Name: Luso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Impara l'assaggio a monostrato di monociti per valutare la fagocitosi mediata da recettori Fcγ usando monociti primari isolati da sangue umano. Questo metodo funzionale predice gli esiti trasfusionali in pazienti con anticorpi preformati.

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Gli autori ringraziano i Canadian Blood Services per un premio del programma di borse di studio per laureati a T.N.T. Questa ricerca ha ricevuto il sostegno finanziario del Canadian Blood Services' Centre for Innovation, finanziato dal governo federale (Health Canada) e dai ministeri provinciali e territoriali della salute. Le opinioni qui riportate non riflettono le opinioni dei governi federali, provinciali o territoriali del Canada.

Ottenere l&#39;approvazione per l&#39;uso di campioni umani da parte l&#39;etica della ricerca pensione / pensione revisione istituzionale, e ottenere il consenso firmato da tutti i donatori umani. La MMA può essere eseguita anche utilizzando PBMC del mouse in un modo simile come il saggio umana, in seguito all&#39;approvazione uso animale etica. Il MMA utilizza tecniche di coltura dei tessuti asettiche. NOTA: Vedere la Figura 1. NOTA: Anche se si consiglia l&#39;uso di un armadio biocontenimento livello 2 durante il dosaggio per mantenere la tecnica asettica, come il metodo è solo un metodo di coltura &quot;a breve termine&quot;, non c&#39;è il tempo davvero sufficiente per i batteri di contaminare il test. Pertanto, se un cabinet biocontenimento livello 2 non esiste, piuttosto che acquistare uno solo per questo saggio, il saggio può essere eseguito al di fuori di un armadio biocontenimento, su un banco aperto. L&#39;uso di un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2, tuttavia, non è un&#39;opzione e deve essere utilizzato perRisultati ottimali. L&#39;isolamento delle cellule 1. sangue periferico mononucleari <ol><li> Ottenere sangue umano intero da un donatore sano o di un paziente tramite venipuntura utilizzando vacutainer contenenti acido citrato destrosio (ACD) anticoagulante (giallo-top tubes). NOTA: sangue intero può essere conservato in ACD a temperatura ambiente (18-22 ° C) per un massimo di 36 ore prima di procedere alla fase successiva 11. Normalmente, 1-2 vacutainer 10 ml di sangue intero sono sufficienti per il dosaggio. </li><li> Diluire il sangue intero 1: 1 v / v in acqua calda completo RPMI (RPMI-1640 supplementato con siero fetale bovino al 10%, 20 mM HEPES, e 0,01 mg / ml gentamicina). </li><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero diluito con densità centrifugazione in gradiente, come raccomandato dal produttore (vedere elenco dei materiali). Strato sangue diluito molto lentamente sopra il gradiente di densità (riscaldato a temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Ridurre al minimo la quantità di Mixing all&#39;interfaccia per la separazione ottimale del sangue attraverso la stratificazione accuratamente la miscela di sangue in un modo a gocce o utilizzando una pipetta. <ol><li> Lasciare la miscela di sangue al layer lentamente sopra la parte superiore del gradiente di densità posizionando la punta della pipetta vicino al gradiente di densità e consentendo la miscela sangue per correre lungo il lato del tubo molto lentamente. </li><li> A seconda della scala dell&#39;esperimento, strato 10 ml di miscela di sangue sulla cima di 3 mL di gradiente di densità (in un tubo da 15 ml) o strato 35 ml di miscela di sangue sulla cima di 15 mL di gradiente di densità (in 50 mL tubo). Tipicamente, 10 ml di sangue intero fornisce 10 milioni di PBMC, con qualche variazione donatore-to-donatore. NOTA: È molto importante che vi sia alcuna miscelazione della miscela di sangue con gradiente di densità. La miscela sangue dovrebbe strato sopra il gradiente di densità e salire lentamente fino a che tutto il sangue è sopra il gradiente di densità. </li><li> Centrifugare la miscela stratificata a 700 g per 30 minuti senza freni. il centrmiscela ifuged dovrebbe separare in 5 strati (dall&#39;alto verso il basso): plasma, buffy coat (contenente PBMC), materiali gradiente di densità, granulociti, e globuli rossi. </li><li> Rimuovere e scartare la maggior parte del plasma e recuperare attentamente il contenuto buffy coat (PBMC) in un nuovo tubo da 15 ml con una pipetta Pasteur e una lampadina di aspirazione. NOTA: La rimozione dello strato di buffy coat è effettivamente fatto applicando aspirazione sulla pipetta Pasteur durante l&#39;esecuzione di un movimento circolare intorno alla parte esterna dello strato, con la punta della pipetta contro il tubo. </li></ol></li><li> Lavare le PBMC isolate tre volte in pH 7,3 tampone fosfato salino (PBS) per centrifugazione a 350 xg per 10 min (con freni pieni) tra lavaggi. Ricostituire il pellet PBMC in terreno completo RPMI. A seconda delle dimensioni del pellet, 3-7 ml di mezzo è sufficiente. </li><li> Contare il PBMC utilizzando trypan blue e un emocitometro. contare solo quelle cellule che non sono macchiati dal blu trypan. Reconstitute le PBMC a 1.750.000 cellule / ml in terreno completo RPMI. </li><li> Seed 400 ml (700.000 cellule) in ciascun pozzetto di una sagoma 8-camera. Incubare il vetrino a 37 ° C, completamente umidificata incubatore di coltura tissutale (supplementato con 5% CO 2) per 1 h per permettere i monociti / macrofagi di aderire. </li></ol> 2. Pre-trattamento dei aderito monociti NOTA: Questo passaggio è necessario solo se alla ricerca di modi per inibire o migliorare la fagocitosi. <ol><li> Pre-treat aderito monociti con qualsiasi farmaco (s) o composti (s) di interesse. Ricostituire il farmaco (s) o altro materiale di prova alla concentrazione desiderata con mezzo completo RPMI. NOTA: per esempio, 200 mg / mL di IVIG è in genere utilizzato per produrre un&#39;inibizione 95-100% della fagocitosi quando si utilizza monociti umani. