Name: Lisolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Impara l'isolamento e l'analisi citometrica delle cellule T gamma delta endocervicali umane. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie locali nel compartimento endocervicale in vitro.

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Ringraziamo i partecipanti allo studio Miami WIHS per la loro disponibilità a partecipare a questo lavoro. I dati in questo manoscritto sono stati raccolti dalle donne Miami Interagency HIV Study (WIHS). I contenuti di questa pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano le posizioni ufficiali del National Institutes of Health (NIH). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie infettive e Interagency HIV Infection Study femminile (WIHS) [concessione numero U01 AI103397], National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health [codice di autorizzazione P30AI073961], Centro Nazionale per l&#39;avanzamento traslazionale Scienze e l&#39;Istituto nazionale sulla minoranza Salute e disparità, Istituto nazionale della Salute [codice di autorizzazione UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e National Institute of Child Health e lo sviluppo umano, National Institute of Health [codice di autorizzazione K23HD074489].

attività di studio ha avuto luogo presso l&#39;Università di Unità di Ricerca HIV Miami, in collaborazione con l&#39;HIV Interagency Studi delle Donne Miami (WIHS) e il Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Università di Miami Miller School of Medicine) l&#39;approvazione è stata ottenuta prima per il reclutamento e le eventuali procedure di valutazione o di studio correlati. Raccolta del campione 1. endocervicale Brush NOTA: I partecipanti sono stati sottoposti a un esame vaginale eseguito da MD addestrato o il ginecologo e la raccolta dei linfociti intraepiteliali sono stati eseguiti in esame con lo speculum inserendo cytobrush. <ol><li> caratteristiche dei partecipanti <ol><li> Reclutare donne partecipanti che sono tra i 18 ei 45 anni di età, sessualmente attivi, non è incinta e non sui farmaci contraccettivi o con un dispositivo intrauterino. </li><li> Prima di un esame vaginale, hanno i partecipanti sono sottoposti a un pareggio 10 ml di sangue in verdevacutainer eparina top per l&#39;isolamento delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). per servire come controllo per endocervicale analisi intraepiteliale 9. </li></ol></li><li> Raccolta dei campioni endocervicali <ol><li> Inserire uno speculum sterile di dimensioni adeguate in vagina senza lubrificazione. Utilizzare acqua calda per facilitare l&#39;inserimento del speculum e garza sterile per pulire il muco. La posizione del speculum consente la completa visualizzazione del sistema operativo e portio. </li><li> Inserire la spazzola endocervicale nel canale endocervicale fino a quando solo le setole più vicini alla mano sono visibili. Ruotare il pennello in senso orario per 360 °. Trasferire la spazzola in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di mezzo IMDM. </li><li> Subito dopo la raccolta, posizionare il tubo contenente cytobrush sul ghiaccio. Per ottenere elevata vitalità delle cellule intraepiteliali raccolti, consegnare il cytobrush al laboratorio e processo entro 1 ora. </li></ol></li></ol><ol><li> Tubo Vortex contenente cytobrush endocervicale applicare 4 colpi (10 sec) brevi. </li><li> Centrifugare la provetta contenente cytobrush, per 10 min a 250 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il cytobrush dal tubo (non disturbare il pellet sul fondo della provetta) e aggiungere 1 ml di mezzi IMDM e posizionare il tubo in ghiaccio. </li><li> Posizionare il cytobrush sul setaccio cella 100 mm superiore del tubo 50 ml. </li><li> Lavare il cytobrush con 20 ml IMDM. </li><li> provetta da centrifuga per 10 minuti a 250 x g. </li><li> Decantare il surnatante e le cellule in pellet risospendere in 1 ml IMDM e si combinano con il pellet già ri-sospensione descritto in 2.3. