In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

Le nanoparticelle sono sempre più utilizzate nell'industria e nella medicina grazie alle loro proprietà fisico-chimiche uniche. Tuttavia, persistono preoccupazioni per la salute umana associate all'esposizione prolungata alle nanoparticelle. Questi rischi possono essere quantificati studiando il comportamento delle nanoparticelle all'interno delle cellule e le risposte metaboliche indotte delle cellule alle nanoparticelle.

Ciò è in parte dovuto alla mancanza di metodi che consentano la rilevazione e la quantificazione di nanoparticelle internalizzate in una cella sincle. Sebbene numerosi strumenti analitici, tra cui la microscopia e la spettrometria di massa, possano essere utilizzati per stimare l'assorbimento cellulare delle nanoparticelle, questi forniscono solo informazioni qualitative a livello microscopico. Al contrario, i metodi in situ basati sulla spettroscopia atomica possono ridurre la quantità di artefatti di imaging che derivano dalla preparazione del campione e possono produrre l'osservazione diretta delle nanoparticelle.

Per trarre vantaggio da ciò, presentiamo un approccio correlativo che ci consente di studiare le nanoparticelle sia allo stato nativo che in laboratorio con un tag fluorescente. Qui descriviamo un metodo basato sulla combinazione di microscopia a fluorescenza e analisi con microsonda nucleare. Questo fornisce immagini della densità cellulare, della distribuzione speciale degli elementi chimici e della quantità di nanoparticelle per cellula.

A titolo dimostrativo, effettueremo ricerche su cellule esposte a nanoparticelle di biossido di titanio per 24 ore utilizzando sia la microscopia a fluorescenza che l'analisi con microsonda nucleare. Per questo protocollo, è necessario un portacampioni personalizzato realizzato con il polimero PEEK. Deve essere adatto per la coltura cellulare e le osservazioni in vitro.

Coprire il supporto con una pellicola di policarbonato spessa due micron. La lamina di policarbonato è incollata al piatto in PEEK con un sottile strato di soluzione Formvar. Una volta montato, il portacampioni deve essere sterilizzato.

È possibile conservare più portacampioni sterili, uno per pozzetto, in una piastra sterile a dodici pozzetti fino a quando non sono necessari per l'uso. Le cellule trasfettate con plasmidi GFP della fila di matrice vengono controllate mediante microscopia a fluorescenza per assicurarsi che la trasfezione sia avvenuta con successo e che esprimano la proteina fluorescente. Raccogli le cellule con la tripsina e incubale per tre minuti a 37 gradi Celsius.

Arrestare l'azione della tripsina aggiungendo un terreno di coltura fresco. Pellettare le celle mediante centrifugazione per cinque minuti a 1200 giri al minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere un volume adeguato di terreno di coltura fresco.

Contare le cellule ed eseguire una diluizione con terreno di coltura completo fresco e termostatato per ottenere una sospensione cellulare di 500 cellule per microlitro. Piastra una goccia da 40 microlitri al centro della lamina di policarbonato. Posizionare con cura il campione nell'incubatore cellulare per due ore.

Aggiungere delicatamente due millilitri di terreno di coltura fresco e lasciarli agire per 24 ore. Le nanoparticelle fluorescenti di ossido di titanio dimodificato sono state progettate, sintetizzate e innestate con fluorofori di uso comune per rilevare, tracciare e localizzare le nanoparticelle in vitro. Per questa fase, dovrebbe essere già stata preparata una sospensione di nanoparticelle di biossido di titanio in acqua ultrapura con una concentrazione di un milligrammo per millilitro.

Disperdere le nanoparticelle utilizzando impulsi di sonicazione intensi di un minuto a temperatura ambiente. Diluire le nanoparticelle in un terreno di coltura appropriato per ottenere una sospensione di esposizione di quattro microgrammi per centimetro quadrato. Passare dal precedente terreno di coltura cellulare a questo nuovo terreno contenente nanoparticelle e mescolarlo delicatamente per ottenere una distribuzione omogenea delle nanoparticelle.

Preparare una serie di celle di controllo allo stesso modo senza l'aggiunta di nanoparticelle di biossido di titanio. Incubare le popolazioni cellulari per 24 ore. Utilizzando la paraformaldeide, questi campioni possono essere fissati ed elaborati per l'imaging in situ e a singola cellula utilizzando la microscopia a fluorescenza.

