cellule con PBS sufficienti a coprire le cellule (2 ml per 6 pozzetti) per 30 sec per lavaggio, per un totale di due lavaggi. Aggiungere 3,7% paraformaldeide (PFA) per il fissaggio. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: (pericolosi) Paraformaldeide è una soluzione tossico e corrosivo. Indossare indumenti di protezione individuale (ad esempio, nitrile o guanti di lattice, un camice da laboratorio e occhiali) nel maneggiare la soluzione.Utilizzare una cappa aspirante. </li><li> Aspirare la soluzione di fissaggio. Lavare le cellule fissate con PBS due volte, come descritto al punto 4.1.3. </li><li> Aggiungere la soluzione di β-gal colorazione SA (1-2 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Incubare per 17,5 ore a 37 ° C. NOTA: non deve essere incubato in un incubatore CO 2. </li><li> Aspirare la soluzione colorante β-gal SA e lavare le cellule con PBS due volte, come descritto al punto 4.1.3. </li><li> Aggiungere la soluzione Eosina per contro-colorazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule due volte con PBS, come descritto al punto 4.1.3. </li><li> celle di immagine a ingrandimento 100X utilizzando un microscopio immagini di luce e acquisire utilizzando una fotocamera digitale collegata per successive analisi. NOTA: Il numero totale di cellule può essere contato in modo cieco e la percentuale di SA β-gal positive cellule blu può essere calcolato. </li></ol></li><li> Analisi del ciclo cellulare (Figura 3B) <ol><li> HDFs seme ad una densità di8 x 10 4 cellule per pozzetto in una cella di sei centimetri cultura piatto in media HDF. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> A seguito di una notte di incubazione, scartare la metà del mezzo HDF e aggiungere Mesc-CM e mezzo di controllo. Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Trypsinize le cellule, come indicato nel punto in 3.1, e centrifugare per 5 min a 300 x g. Lavare le cellule con soluzione fredda PBS (PBS con 0,5 mM CaCl 2 e 2% FBS, 1 ml per 1,5 ml di tubo) due volte e centrifugare per 3 minuti a 2500 x g. Risospendere in 100 ml di soluzione PBS freddo. </li><li> Fissare le cellule facendo cadere 200 ml di etanolo freddo mentre vortex. Conservare a 4 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Lavare le cellule con soluzione fredda PBS due volte, come descritto al punto 4.2.3. </li><li> Risospendere le cellule in 250 microlitri di tampone citrato di sodio (1,12%, pH 8,5) contenente 50 ug / ml RNasi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 250 ml di citrato di sodiotampone contenente 50 ug / ml di ioduro di propidio. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Misurare le 10.000 cellule in ciascun campione usando citometria a flusso 20. </li></ol></li><li> qRT-PCR (Figura 3C) <ol><li> HDFs semi e aggiungere Mesc-CM, come descritto ai punti 4.1.1 e 4.1.2. </li><li> Isolare RNA totale dalle HDFs utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo il protocollo del produttore. Quantificare l&#39;RNA totale estratto utilizzando uno spettrofotometro 21. </li><li> Sintetizzare cDNA aggiungendo 1 mg di RNA totale a 20 ul di miscela di reazione contenente oligo primer (dT) e M-MLV trascrittasi inversa, secondo il protocollo 20 del produttore. </li><li> Misurare l&#39;amplificazione del cDNA con una macchina PCR in tempo reale, utilizzando miscela master Verde PCR e primers gene specifici (Supplemento Tabella 1). Normalizzare i dati con l&#39;espressione GAPDH. Utilizzare il seguente protocollo PCR: iniziale denaturation per 10 min a 95 ° C; 45 cicli per 15 secondi a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, e 35 sec a 72 ° C; e la fase curva di fusione per 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C, 30 sec a 95 ° C e 5 secondi a 60 ° C 15. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per la collezione di successo di di siero e Mesc-CM senza alimentatore, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Il fattore più critico è usando mESCs passaggio primi per la raccolta di Mesc-CM. In precedenza, è stato dimostrato che il passaggio anticipato Mesc-CM ha migliori effetti anti-invecchiamento rispetto al mESCs fine del passaggio. Stato segnalato il numero passaggio di mESCs di influenzare il loro potenziale di sviluppo 16 e 17 pluripotenza. <p class="jove_co...