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante contenente le cellule non aderenti dalla slitta 8-camera dopo 1 h di incubazione (dopo il punto 1.6). Sostituirlo con 400ml di un farmaco o altro trattamento e incubare per 1 ora a 37 ° C. <ol><li> Quando aspirazione e sostituendo soluzioni nella slitta 8-camera, assicurarsi di controllare il flusso dei fluidi in modo che le cellule debolmente aderito non tolgono. Inoltre, lavorare con solo 2-3 pozzetti vuoti alla volta ed evitare l&#39;essiccamento dei pozzetti. NOTA: Tipicamente, ogni trattamento viene eseguito in triplicato tecnici. </li></ol></li></ol> 3. Opsonizzazione di R 2 R 2 globuli rossi NOTA: L&#39;R 2 R 2 utilizzati qui sono ottenute dal sangue Collezione Center (Canadian Blood Services), ma sono anche disponibili in commercio. Opsonizzati R 2 R 2 globuli rossi vengono utilizzati come controllo positivo per la fagocitosi FcγR-mediata. Naïve R 2 R 2 deve essere conservato in soluzione di Alsever (per prolungare la shelf life) a 4 ° C per un massimo di 1 mese. La soluzione di Alsever è fatto in casa e composta da 0,8% W v trisodio citrato (diidrato), 1,9% w / v destrosio, 0,42% w / v di cloruro di sodio e 0,05% w / / acido citrico v (monoidrato). Se R 2 R 2 cellule non sono disponibili, altre cellule Rh-phenotyped, come R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, o R 2 R, può essere utilizzato. <ol><li> Lavare R 2 R 2 (CDE / CDE) globuli rossi nel PBS per un totale di tre volte utilizzando centrifugazione a 350 xg per 5 minuti ciascuna. NOTA: La quantità di globuli rossi necessari dipende dalla dimensione sperimentale e può essere back-calcolato. Lavare sempre una quantità in eccesso di globuli rossi, globuli rossi poiché sono persi durante ogni lavaggio causa di lisi o durante la rimozione del supernatante. Ad esempio, in un esperimento con 5 trattamenti e 2 controlli, tutti condotti in triplicato tecnici, c&#39;è un totale di 21 pozzetti. 21 pozzi con 400 ml / pozzetto di 1,25% miscela RBC indica che 105 ml di sacco, opsonizzati sono necessari RBC. 200 ml di RBC dovrebbe essere inizialmente lavato e 150 &amp; #181; L opportuno opsonizzati per garantire che vi sia una adeguata quantità di globuli rossi per la fase fagocitosi. </li><li> Opsonize il lavato R 2 R 2 pellet con 1: 1 v / v policlonali anti-D anticorpi da siero umano e incubare per 1 ora a 37 ° C, con miscelazione intermittente. NOTA: Se policlonali anticorpi anti-D non sono disponibili, è possibile utilizzare anticorpi monoclonali anti-D, che sono disponibili in commercio, o anti-D che viene normalmente utilizzato per Rh profilassi immunitaria, che può essere ottenuto da banche del sangue o trasfusioni Servizi. test ottimizzazione dovrebbe essere condotta all&#39;inizio, quando si imposta il test, e ogni volta che il passaggio sacco di anticorpi policlonali non-titolato o il passaggio a un anticorpo monoclonale. Questo è di identificare la concentrazione ottimale o volume di anti-D richiesto per un test antiglobulina (IAT) risultato compreso tra 3+ e 4+ e un risultato di fagocitosi tra 70-90 eritrociti fagocitati per 100 monociti contati. </li><li> Lavare il opsonized R 2 R 2 un totale di tre volte in PBS mediante centrifugazione a 350 xg per 5 minuti ciascuna. NOTA: opsonizzazione di successo di R 2 R 2 può essere confermata eseguendo una IAT indiretta. Brevemente, secondarie policlonali anticorpi anti-umani vengono aggiunti per legare anticorpi opsonizzante primarie sulle superfici RBC, e il segnale amplificato possono essere osservati sotto forma di emoagglutinazione. Un dettagliato protocollo produttore può essere trovato nel file materiali supplementari. </li><li> Ricostituire il lavato R 2 R 2 pellet al 1,25% v / v usando mezzo completo RPMI. NOTA: Eccesso opsonizzati 2 R 2 R può essere conservato in soluzione di Alsever a 4 ° C per una settimana. </li></ol> 4. La fagocitosi mediata da recettori Fc <ol><li> Aspirare il farmaco o mezzo supernatante dalla slitta 8-camera e aggiungere 400 ml di 1,25% v / v R 2 R 2 miscela. Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> A poppaer 2 h di incubazione, rimuovere le camere utilizzando gli adattatori del produttore. Tamponare l&#39;eccesso di R 2 R 2 su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che la diapositiva non si asciughi. </li><li> Riempire un bicchiere da 100 ml con PBS. Immergere e lavare la slitta spostando lentamente la slitta avanti e indietro (circa 30-40 colpi) per rimuovere la maggior parte dei non-fagocitati R 2 R 2. </li><li> Rimuovere il vetrino dal PBS. Tamponare l&#39;eccesso di PBS usando un tovagliolo di carta o tessuto e aria asciugare la diapositiva. </li><li> Fissare la slitta di aria secca in 100% di metanolo per 45 s. Poi, aria asciugare il vetrino fisso. NOTA: diapositive può essere fissato utilizzando un altro metodo che è più compatibile per la colorazione downstream, quali la