La fissazione fisica criogenica, tuttavia, preserva l'ultrastruttura cellulare e l'integrità biochimica. La fissazione per congelamento a tuffo arresta rapidamente l'attività cellulare in pochi millisecondi ed evita l'uso di composti fissativi. Per fissare criogenicamente le cellule, eseguiamo le seguenti operazioni.

Preparare una piastra di trasferimento in alluminio raffreddandola in azoto liquido. Conservare la piastra in una scatola piena di azoto liquido, mantenendo la superficie della piastra sopra il liquido nel vapore di azoto freddo. Raffreddare una quantità sufficiente di 2-metilbutano a 150 gradi Celsius.

Preparare un Falcon da 50 millilitri con terreno di coltura e due Falchi con acqua ultrapura. Assicurarsi che la carta assorbente sia nelle vicinanze per asciugare il campione prima di congelarlo. Sciacquare le cellule una volta nel terreno di coltura e poi altre due volte in acqua sterile e ultrapura per rimuovere i sali in eccesso rimasti nel terreno di coltura.

Asciugare rapidamente il campione sulla carta assorbente. Congelare a immersione le celle nel 2-metilbutano raffreddato per 30 secondi e posizionarle sulla piastra di trasferimento in alluminio raffreddata. È fondamentale che la scatola sia tenuta chiusa il più possibile per evitare che il vapore acqueo si condensi sulla superficie della piastra fredda.

Dopo aver congelato tutti i campioni, la liofilizzazione viene eseguita con il seguente metodo per sublimare l'acqua. Innanzitutto, eseguire un'essiccazione primaria per 12-24 ore a bassa pressione e bassa temperatura. Successivamente, mantenendo bassa la pressione, eseguire una fase di essiccazione secondaria per almeno 24 ore con la temperatura della piastra aumentata a 40 gradi Celsius.

Dopo la criofissazione, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente per diversi giorni in condizioni sterili e asciutte, al riparo da polvere e umidità. L'analisi della microsonda nucleare è stata condotta presso l'impianto Ifera di Bordeaux, in Francia. Un acceleratore di particelle singletron da 3,5 megavolt eroga un fascio di ioni leggeri nell'intervallo di energia dei megaelettronvolt.

L'imaging degli elementi chimici è stato effettuato sulla linea di luce della microsonda utilizzando tecniche analitiche complementari a fascio ionico. Le tecniche utilizzate attraverso un micro-PIXE, emissione di raggi X indotta da particelle, STIM, microscopia ionica a trasmissione a scansione e micro-RBS, spettrometria di retrodiffusione di Rutherford. I campioni vengono posizionati all'interno della camera di analisi e irradiati sotto vuoto con diverse particelle per eseguire diverse analisi a fascio ionico.

STIM viene utilizzato per registrare mappe di densità aerea delle celle in base alle particelle di energia libere che passano attraverso regioni di celle con densità diverse. Le analisi micro-PIXE e micro-RBS forniscono la distribuzione spaziale e la quantificazione di elementi chimici a livello di singola cellula. Un microfascio di protoni da 1,5 megaelettronvolt viene focalizzato fino a un diametro di circa 1 micrometro e viene scansionato attraverso le celle di interesse, identificate da STIM.

I raggi X emessi dagli atomi presenti nel campione, che vanno dal sodio al titanio, consentono di determinare le concentrazioni elementari. I protoni retrodiffusi vengono raccolti per misurare il numero totale di particelle in arrivo necessarie per normalizzare l'intensità dei raggi X. È fondamentale disporre di standard di calibrazione certificati per la quantificazione delle concentrazioni elementari al fine di calibrare la risposta del rivelatore di raggi X.

Al fine di analizzare i dati del fascio ionico, abbiamo sviluppato un nuovo plugin per ImageJ. In primo luogo, sono state calcolate le mappe di densità STIM. Il contrasto nelle immagini di microscopia a ferro a scansione e trasmissione è dovuto a differenze locali di densità e consente il rilevamento di strutture cellulari come il nucleo e il citoplasma.

È possibile elaborare più mappe contemporaneamente. Ogni mappa corrisponde al mezzo di energia trasmessa dalle particelle in arrivo. La seconda fase dell'analisi dei dati consiste nel calcolo degli spettri delle singole cellule.

L'analisi delle emissioni di raggi X indotte da particelle produce sia la composizione chimica del campione che le mappe elementari degli elementi chimici. Le mappe degli elementi chimici vengono calcolate dopo aver ordinato i fotoni in base alla posizione del fascio al momento della registrazione e aver selezionato una finestra di energia centrata attorno a un elemento specifico. Le mappe di solito rappresentano il numero di eventi rilevati nella posizione del fascio e contengono dati quantitativi.

