L'isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

Gli obiettivi generali di questa procedura sono isolare e caratterizzare una popolazione di cellule T gamma delta non convenzionali da un campione di spazzola endocervicale umana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella comprensione degli eventi immunitari all'interno del compartimento intraepiteliale endocervicale, per aiutare nella progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce uno strumento potente ed efficiente per lo studio dei linfociti T gamma delta intraepiteliali endocervicali, in vitro.

A dimostrare la procedura sarà Laura Romero, una ricercatrice senior del mio laboratorio. Subito dopo il prelievo, posizionare la provetta contenente il cytobrush sul ghiaccio. Entro un'ora dal prelievo, agitare la provetta contenente il citobrush per quattro impulsi di 10 secondi.

Quindi, centrifugare il tubo e rimuovere con cura il pennello senza disturbare la tavolozza. Quindi, aggiungi un millilitro di terreno IMDM alle cellule e posiziona il tubo sul ghiaccio. Posizionare il cytobrush sopra un colino cellulare da 100 millimetri in un tubo conico da 50 millilitri e lavare lo spazzolino con 20 millilitri di IMDM fresco.

Centrifugare il lavaggio. Risospendere la tavolozza in un millilitro di IMDM fresco e rivestire con le cellule nella provetta di raccolta originale del citopennello. Per analizzare le cellule endocervicali mediante citometria a flusso, aliquotare da una a tre volte 10 alla quinta cellula in 100 microlitri di tampone fax per provetta da cinque millilitri ed etichettare le cellule con gli anticorpi e il colorante di vitalità di interesse per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in un millilitro del tampone del kit. Dopo aver fatto girare le cellule, decantare completamente il surnatante. Utilizzare le perle e gli anticorpi di controllo IgG appropriati per impostare i controlli di compensazione.

Quindi, caricare il primo tubo e impostare il gate sulla popolazione totale di cellule endocervicali in un grafico a dispersione longitudinale, seguito dall'esclusione dei doppietti cellulari. Escludere le cellule morte in base alla loro espressione del colorante di vitalità, controllando le cellule CD45 positive e CD3 positive vive. Le cellule gamma delta uno e gamma delta due positive sono definite come le sottopopolazioni di cellule CD3 positive che esprimono gamma delta TCR.

Per isolare le cellule T gamma delta mediante isolamento con biglie magnetiche, risospendere fino a una volta da 10 alla settima cellula endocervicale appena raccolta in 40 microlitri di tampone TCR gamma delta MicroBead kit. Seguendo le istruzioni del produttore per il protocollo di colorazione in due fasi, etichettare le cellule con l'anticorpo anti-TCR gamma delta apten, seguito da microsfere coniugate anti-aptene FITC per 15 minuti a quattro-otto gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in un millilitro del tampone del kit e decantare completamente il surnatante.

Risospendere le celle in 500 microlitri di tampone del kit e applicare la sospensione cellulare direttamente su una colonna di perline magnetiche incastonata nell'apposito magnete separatore, raccogliendo il flusso in un nuovo tubo. Quando tutte le cellule hanno attraversato la colonna, lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone fresco e raggruppare i lavaggi con le cellule raccolte. Per raccogliere le cellule T gamma delta, trasferire la colonna in una provetta conica e utilizzare lo stantuffo della colonna per lavare le cellule T dalla colonna con un millilitro di tampone fresco.

Per isolare le cellule T gamma delta mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, etichettare le cellule con un colorante di vitalità, nel pannello degli anticorpi, come appena dimostrato. Quindi, ordina le cellule in base al loro colorante vitale e alla positività per CD45, CD3 e gamma delta. Una popolazione unica di cellule T che esprimono gamma delta V1 può essere facilmente rilevata in campioni di cellule endocervicali umane.

Un'analisi fenotipica dettagliata delle cellule gamma delta positive CD3 positive rivela che la maggior parte di queste cellule sono CD4 e CD8 negative. La separazione delle microsfere magnetiche delle cellule endocervicali, come appena dimostrato, porta alla purificazione di una popolazione pura di quasi il 98% di queste cellule gamma delta TCR. Questo livello di purezza può essere raggiunto anche tramite la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, convalidando l'uso di entrambe le tecniche per l'isolamento delle cellule T gamma delta endocervicali.

È interessante notare che l'analisi delle cellule intraepiteliali endocervicali, delle cellule T gamma delta, raccolte da pazienti con infezione da HIV di sesso femminile e da donatori sani, dimostra una leggera riduzione del numero e della vitalità di queste importanti cellule in individui con infezione da HIV. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di elaborare rapidamente il campione e di mantenere le cellule in ghiaccio durante l'intera procedura, per mantenere una buona vitalità cellulare.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come lo smistamento di singole cellule combinato con una PCR multiplex ad alta sensibilità, per rispondere a ulteriori domande sulle vie infiammatorie e di segnalazione all'interno del compartimento intraepiteliale endocervicale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV e delle malattie infettive per esplorare nuovi marcatori cellulari di vulnerabilità della mucosa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i linfociti intraepiteliali da un campione di spazzola endocervicale umana.