macchia Grünwald-Giemsa 21 o Wright-Giemsa 22. </li><li> Montare la slitta con un in-house fatta di montaggio elvanol medio (o di un altro mezzo di montaggio disponibile in commercio) e aggiungere lamelle. NOTA: Elvanol mezzo di montaggio è composto da 15% w / v poresina alcool lyvinyl e il 30% v / v in PBS glicerina. La miscela viene riscaldata fino a quando tutta la resina è sciolto e la glicerina è omogeneamente miscelato. Questo può essere sostituito con altro mezzo di montaggio disponibile in commercio. </li><li> Lasciare che il supporto per asciugare durante la notte prima di quantificazione. </li></ol> 5. Quantificazione della fagocitosi <ol><li> Utilizzando un microscopio a contrasto di fase e una lente obiettivo 40X, quantificare manualmente la quantità di eventi fagocitarie contando almeno 200 monociti e il numero dei fagocitati R 2 R 2 all&#39;interno di questi monociti. Avere un contatore in ogni mano per quantificare contemporaneamente il numero dei monociti e il numero di fagocitati R 2 R 2. </li><li> Ottenere l&#39;indice medio di fagocitosi dividendo il numero di fagocitati R 2 R 2 per il numero di monociti e moltiplicando per 100. espresso i dati come la media (indice di fagocitosi media) ± l&#39;errore standard della media (SEM). </li&gt; </ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il MMA è una tecnica laboriosa che richiede competenze sia nella coltura di tessuti e microscopia. Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo: 1) generazione del monostrato monociti; 2) opsonizzazione dei globuli rossi, e 3) la quantificazione manuale. Il monostrato monociti non aderisce fortemente alla diapositiva camera, in modo pH fisiologico deve essere mantenuta durante tutta la seduta 11 e un numero adeguato di PBMC dovrebbe essere seminato. pipettaggio vigoroso, che potrebbe disturbare le cellule aderito, dovrebbe essere evitato. Un approccio è quello di rimuovere sempre e aggiungere soluzioni dal medesimo angolo della camera e per assicurare che il movimento è lento e costante. Allo stesso modo, durante l&#39;ultima fase di lavaggio per rimuovere l&#39;eccesso di globuli rossi, il movimento deve essere lento e costante. Questo assicura il minimo disturbo al monostrato pur eliminando la maggior parte dei globuli rossi non-fagocitati. lavaggio inadeguata porterà ad un fondo elevato di globuli rossi contaminanti, il che rende qua manualentification difficile. In secondo luogo, i globuli rossi R 2 R 2 devono essere sufficientemente opsonizzati per ottenere un indice medio fagocitosi del 80-120 per il controllo fagocitosi. Questa gamma dei fagociti desiderato un equilibrio tra la facilità di conteggio (ad esempio, monociti con più di 5 fagocitati globuli rossi sono difficili da quantificare con precisione) e il mantenimento di una adeguata quantità di fagocitosi per l&#39;analisi statistica. Il grado di opsonization può essere confermata da un IAT, ed è necessaria una lettura tra 3+ a 4+. L&#39;R 2 R 2 RBC deve essere eliminata quando c&#39;è eccesso lisi durante il lavaggio, quando il supernatante diventa rosso scuro, o quando una diminuzione significativa nella fagocitosi è osservata in esperimenti a causa dell&#39;invecchiamento delle cellule in deposito. Infine, la quantificazione manuale utilizzando il microscopio può essere difficile, soprattutto quando si confrontano i conteggi tra il personale di laboratorio e tra esperimenti. Esaminando stesso campo in ogni pozzetto, o semplicemente contando più cellule, Un conteggio più coerente può essere ottenuta. Si raccomanda di formazione Side-by-side con un tecnico esperto e l&#39;uso di un insieme designato di diapositive formazione. Un importante critica del MMA è la soggettività del passo quantificazione manuale. Tuttavia, con una formazione adeguata, la coerenza può essere ottenuto attraverso diversi contatori. Un altro limite è la intrinseche differenze donatore-to-donatore in monociti capacità fagocitarie e in R 2 R livelli di espressione dell&#39;antigene 2 di superficie, che è una fonte di variazione dei dati quando si tratta di campioni umani. Altre tecniche alternative sono disponibili per l&#39;esame fagocitosi FcγR-mediata. La maggior parte dei kit commerciali utilizzano uscita fluorescente per monitorare la fagocitosi (ad esempio, bioparticelle, sensibile al pH della proteina di fluorescenza, o sfere di lattice fluorescenti IgG-etichettati). L&#39;uso di uscita fluorescente non offrono quantificazione più oggettiva, ma ha anche bisogno di ConSider la disponibilità, costo e formazione associata con l&#39;uso di un microscopio a fluorescenza o un citometro a flusso, nonché la dipendenza conseguente upon kit disponibili in commercio. Infine, questo dosaggio può essere modificato a seconda della domanda di ricerca. Ad esempio, quando si verifica l&#39;inibizione farmaco di fagocitosi, monociti possono sia essere pretrattate o co-incubate con entrambi i farmaci e RBC opsonizzati (cioè, un saggio di competizione). La segnalazione a valle di anticorpi di diversi sottotipi, anticorpi chimerici, o costrutti ricombinanti può essere testato. Con i recenti progressi nello sviluppo di un sangue dell&#39;antigene nullo universale 24, la MMA potrebbe essere utilizzato nelle schermate iniziali di questi globuli rossi antigene-null con diversi anticorpi per valutare se esiste effettivamente un efficacia abbassato nello scatenare la fagocitosi.