Viene calcolata una pila di mappe chimiche, una per ogni elemento selezionato. Le regioni di interesse per ogni cella sono state trovate utilizzando i dati PIXE per il fosforo. Gli spettri corrispondenti a ciascuna cella intera vengono quindi calcolati sommando i singoli spettri nella regione di interesse di ciascuna cella.

Da qui, i dati quantitativi sulle abbondanze chimiche in ciascuna cellula possono essere estratti utilizzando software di analisi PIXE e IBS dedicati. Qui mostriamo le immagini a fluorescenza delle cellule dopo la fissazione con paraformaldeide. La riga superiore mostra le cellule che non sono state esposte a nanoparticelle di biossido di titanio, mentre la riga inferiore lo è stata.

Il canale blu mostra il nucleo cellulare, il canale verde mostra i mitocondri e il canale rosso mostra il titanio. Si può vedere chiaramente che non è presente biossido di titanio nei controlli. Dal canale unito a destra, si può vedere che le nanoparticelle si trovano esclusivamente nel citoplasma e sono escluse dai mitocondri.

Ciò che manca a questo metodo, tuttavia, sono le informazioni quantitative sulla concentrazione di nanoparticelle. L'analisi delle microsonde nucleari può sperare di fornire questo. Queste immagini sono state tutte scattate utilizzando varie tecniche di analisi con microsonda.

Anche in questo caso, la riga superiore mostra le celle di controllo e la riga inferiore mostra le celle contenenti nanoparticelle di titanio. L'immagine più a sinistra mostra le misurazioni STIM della densità delle celle fissate criogenicamente. I tre pannelli seguenti mostrano l'abbondanza di potassio, fosforo e titanio presenti nelle celle ottenute da PIXE.

Ancora una volta, nessun titanio è visibile nei controlli né nei nuclei cellulari. Al fine di quantificare, cellula per cellula, l'assorbimento di titanio, definiamo le regioni di interesse in base ai confini cellulari mostrati nel pannello più a destra e misuriamo le abbondanze elementari in queste regioni. Da queste misure PIXE, abbiamo tracciato la distribuzione delle abbondanze elementari a livello di singola cellula per le popolazioni di controllo ed esposte.

La popolazione di controllo viene tracciata in bianco e la popolazione esposta viene tracciata in giallo. Il contenuto mediano di titanio qui presente è piuttosto basso rispetto alla dose di esposizione di quattro microgrammi per centimetro quadrato. L'intervallo di assorbimento del titanio mostra un'ampia variazione nella popolazione, da 0,2 microgrammi per centimetro quadrato fino a 1,8 microgrammi per centimetro quadrato.

Abbiamo anche notato un aumento di ioni intracellulari liberi come potassio e calcio in campioni esposti a nanoparticelle, suggerendo un'alterazione dell'omeostasi cellulare indotta dalla presenza di nanoparticelle di biossido di titanio. L'analisi con microsonda nucleare può fornire informazioni utili a livello subcellulare e fornisce una quantificazione degli elementi chimici che compongono un campione biologico. Queste tecniche presentano molti vantaggi.

Uno, nella preparazione del campione che non richiede fissazione chimica. Due, la possibilità di studiare aree più ampie con la possibilità di concentrarsi su ulteriori regioni di interesse. Tre, la quantificazione di elementi chimici con una sensibilità di pochi microgrammi per grammo.

E quattro, l'identificazione di compartimenti cellulari come il nucleo, il nucleolo e il citoplasma. La determinazione accurata di questi, quando si studia l'internalizzazione delle nanoparticelle in singole cellule, è essenziale per la tossicologia quantitativa delle nanoparticelle. Come mostrato nei casi qui studiati, la capacità di osservare e quantificare le nanoparticelle all'interno delle singole cellule ci permette di comprendere meglio l'accumulo di valore di elementi chimici endogeni ed esogeni, come le nanoparticelle di ossidi metallici.

Questo protocollo evidenzia l'idoneità dell'analisi con microsonda nucleare per studi futuri sull'interazione delle nanoparticelle con le cellule viventi. L'approccio quantitativo fornisce informazioni sull'impatto di queste nanoparticelle in termini di rilevamento, identificazione, localizzazione e quantificazione, e a livello di singola cellula sia per le nanoparticelle native che per quelle chimicamente modificate.