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato 10 o contare le cellule utilizzando emocitometro combinando 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di colorante blu trypan. Delicatamente pipettare su e giù dieci volte per mescolare le cellule e colorante. Carico di 10 microlitridella miscela nell&#39;apertura di una delle due camere emocitometro. Contare tutte le celle in cinque aree della griglia. Tenere un conteggio separato delle cellule vitali e non vitali. Determinare la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:% di cellule vitali = cellule non vitali x 100 / totale cellule numero delle cellule. Determinare la concentrazione successiva cellule per ml (e il numero totale di cellule) usando i seguenti calcoli. Totale cellule per ml = x cellule totali contate (fattore di diluizione / numero di piazza contate) x 10.000 cellule / ml. </li><li> Congelare isolate cellule endocervicali utilizzando media congelamento contenente il 10% di DMSO e il 90% FBS. </li></ol> 3. Citometria a Flusso <ol><li> Risospendere 1-3 x 10 5 cellule endocervicali in 100 microlitri di buffer FACS (PBS contenente 1% di albumina sierica bovina </li><li> Aggiungere 1 ml / 10 6 Live / Dead fissabile giallo Morto kit cellulare Stain e anticorpi per marcatori di superficie alle concentrazioni descritte nella tabella 1. </li><li> Incubare le cellule per 30 minuti a + 4 ° C, al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 1 mL FACS tampone e le cellule e provette da centrifuga per 5 min a 350 xg </li><li> Risospendere pellet cellulare in 300 microlitri di 1% paraformaldeide. </li><li> Preparare controlli compensazione utilizzando perline e anticorpi utilizzati per la colorazione aggiungendo 100 ml di tampone FACS e una goccia delle perle e la stessa concentrazione di anticorpi usati per la colorazione del campione. </li><li> Acquisire perline colorate e campioni su un citofluorimetro, dotato di 405 nm, 488 nm e 635 nm laser. </li></ol> L&#39;isolamento delle cellule 4. endocervicale Gamma Delta T <ol><li> Isolamento tallone magnetico <ol><li> Risospendere endocervicale pellet cellulare (≤ 10 7 cellule totali), descritto in 2.6, in 40 ml di tampone incluso nel kit di Gamma Delta microperla TCR fa riferimento la tabella di materiali e reagenti. </li><li> Seguire le istruzioni del kit per il protocollo di colorazione in due fasi: in primo luogo, ingegnoh anti-TCR gamma delta Hapten-anticorpo e la seconda, con l&#39;anti-aptenici microsfere-FITC </li><li> Dopo incubazione di 15 min a 4-8 ° C, lavare le cellule aggiungendo 1 ml di tampone e centrifugare a 300 xg per 10 min. Decantare il supernatante invertendo la provetta, e toccare secco con l&#39;aiuto di un foglio di carta. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di condizione di buffer e preparare la colonna magnetica ponendolo in separatore magnetico appropriata secondo il protocollo del fornitore. </li><li> Applicare sospensione cellulare nella colonna e raccogliere le cellule senza etichetta che attraversano e lavare colonna 3x con adeguate quantità di tampone (500 mL). Eseguire fasi di lavaggio aggiungendo tampone tre volte, ogni volta dopo il serbatoio colonna è vuota. Raccogliere dell&#39;effluente totale. Questa è la frazione di cellule senza etichetta, negativo </li><li> Rimuovere la colonna formano il separatore magnetico e pipetta 1 ml di tampone sulla colonna e subito scovare frazione con l&#39;etichetta magneticamentecellule cato applicando saldamente lo stantuffo fornita con la colonna. NOTA: Isolated Gamma Delta cellule T sono già fluorescente macchiato per analisi di flusso-citometria da magneticamente etichettati microsfere anti-aptene sono coniugati con FITC fluorescenti colorante. </li></ol></li><li> cell sorting <ol><li> Per l&#39;ordinamento delle cellule, le cellule endocervicali etichette con Die vitalità e pannello di anticorpi come descritto nel paragrafo 3. </li><li> Impostare varchi elettronici sul vivo, CD45 + CD3 + e delta gamma cellule positive e effettuare una cernita delle cellule. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno commerciale o di altra associazione che potrebbe rappresentare un conflitto di interesse (ad esempio, magazzino farmaceutico di proprietà, di consulenza, l&#39;appartenenza Advisory Board, brevetti rilevanti, o finanziamenti per la ricerca).

Valutazione della vulnerabilità femminile della mucosa del tratto genitale inferiore è una componente essenziale di studi clinici che affrontano il rischio di acquisizione e trasmissione del virus HIV. Tipicamente FGT vulnerabilità alle infezioni da HIV è valutata misurando immunomodulatori solubili nelle secrezioni genitali (citochine, chemochine e peptidi antimicrobici) 12, 13. Tuttavia, questi marcatori sono solo indicative di infiammazione vaginale, sono inf...