Il test monostrato dei monociti (MMA) è un test in vitro originariamente sviluppato per prevedere meglio gli esiti delle trasfusioni di sangue in pazienti con auto- o alloanticorpi ai globuli rossi (RBC)1-5. Valutando l'effetto degli anticorpi anti-globuli rossi nella mediazione della fagocitosi mediata dal recettore Fcγ (FcγR) utilizzando questo test in vitro, è possibile prevedere l'esito clinico in vivo. Infatti, l'MMA è stato utilizzato con successo per evitare la distruzione immunitaria dei globuli rossi legati agli anticorpi, nonostante la trasfusione di sangue sierologicamente incompatibile5. La tipica procedura pre-trasfusionale per i test di compatibilità, chiamata anche crossmatching, prevede metodi sierologici che includono la tipizzazione del sangue del paziente per gli antigeni ABO e Rh e lo screening per la presenza di anticorpi anti-RBC nel paziente6. Viene selezionato il sangue compatibile per ABO/Rh e, se sono presenti anticorpi, si tenta di identificarli in modo che il sangue per la trasfusione possa essere ulteriormente selezionato per evitare questi antigeni. Un risultato di crossmatch ideale si verifica quando tutto il sangue del donatore è sierologicamente compatibile con il sangue del paziente, il che riduce il rischio di emolisi post-trasfusionale7. Tuttavia, questo sistema non è all'altezza del piccolo gruppo di pazienti che sono diventati alloimmunizzati dopo ripetute trasfusioni o gravidanza. Questi pazienti producono alloanticorpi contro specifici antigeni dei globuli rossi. Alcuni producono anticorpi contro antigeni di frequenza molto elevata nella popolazione generale, e quindi diventano progressivamente più difficili da incrociare8,9. In aggiunta alla complessità, non tutti gli alloanticorpi sono clinicamente significativi; in altre parole, il legame di un alloanticorpo ai globuli rossi rilevati da un test sierologico non provoca necessariamente emolisi quando viene trasfuso sangue incompatibile e antigene-positivo. L'MMA è stato originariamente sviluppato per valutare il potenziale significato clinico del sangue sierologicamente incompatibile in un contesto trasfusionale1-5.
Poiché è noto che l'emolisi extravascolare dei globuli rossi legati agli anticorpi è mediata dal sistema dei fagociti mononucleati, i monociti/macrofagi primari vengono utilizzati nello sviluppo di test diagnostici. Il primo test per studiare l'interazione di monociti, globuli rossi e anticorpi è stato pubblicato nel 1975, ma le condizioni sub-ottimali utilizzate hanno portato solo alla formazione di rosetta (il legame dei globuli rossi alla periferia del monocita) e non è stata osservata fagocitosi10. Modifiche significative al test sono state apportate da diversi gruppi, portando a un test per il quale il livello di fagocitosi dei globuli rossi legati alloanticorpi potrebbe essere correlato all'esito clinico dell'emolisi1-5. Recentemente, sono state esaminate le condizioni ottimali di conservazione dei campioni clinici e l'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per migliorare l'utilità di un crossmatch clinico di MMA utilizzando campioni di pazienti autologhi11.
Tre altre tecniche diagnostiche sono state impiegate oltre all'MMA per prevedere gli esiti delle trasfusioni: il test di rilascio di 51Cr, il test della rosetta e il test della chemiluminescenza (CLT). Nel test di rilascio di 51Cr, al paziente vengono iniettati 51globuli rossi di donatori marcati con Cr e l'emivita dei globuli rossi marcati viene monitorata ed è predittiva di sopravvivenza o eliminazione post-trasfusionale12,13. Poiché questo metodo utilizza materiali radioattivi, viene più eseguito raramente. Il test della rosetta prevede la miscelazione e l'incubazione di monociti con globuli rossi e la quantificazione del livello di formazione di rosetta (senza fagocitosi)14. Il significato clinico degli anticorpi in vivo coinvolge la fagocitosi attiva da parte dei macrofagi presenti nella milza e/o nel fegato; Pertanto, questo metodo non fornisce una lettura pertinente della fagocitosi. Il CLT utilizza il luminolo per monitorare il burst ossidativo durante la fagocitosi dei monociti dei globuli rossi, poiché il luminolo diventa blu fluorescente quando ossidato nel fagosoma15. Questo metodo è buono, ma la contaminazione da neutrofili può confondere la lettura. Sono stati effettuati confronti paralleli per valutare la sensibilità, la praticità e la riproducibilità dei quattro metodi disponibili, e sia il CLT che l'MMA sono stati classificati al16° posto. Tuttavia, il CLT è stato utilizzato principalmente nella valutazione della malattia emolitica del feto e del neonato (HDFN) e il pH ottimale del test di 8,0 potrebbe compromettere il livello di fagocitosi11.
Oltre alla sua utilità diagnostica e clinica, l'MMA è stato modificato per altri scopi di ricerca. Infatti, l'MMA non solo può servire come test funzionale per affrontare le discrepanze tra sierologia e biologia, ma è stato anche utilizzato per indagare retrospettivamente la causa dell'emolisi dopo la terapia con immunoglobuline per via endovenosa (IVIG)17. È stato anche utilizzato per esaminare la struttura-funzione di inibitori chimici della fagocitosi18-20 mediata da FcγR e per studiare il segnale a valle della fagocitosi mediata da FcγR21. Nel nostro laboratorio, oltre ad utilizzare un MMA umano, stiamo sviluppando un MMA murino utilizzando cellule mononucleate primarie del sangue periferico di topo (PBMC) e globuli rossi autologhi. Il razionale è quello di esaminare gli anticorpi in grado di indurre la fagocitosi mediata da FcγR come intermedio per lo sviluppo di un modello murino di anemia emolitica autoimmune (AIHA) in vivo (dati non pubblicati). Le varie modifiche si concentrano su diversi aspetti dell'interazione tra gli anticorpi IgG e FcγR che inducono la fagocitosi.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer di destrosio di citrato acido (ACD)</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Multicell&nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>Soluzione</td></tr> <tr><td>salina tamponata con fosfato</td><td>https://www.gelifesciences.com/ Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini a 8 camere</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE)</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Disponibile in commercio (es., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Policlonale anti-D da siero umano</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Può essere sostituito con un monoclonale anti-D disponibile in commercio o con immunoglobulina Rh</td></tr><tr><td>100% metanolo</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Resina</td> <td>di alcol polivinilicoSigma</td><td>P8136</td><td>Può essere sostituito con la montatura UltraPure</td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Opzionale per IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi fcy recettore-mediata