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di raccogliere il mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) da condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione e per caratterizzare le sue funzioni biologiche. In generale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e terapia cellulare per la loro pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento 1-3. Tuttavia, il trapianto diretto di cellule staminali ha diverse limitazioni, come rigetto immunitario e la formazione del tumore 4,5. Pertanto, un approccio libero-cella può fornire una strategia terapeutica alternativa per la medicina rigenerativa e invecchiamento interventi 6,7. Senescenza è visto come controparte cellulare per l&#39;invecchiamento dei tessuti e organi, caratterizzato da uno stato permanente di arresto della crescita, fisiologia cellulare alterata e comportamenti. L&#39;invecchiamento è il principale fattore di rischio per le malattie prevalenti tra cui il cancro, le malattie cardiovascolari, tipo diabete 2, e neurodegenerazione 8. Una delle caratteristiche evidenti di invecchiamento è la diminuzione del potenziale rigenerativo dei tessuti, che è causato da invecchiamento delle cellule staminali e la stanchezza 9. Molti studi hanno dimostrato significativi molecole farmacologiche, come la rapamicina 9, il resveratrolo 10, e metformina 11, e fattori sistemici per via ematica, cioè GDF11 12, che hanno la capacità di ritardare l&#39;invecchiamento in modo coerente ed estendere durata della vita. Nel presente studio, Mesc-CM è stato raccolto senza siero strati (siero fetale bovino, FBS) e l&#39;alimentatore (fibroblasti embrionali di topo, MEF) per escludere la contaminazione di fattori di siero e fattori di secrezione dal MEF. Queste condizioni consentite per un CM di siero e privo di alimentatore che di conseguenza ha permesso l&#39;identificazione accurata di Mesc-specifici fattori secretoria. Questo protocollo proposto è altamente efficiente, relativamente conveniente e facileoperare. Questa tecnica fornisce intuizioni la caratterizzazione di fattori solubili Mesc-derivati ​​che possono mediare un effetto anti-senescenza, che può essere usato per lo sviluppo di un approccio terapeutico privo di cellule sicuro e potenzialmente vantaggiosa verso interventi per le malattie invecchiamento associate e altre rigenerativa trattamenti.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, qualità cellulare ES</td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 unità/ml penicillina e 50&nbsp; mg/ml di streptomicina</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp; &micro; M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp; &micro; M</td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 unità/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3,70%</td></tr><tr><td>Dimetilformammide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>ferrocianuro di potassio</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>di ioduro di propidio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV trascrizione inversa-tasi</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblasti&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per bottiglie</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &mu; m</td></tr></tbody></table>

raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-cell condizionata per un approccio libero-cell

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

La capacità delle cellule staminali embrionali (ESC) e delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) di generare vari tipi di cellule ha aperto nuove strade nel campo della medicina rigenerativa. Tuttavia, nonostante i loro benefici, il potenziale tumorigenico delle ESC e delle iPSC è stato a lungo un ostacolo per le applicazioni cliniche. È interessante notare che è stato dimostrato che le ESC producono diversi fattori solubili che possono promuovere la rigenerazione dei tessuti e ritardare l'invecchiamento cellulare, suggerendo che le ESC e le iPSC possono essere utilizzate anche come metodo di intervento privo di cellule. Pertanto, il metodo per la raccolta di terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo (mESC) (mESC-CM) con una contaminazione minima dei componenti del siero (siero fetale bovino, FBS) e delle cellule di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) è stato molto richiesto. Qui, il presente studio dimostra un metodo ottimizzato per la raccolta di mESC-CM in condizioni prive di siero e alimentatore e per la caratterizzazione di mESC-CM utilizzando letture multiple associate alla senescenza. Questo protocollo fornirà un metodo per raccogliere fattori secretori puri specifici per mESC senza contaminazione del siero e dell'alimentatore.

In origine, mESCs sono mantenuti su un alimentatore MEF in media Mesc con FBS e altri integratori (Figure 1A e 2A). CM è stato raccolto da mESCs a ridotto siero media senza uno strato alimentatore, FBS, o altri supplementi (figure 1B e 2B). Questa condizione la cultura ci permette di raccogliere Mesc specifico mezzo condizionato senza potenziale contaminazione da fattori dall&#39;alimentatore, FBS, o altri supplementi. I...

Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) - e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.

Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono la raccolta di terreno condizionato da cellule staminali embrionali di topo in condizioni di coltura priva di siero e feeder e la caratterizzazione delle funzioni biologiche di questo terreno. Questa procedura fornisce informazioni sull'attività antisenescenza di fattori solubili secreti da cellule staminali embrionali di topo per lo sviluppo di un approccio terapeutico sicuro e privo di cellule per le malattie legate all'età. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Yun-Ui Bae, un professore di ricerca del mio laboratorio.In una cappa di sicurezza biologica, trattare un fibroblasto embrionale di topo o una coltura cellulare MEF con 20 millilitri di terreno MEF integrato con mitomicina C in una piastra di coltura cellulare di 15 centimetri per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS e staccarle con tre millilitri di tripsina EDTA per tre minuti a 37 gradi Celsius. Neutralizzare la tripsina con sei millilitri di terreno MEF fresco quando le cellule si sono sollevate dal fondo della piastra.Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, risospender

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Questo video presenta un metodo per generare precursori di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali di topo. Il protocollo prevede la coltura delle cellule staminali in terreni contenenti specifici inibitori di piccole molecole, che facilitano la proliferazione e l'aggregazione delle cellule staminali in corpi embrioidi (EB). Successivamente, gli EB vengono dissociati con enzimi e piastrati su pozzetti su piastre di coltura rivestite con proteine di adesione per promuovere la loro...

Generazione di precursori corticali di interneuroni da cellule staminali embrionali di topo

Questo video dimostra un metodo per la generazione in vitro di cellule progenitrici neurali (NPC) da cellule staminali embrionali di topo (mESC). Le mESC vengono coltivate in sospensione per formare corpi embrioidi (EB), che vengono poi guidati a differenziarsi in NPC tramite trattamento con acido retinoico in una coltura aderente.

Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.

Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.

Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Impara a raccogliere il medium condizionato da cellule staminali embrionali di topo in condizioni senza siero né alimentatore. Questo metodo caratterizza i fattori solubili anti-senescenza per approcci terapeutici senza cellule nelle malattie legate all'invecchiamento.

Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell

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