Abbiamo sviluppato la metodologia di utilizzo di campioni endocervicali pennello per valutare le cellule T GD intraepiteliali. Il canale endocervicale è rivestito da un singolo strato di epitelio colonnare. Linfociti intraepiteliali rappresentano linfociti di prima linea che risiedono all&#39;interno dello strato epiteliale che può rapidamente avviare risposte immunitarie su di incontrare microbi patogeni 7, 8. Comprendere gli eventi immunologici del vano intraepiteliale endocervicale è importante per la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni, compreso l&#39;HIV. Il nostro metodo può essere applicato per i campioni endocervicali umane appena raccolti, nonché le cellule endocervicali congelati per esplorare ulteriormente il ruolo delle cellule T GD intraepiteliale nelle donne con infezione da HIV o a rischio di infezione da HIV. L&#39;obiettivo principale di questo protocollo è quello di scoprire nuovi eventi immunologici nel vano intraepiteliale endocervicale e evaluatle risposte delle cellule T e GD come marker di vulnerabilità della mucosa nelle donne con infezione da HIV. Le lacune sostanziali nella conoscenza intorno FGT immunità sono in parte a causa della difficoltà di raccolta e l&#39;elaborazione dei campioni delle mucose con successo. Inoltre, il complesso eterogeneità delle cellule immunitarie mucosali, e la loro interconnessione tra loro, sono sfide importanti per identificare misurazioni clinicamente rilevanti che riflettono lo stato e la capacità del sistema immunitario. Abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule altamente purificate intraepiteliali GD T che possono essere ulteriormente analizzate utilizzando altamente multiplex, tecnologie unicellulari che possono essere critiche per l&#39;identificazione dei meccanismi alla base della FRT immunità.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Beckman Coulter (analizzatore di vitalità cellulare della serie Vi-CELL Beckman</td><td>Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, dimetilsolfossido&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, siero fetale bovino</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte gialle riparabili.</td><td>Life</td> <td>Technologies,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Fortessa&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Perline di compensazione reattiva dell'ammina ArC (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>kit di microperline gamma/delta anti-TCR&nbsp;</td><td>Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>Colonna</td><td></td> MS <td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separatore</td><td></td> MACS <td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento e la citometria a flusso analisi di human endocervicale gamma delta t cells

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

La femmina tratto riproduttivo (FRT) mucosa sistema immunitario serve come la prima linea di difesa. Una migliore conoscenza della mucosa genitale è quindi essenziale per comprendere la patogenicità dei diversi agenti patogeni, tra cui l&#39;HIV. Gamma Delta cellule (GD) T sono il prototipo delle cellule T &quot;non convenzionali&quot; e rappresentano una parte relativamente piccola sottogruppo di cellule T definite dalla loro espressione dei recettori delle cellule T eterodimeriche (TCR) composte da catene di gamma e delta. Questo li distingue dalle cellule T classici e molto meglio noti CD4 + helper e le cellule CD8 + T citotossici che sono definiti da TCR alfa-beta. cellule T GD spesso mostrano la localizzazione tessuto-specifica e sono arricchiti in epitelio. le cellule T GD orchestrare le risposte immunitarie a infiammazione, la sorveglianza del tumore, malattie infettive, e autoimmunità. Qui, vi presentiamo un metodo per isolare ed analizzare riproducibile endocervicali intraepiteliale linfociti T GD umani. noi ettarove utilizzati campioni cytobrush endocervicali da donne che partecipano alle donne Interagency HIV Infection Study (WIHS). La conoscenza GD cellule T interazioni durante le condizioni in cui vi è un insulto alla mucosa vaginale potrebbe essere applicata a qualsiasi studio clinico in cui la vulnerabilità della mucosa è rivolta, compreso lo sviluppo di oltre microbicides.In vaginale, la conoscenza di risposte delle cellule della mucosa GD T ha possibilità di applicazione di GD T cell-based terapia immunitaria nel trattamento delle malattie infettive.

Recentemente, abbiamo analizzato intraepiteliale cellule T GD endocervicali e siamo stati il primo a riferire circa la perdita di cellule endocervicale T gamma delta in donne infette da HIV 9, 11. Qui, descriviamo il protocollo per isolare e analizzare il sottogruppo di cellule T gamma delta endocervicale. Come mostrato in figura 1, le cellule T GD possono essere facilmente rilevati nei campioni di cellule endoce...