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Sebbene originariamente sviluppato per prevedere gli esiti delle trasfusioni di sangue sierologicamente incompatibile, il test monostrato dei monociti (MMA) è un test in vitro altamente versatile che può essere modificato per esaminare diversi aspetti della fagocitosi mediata da anticorpi e recettori Fcγ (FcγR) sia in ambito di ricerca che clinico. Il test utilizza monociti aderenti provenienti da cellule mononucleate del sangue periferico isolate dal sangue intero dei mammiferi. L'MMA è stato descritto per l'uso sia nelle indagini umane che in quelle murine. Questi monociti esprimono FcγR (ad esempio, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB e FcγRIIIA) che sono coinvolti nelle risposte immunitarie. L'MMA sfrutta il meccanismo delle interazioni mediate da FcγR, in particolare la fagocitosi, in cui i globuli rossi sensibilizzati agli anticorpi aderiscono e/o attivano le FcγR e vengono successivamente fagocitati dai monociti. In vivo, principalmente i macrofagi tissutali presenti nella milza e nel fegato effettuano la fagocitosi mediata da FcγR dei globuli rossi opsonizzati da anticorpi, causando emolisi extravascolare. Valutando il livello di fagocitosi utilizzando l'MMA, è possibile studiare diversi aspetti del processo mediato da FcγR in vivo. Alcune applicazioni dell'MMA includono la previsione della rilevanza clinica di allo- o autoanticorpi in un contesto trasfusionale, la valutazione di farmaci candidati che promuovono o inibiscono la fagocitosi e la combinazione del test con la microscopia a fluorescenza o l'immunoblotting occidentale tradizionale per studiare gli effetti di segnalazione a valle di farmaci o anticorpi che coinvolgono FcγR. Alcune limitazioni includono la laboriosità di questa tecnica, che richiede un'intera giornata dall'inizio alla fine, e la necessità dell'approvazione dell'etica della ricerca per lavorare con il sangue dei mammiferi. Tuttavia, con diligenza e un allenamento adeguato, i risultati delle MMA possono essere ottenuti entro un tempo di turnover di 24 ore.

