L'uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

L'obiettivo generale di questo test funzionale in vitro è valutare vari aspetti della fagocitosi mediata da FC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunoematologia e della medicina trasfusionale, come ad esempio qual è il significato clinico degli auto- e allo-anticorpi contro i globuli rossi. Questa tecnica fornisce un test biologico funzionale che può essere eseguito in vitro per prevedere l'esito della trasfusione in quei pazienti con anticorpi preformati contro i globuli rossi.

A dimostrare la procedura sarà Cindy Tong, una studentessa laureata del mio laboratorio. Ora non dimenticare che lavorare con il sangue umano può essere pericoloso e che precauzioni come indossare camici e guanti protettivi dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver prelevato da uno a due campioni di sangue intero da 10 millilitri da un donatore sano in provette vacutainer contenenti destrosio acido citrato mediante puntura venosa, le provette vengono inserite in una cabina di biosicurezza di classe II e il sangue diluito in un rapporto uno a uno in terreno completo caldo.

Quindi, pipettare lentamente le cellule del sangue lungo i lati di una provetta da centrifuga su un gradiente di densità a temperatura ambiente, facendo attenzione a non mescolare gli strati. Separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, scartare lo strato superiore di plasma e utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per trasferire il PBMC contenente buffy coat in una nuova provetta da 15 millilitri.

Lavare le PBMC isolate tre volte in PBS, risospendendo le cellule in tre-sette millilitri di terreno dopo la terza centrifugazione. Dopo il conteggio, diluire le cellule a 1,75 volte da 10 a una sesta di cellule per millilitro di concentrazione in terreno completo e seminare 400 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di un vetrino a otto camere per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 con piena umidità. Per opsonizzare i globuli rossi R2R2, lavare prima i globuli rossi tre volte in PBS.

Diluire il pellet di R2R2 dopo la terza centrifugazione in un rapporto di uno a uno con anticorpi policlonali anti-D da siero umano per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius con miscelazione intermittente. Al termine dell'opsonizzazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e poi lavarle altre tre volte in PBS come appena dimostrato. Risospendere il pellet a un volume dell'1,25% in volume in mezzo RPMI completo.

Successivamente, sostituire il surnatante da ciascun pozzetto del vetrino a otto camere con 400 microlitri di cellule R2R2 opsonizzate per due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, utilizzare gli adattatori per vetrini per rimuovere le camere, tamponando l'eccesso di R2R2 con un tovagliolo di carta. A questo punto, riempire un becher da 100 millilitri con PBS e immergere lentamente ogni vetrino da 30 a 40 volte nella soluzione salina per rimuovere la maggior parte dell'R2R2 non fagocitato.

Dopo l'essiccazione, fissare i vetrini in metanolo al 100% per 45 secondi e lasciare asciugare le cellule prima di montare i campioni con i vetrini. Il giorno successivo, caricare ogni vetrino su un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 40X e contare manualmente almeno 200 monociti e il numero di R2R2 fagocitati all'interno di ciascun monocita utilizzando un contatore in ciascuna mano per quantificare simultaneamente il numero di monociti e il numero di cellule R2R2 fagocitate per campione. L'immunoglobulina per via endovenosa si lega e blocca i recettori FC che inibiscono la fagocitosi in modo dose-dipendente con un'inibizione quasi del 100% osservata a partire da concentrazioni di 200 microgrammi di immunoglobulina per via endovenosa per millilitro e con quasi nessuna inibizione osservata a concentrazioni inferiori a 0,5 microgrammi dell'inibitore.

Quando gli indici fagocitici sono normalizzati al controllo positivo R2R2 come 0% di inibizione, è possibile determinare una curva di inibizione con un IC 50 di tre microgrammi per millilitro. Con l'esperienza, la microscopia a contrasto di fase può essere utilizzata per distinguere i monociti dai globuli rossi contaminanti e i vacuoli dai globuli rossi fagocitati. Durante la quantificazione devono essere evitati ammassi di cellule dense e detriti così come l'eccessiva opsonizzazione dei globuli rossi R2R2 che può portare a un'accentuazione della fagocitosi che sovraffolla l'interno dei monociti e interferisce con un'accurata analisi fagocitica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunocitochimica o l'immunofluorescenza utilizzando la microscopia confocale per rispondere a ulteriori domande sull'espressione proteica fagocitica, le interazioni dei globuli rossi e la compartimentazione. Con il suo sviluppo iniziale e l'ulteriore ottimizzazione, questa tecnica informerà il modo in cui i ricercatori nei campi della medicina trasfusionale e della biologia cellulare esplorano i sistemi di opsonizzazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test monostrato di monociti per valutare i tipi di interazione anticorpale che provocano la fagocitosi.