Descriviamo qui un metodo di isolamento per ottenere linfociti intraepiteliali endocervicali umani per l'analisi delle cellule T gamma delta intraepiteliali. Questo protocollo può essere esteso per la purificazione delle cellule T gamma delta endocervicali mediante biglie magnetiche o mediante smistamento cellulare.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono isolare e caratterizzare una popolazione di cellule intraepiteliali non convenzionali, i linfociti T gamma delta, da un campione endocervicale umano ottenuto mediante spazzolamento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali per comprendere gli eventi immunitari all'interno del compartimento intraepiteliale endocervicale, facilitando la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce uno strumento potente ed efficiente per lo studio in vitro dei linfociti T gamma delta intraepiteliali endocervicali.La procedura sarà dimostrata da Laura Romero, un'associata senior del mio laboratorio. Immediatamente dopo il prelievo, posizionare il tubo contenente lo spazzolino citologico sul ghiaccio. Entro un'ora dal prelievo, eseguire la vortexazione del tubo contenente lo spazzolino citologico per quattro impulsi di 10 secondi ciascuno.Quindi, centrifugare il tubo ed estrarre con attenzione il citobrush senza disturbare la paletta. Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo IMDM alle cellule e porre il tubo sul ghiaccio. Posizionare il citobrush

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Questo video dimostra un protocollo per l'isolamento basato sulla marcatura magnetica di una popolazione a bassa concentrazione di cellule T CD4+Vδ1+γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Utilizzando una combinazione di anticorpi anti-Vδ1 coniugati con FITC, microsfere magnetiche anti-FITC e perline superparamagnetiche rivestite con anticorpi anti-CD4, le cellule T CD4+Vδ1+ possono essere purificate con successo dalla popolazione PBMC.

Isolamento selettivo di cellule T CD4+ Vδ1+ γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano

L'uso del campionamento con citospazzola per raccogliere linfociti e monociti dall'endocervice è una tecnica minimamente invasiva che fornisce campioni per l'analisi dell'immunità del tratto genitale femminile. In questo protocollo, descriviamo la raccolta di campioni di citospazzola e l'isolamento delle cellule immunitarie per i saggi di citometria a flusso.

Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la clonazione della scarsa entità di cellule T periferiche Vδ1+CD4+ che è, come abbiamo mostrato di recente, un progenitore extratimico di cellule T αβ. Questa tecnica consente di isolare quantitativamente, clonare ed espandere in modo efficiente queste cellule in coltura ex vivo.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Descriviamo qui un metodo per isolare e purificare le cellule dendritiche da diversi compartimenti anatomici nel tratto riproduttivo femminile umano per la valutazione delle loro caratteristiche fenotipiche e funzionali. Questo metodo può essere adattato per isolare altre cellule immuni o cellule dendritiche da altri tessuti mucosi.

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

Qui, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di CD4+ cellula T sottoinsiemi da sangue periferico umano è descritto. Purificato CD4+ T-cellule sono analizzate tramite flusso cytometry per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi delle cellule helper T-follicolare.

Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Presentato è un protocollo per l'espansione del prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta (γδ). I linfociti sono isolati per elutriazione e arricchiti con acido zoledronico e interleuchina-2. Le cellule T alfa-beta vengono esaurite utilizzando un dispositivo di separazione magnetica di grado clinico. Le cellule γδ sono co-coltivate con cellule derivate da K562, che presentano antigeni artificiali ed espanse.

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Questo è un metodo per isolare le cellule linfoidi uterine da topi sia gravidi che non gravidi. Questo metodo può essere utilizzato per molteplici applicazioni a valle come la fenotipizzazione FACS, lo smistamento cellulare, i saggi funzionali, l'RNA-seq e la proteomica. Il protocollo qui dimostra come fenotipizzare le cellule linfoidi innate uterine del gruppo 1 mediante citometria a flusso.

Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Il presente protocollo descrive un flusso di lavoro sperimentale che consente l'analisi ex vivo della stimolazione di cellule T umane in un sistema di co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate.

Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Impara l'isolamento e l'analisi citometrica delle cellule T gamma delta endocervicali umane. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie locali nel compartimento endocervicale in vitro.

L'isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

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