Seguendo i passaggi cruciali nella figura 1 e la procedura sopra descritta, l&#39;MMA può essere riproducibile eseguita. IVIG è stato utilizzato come un esempio per l&#39;inibizione della fagocitosi in figura 2. IVIG è noto per legare e bloccare i recettori Fc, inibendo quindi il risultato a valle della fagocitosi. Titolando la quantità di IVIG utilizzato, una inibizione dose-dipendente è osservato, nel quale la concentrazione di sopra di 200 mg / mL portato vicino al 100% di inibizione e concentrazioni inferiori a 0,5 mg / mL non ha inibito affatto (Figura 2A). Quando gli indici fagocitarie vengono trasformati e normalizzati per il controllo positivo R 2 R 2 come 0% di inibizione, una curva di inibizione con una IC50 di 3 mg / ml può essere determinato (Figura 2B). Oltre a eseguire il dosaggio costante, quantificazione del saggio a volte può essere difficile. La figura 3 è una raccolta di contrasto di fase immagini al microscopio di varie diapositive MMA. Con l&#39;esperienza microscopia, si può distinguere un monociti da un RBC contaminante (Figura 3D), o un vacuolo da un RBC fagocitato (Figura 3B). Densi ammassi di cellule e / o detriti dovrebbero essere evitati durante la quantificazione (Figure 3E e F). Inoltre, si dovrebbe evitare un&#39;eccessiva opsonizzare R 2 R 2 RBC, che porterebbe alla fagocitosi rafforzata che overcrowds l&#39;interno monociti e interferisce con accurata quantificazione (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della MMA. Una rappresentazione step-by-step dei passaggi cruciali nella MMA: isolamento PBMC da sangue intero, che alimenta il monocyt aderitoes con opsonizzati R 2 R 2, e lavando le diapositive da camera. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. endovenoso IgG (IVIG) inibisce la fagocitosi in vitro usando l&#39;MMA. IVIG è noto per inibire la fagocitosi e viene usato come controllo di inibizione nella MMA umana. (A) Titolazione di IVIG determinato una inibizione dose-dipendente di fagocitosi rispetto al greggia R comando R 2 2. I risultati mostrano la media ± errore standard della media (SEM) di n = 3 esperimenti. L&#39;analisi statistica è stata condotta utilizzando Student t-test: ** P≤0.01 e *** p≤0.001. (B) della curva di inibizione IVIG con un IC 50 of 3 mg / mL (linea tratteggiata). I risultati mostrano dati normalizzati per non trattati R 2 R 2 (0% di inibizione); media ± SEM di n = 3 esperimenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. contrasto di fase immagini al microscopio di diapositive campione sotto 40X di ingrandimento. (A) La slitta perfetto in cui i monociti fagocitati 1-2 R 2 R 2 su (frecce nere con un bagliore alone distintivo) media, con pochissimi contaminante, non-fagocitato R 2 R 2 in background (frecce bianche). Vacuoli (B) Come mostrato in questa diapositiva, monociti a volte sono allargata (frecce bianche), che possono essere scambiati per fagocitato R 2 R 2. (C &lt;/ strong&gt;) Quando R 2 R 2 sono stati over-opsonizzati, più di 4-5 fagocitati R 2 R 2 per monociti (frecce nere) renda conteggio preciso difficile, poiché la R 2 R 2 sono affollate ai monociti e cellule distinta i confini non possono essere distinte. (D) di lavaggio inadeguata della slitta porta ad abbondanti R 2 R 2 contaminazione (frecce bianche), che potrebbe essere scambiato per globuli rossi aderito. (E) A volte, monociti e globuli rossi contaminanti possono formare gruppi. I cluster indicano anche la contaminazione batterica, che dovrebbe essere evitato. (F) I monociti può formare aggregati più grandi, che dovrebbero essere evitati durante la quantificazione. Utilizzando selezione casuale dei campi per vedere, pannello A è quello che di solito si osserva se il MMA è stata eseguita correttamente. barra della scala è di 20 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Per favore clicca qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il test monostrato dei monociti (MMA) è un test in vitro che utilizza monociti primari isolati ottenuti da sangue intero periferico di mammifero per valutare la fagocitosi mediata dal recettore Fcγ (FcγR).

L&#39;uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

L'obiettivo generale di questo test funzionale in vitro è valutare vari aspetti della fagocitosi mediata da FC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunoematologia e della medicina trasfusionale, come ad esempio qual è il significato clinico degli auto- e allo-anticorpi contro i globuli rossi. Questa tecnica fornisce un test biologico funzionale che può essere eseguito in vitro per prevedere l'esito della trasfusione in quei pazienti con anticorpi preformati contro i globuli rossi.A dimostrare la procedura sarà Cindy Tong, una studentessa laureata del mio laboratorio. Ora non dimenticare che lavorare con il sangue umano può essere pericoloso e che precauzioni come indossare camici e guanti protettivi dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver prelevato da uno a due campioni di sangue intero da 10 millilitri da un donatore sano in provette vacutainer contenenti destrosio acido citrato mediante puntura venosa, le provette vengono inserite in una cabina di biosicurezza di classe II e il sangue diluito in un rapporto uno a uno in terreno completo caldo.Quindi, pipettare lentamente le cellule del sangue lungo i lati di una provetta da centrifuga su un gradiente di densità a temperatura ambiente, facendo attenzione a non mescolare gli strati. Separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, scartare lo strato superiore di plasma e utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per trasferire il PBMC contenente buffy coat in una nuova provetta da 15 millilitri.Lavare le PBMC isolate tre volte in PBS, risospendendo le cellule in tre-sette millilitri di terreno dopo la terza centrifugazione. Dopo il conteggio, diluire le cellule a 1,75 volte da 10 a una sesta di cellule per millilitro di concentrazione in terreno completo e seminare 400 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di un vetrino a otto camere per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 con piena umidità. Per opsonizzare i globuli rossi R2R2, lavare prima i globuli rossi tre volte in PBS.Diluire il pellet di R2R2 dopo la terza centrifugazione in un rapporto di uno a uno con anticorpi policlonali anti-D da siero umano per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius con miscelazione intermittente. Al termine dell'opsonizzazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e poi lavarle altre tre volte in PBS come appena dimostrato. Risospendere il pellet a un volume dell'1,25% in volume in mezzo RPMI completo.Successivamente, sostituire il surnatante da ciascun pozzetto del vetrino a otto camere con 400 microlitri di cellule R2R2 opsonizzate per due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, utilizzare gli adattatori per vetrini per rimuovere le camere, tamponando l'eccesso di R2R2 con un tovagliolo di carta. A questo punto, riempire un becher da 100 millilitri con PBS e immergere lentamente ogni vetrino da 30 a 40 volte nella soluzione salina per rimuovere la maggior parte dell'R2R2 non fagocitato.Dopo l'essiccazione, fissare i vetrini in metanolo al 100% per 45 secondi e lasciare asciugare le cellule prima di montare i campioni con i vetrini. Il giorno successivo, caricare ogni vetrino su un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 40X e contare manualmente almeno 200 monociti e il numero di R2R2 fagocitati all'interno di ciascun monocita utilizzando un contatore in ciascuna mano per quantificare simultaneamente il numero di monociti e il numero di cellule R2R2 fagocitate per campione. L'immunoglobulina per via endovenosa si lega e blocca i recettori FC che inibiscono la fagocitosi in modo dose-dipendente con un'inibizione quasi del 100% osservata a partire da concentrazioni di 200 microgrammi di immunoglobulina per via endovenosa per millilitro e con quasi nessuna inibizione osservata a concentrazioni inferiori a 0,5 microgrammi dell'inibitore.Quando gli indici fagocitici sono normalizzati al controllo positivo R2R2 come 0% di inibizione, è possibile determinare una curva di inibizione con un IC 50 di tre microgrammi per millilitro. Con l'esperienza, la microscopia a contrasto di fase può essere utilizzata per distinguere i monociti dai globuli rossi contaminanti e i vacuoli dai globuli rossi fagocitati. Durante la quantificazione devono essere evitati ammassi di cellule dense e detriti così come l'eccessiva opsonizzazione dei globuli rossi R2R2 che può portare a un'accentuazione della fagocitosi che sovraffolla l'interno dei monociti e interferisce con un'accurata analisi fagocitica.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunocitochimica o l'immunofluorescenza utilizzando la microscopia confocale per rispondere a ulteriori domande sull'espressione proteica fagocitica, le interazioni dei globuli rossi e la compartimentazione. Con il suo sviluppo iniziale e l'ulteriore ottimizzazione, questa tecnica informerà il modo in cui i ricercatori nei campi della medicina trasfusionale e della biologia cellulare esplorano i sistemi di opsonizzazione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test monostrato di monociti per valutare i tipi di interazione anticorpale che provocano la fagocitosi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Vi presentiamo un elevato throughput saggio citometria a flusso per determinare l'attività fagocitaria dei antigene-anticorpi specifici da campioni clinici, utilizzando l'antigene fluorescenti rivestite perline e una linea cellulare monocitica esprimono più recettori Fc, fornendo utilizzo del recettore e determinazioni attività fagocitaria in una forma standardizzata e moda riproducibile per qualsiasi antigene di interesse.

Determinazione dell&#39;attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

Fonte: Nagre, N., et al. Macrofagi alveolare, fagocitosi e eliminazione dei batteri nei topi. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra la valutazione della fagocitosi mediata dai recettori del complemento utilizzando globuli rossi di pecora opsonizzati con IgM e complemento, seguita dalla loro acquisizione da parte dei macrofagi del topo. L'entità della fagocitosi viene quantificata midendo un prodotto cromogenico blu formato tramite ossidazione catalizzata dall'emoglobina del diaminofluorene.

Modellazione della fagocitosi mediata dal complemento utilizzando globuli rossi opsonizzati in vitro

Questo video mostra un test di fagocitosi basato sulla citometria a flusso che coinvolge eritrociti infettati da Plasmodium falciparum marcati e opsonizzati da monociti. La citometria a flusso identifica la fluorescenza nei monociti, confermando il successo dell'identificazione degli eritrociti opsonizzati attraverso la fagocitosi.

Un test per quantificare la fagocitosi mediata da anticorpi di eritrociti infetti da parassiti

Questo video mostra un test monostrato di monociti che utilizza monociti primari provenienti da sangue periferico per valutare la fagocitosi mediata dal recettore Fcγ con globuli rossi R2R2 opsonizzati con anticorpi poli D.

Un test per lo studio della fagocitosi guidata dal recettore Fcγ nei monostrati di monociti

Questo video mostra un test in vitro per esplorare l'influenza immunomodulatoria delle cellule staminali mesenchimali (MSC) sulla proliferazione delle cellule T effettrici. Il test include la co-coltura di MSC con PBMC per indurre la popolazione di monociti ad acquisire un fenotipo immunomodulatore, portando alla secrezione di interleuchina-10 (IL-10). Dopo l'incubazione con cellule T CD4+ attivate, i monociti indotti sopprimono efficacemente la proliferazione delle cellule T.

Un test in vitro per valutare l'impatto immunomodulatorio dei monociti sulla proliferazione leucocitaria

Questo video mostra un test per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP) da parte dei fagociti del latte materno. Microsfere marcate in fluorescenza, coniugate a un complesso antigene-anticorpo, sono combinate con una sospensione cellulare isolata dal latte materno per indurre la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei leucociti fagociti. Dopo aver marcato le cellule con anticorpi contro l'antigene leucocitario comune (CD45), la citometria a flusso viene...

Un test in vitro per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei fagociti

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per misurare la fagocitosi di monociti e granulociti e l'attività di scoppio ossidativo in campioni di sangue umano.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Abbiamo sviluppato miglioramenti e metodi aggiornati per l'attuale test monocita-monostrato (MMA), in cui i macrofagi vengono utilizzati per aiutare a prevedere meglio la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale e nell'immunologia. Questo test è chiamato test dei monociti-macrofagi (M-MA).

Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Impara l'assaggio a monostrato di monociti per valutare la fagocitosi mediata da recettori Fcγ usando monociti primari isolati da sangue umano. Questo metodo funzionale predice gli esiti trasfusionali in pazienti con anticorpi preformati.

L'uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

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