Metalli di imaging in tessuto cerebrale di Laser Ablation - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (LA-ICP-MS)

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare la distribuzione spaziale dei metalli in sezioni di tessuto mediante spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente e ablazione laser. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali sia nella biologia di base che nella ricerca sulle malattie, in particolare per condizioni in cui la biochimica dei metalli è coinvolta nella patologia della malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che conserva l'informazione spaziale sui metalli, che tradizionalmente viene persa utilizzando tecniche analitiche tradizionali sui metalli.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi delle malattie neurodegenerative, poiché ci permettono di monitorare come i metalli cambiano nelle regioni cerebrali che mostrano morte cellulare. In generale, le persone nuove a questo metodo possono incontrare difficoltà nell'impostare esperimenti così lunghi e complessi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché progettare l'esperimento e analizzare i dati può risultare impegnativo, dato che ogni passaggio deve essere eseguito in un ordine specifico.

Posizionare innanzitutto un campione di tessuto cerebrale e tutti gli standard di tessuto con matrice corrispondente nella camera di ablazione laser. Assicurarsi che i campioni siano entro il campo di profondità della telecamera LACCD. Chiudere la porta della camera e serrare con le dita le viti.

Quindi, nel software ICPMS, aprire la valvola del gas di trasporto e impostare la portata a 1,2 litri al minuto. Nel software LA, eseguire un purging di 30 minuti della cella di ablazione con il gas di trasporto. Per una cella di ablazione a due volumi, ogni dieci minuti spostare il portacampioni in ciascun angolo della camera per ridurre la quantità di aria residua nella cella.

Accendere lo spettrometro ICPMS e lasciare che lo strumento si riscaldi per due ore. Mentre lo strumento si sta riscaldando, nel software di ablazione laser tracciare una linea di ablazione di circa tre millimetri di lunghezza attraverso la superficie del primo standard tessutale. Fare clic sulla linea di ablazione e impostare il diametro del fascio predefinito, la velocità di scansione e la fluenza radiante.

Duplicare la linea sei volte, distanziando le linee di un diametro del fascio. Ripetere questo procedimento per ogni standard. Successivamente, utilizzare lo strumento linea per tracciare l'area di ablazione sul campione, partendo dall'angolo in alto a sinistra e attraversando il punto più largo del campione, usando gli stessi parametri adottati per gli standard.

Duplicare la linea secondo necessità per garantire una copertura completa del campione, mantenendo la stessa distanza utilizzata per gli standard. Successivamente, tracciare un insieme di linee per la scansione intermittente degli standard non oltre 20 ore dopo l'inizio della scansione del campione, o tra un campione e l'altro. Aggiungere una scansione degli standard alla fine dell'esperimento.

In base alla lunghezza della linea e alla velocità di scansione, determinare il tempo di analisi per le linee del campione e dello standard. Quindi, creare un nuovo batch nel software ICPMS e selezionare l'analisi risolta nel tempo. Scegliere i valori del rapporto massa/carica di interesse e impostare i tempi di integrazione per ciascun rapporto, in modo che il tempo totale di integrazione per un ciclo sia di 0,25 secondi.

Salvare il batch. Per un batch standard, compilare il tempo di analisi per ogni linea aggiungendo un margine di 15 secondi per tener conto del tempo di riscaldamento e di lavaggio del laser. Impostare un elenco di esecuzione del campione con un'acquisizione per ogni linea standard.

Per il lotto di campione, duplicare il lotto standard e regolare adeguatamente i tempi e il numero di acquisizioni in base al modello di ablazione del campione. Una volta che lo spettrometro di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICPMS) ha completato il riscaldamento, aggiungere il primo lotto alla coda e assicurarsi che il software sia in attesa di un segnale di attivazione proveniente dallo strumento di ablazione laser (LA). Successivamente, nel software LA, accendere l'alimentazione del laser e impostare i tempi di riscaldamento del laser e di lavaggio.

Avviare la sequenza del laser e verificare che lo spettrometro di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICPMS) inizi correttamente l'acquisizione dei dati dopo l'ablazione. Una volta raccolti i dati, estrarre i dati relativi agli standard dai file CSV. Eseguire le correzioni dei livelli di fondo e escludere il segnale di fondo.

Individuare cali del segnale causati da fori nei campioni di tessuto. Mascherare queste aree con segnale basso, quindi esportare i dati in un foglio elettronico. Calcolare un fattore di conversione da CPS a PPM per ogni elemento identificato.

Ripetere questo processo per ogni standard. Successivamente, aprire il software di costruzione delle immagini quantitative e importare i dati del campione dai file CSV. Selezionare diverse aree dello sfondo per applicare la correzione dello sfondo.

Selezionare lo strumento di modifica del grafico, fare clic con il tasto destro sull'immagine e selezionare modifica dell'aspetto dell'immagine. Modificare il primo colore in Z assegnandogli un valore negativo elevato e fare clic su fine per potenziare il segnale di fondo. Quindi, nella scheda standard, inserire i fattori di correzione CPS PPM per ogni standard e fare clic su vai.

Aprire il browser dei dati nella scheda dati, fare clic con il tasto destro su un file di immagine corretto e selezionare nuova immagine. Aprire la finestra di modifica dell'aspetto dell'immagine e impostare la tavolozza dei colori e la scala. Utilizzare l'utilità di aggiunta annotazioni per posizionare una scala cromatica sull'immagine.

Regolare la scala di colori nella finestra della scala cromatica. Una volta che l'immagine è stata colorata e annotata, copiare e incollare l'immagine in un altro programma oppure esportare l'immagine dal software di elaborazione delle immagini. Per attivare gli strumenti ROI, selezionare l'elaborazione delle immagini dai pacchetti di analisi e scegliere un'immagine.

Nella scheda immagine, fare clic su ROI e iniziare a disegnare l'ROI. Selezionare la regione di interesse, quindi fare clic su completa ROI. Nella scheda immagine, fare clic su statistiche per ottenere i dati dell'ROI.

Copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo, assicurandosi di salvare ogni volta che viene aggiunta una ROI. Ripetere il processo secondo necessità. Il contenuto e la distribuzione di metalli nel cervello di un topo di tipo selvaggio sono stati analizzati utilizzando questa tecnica.

Qui, le distribuzioni di carbonio, magnesio e fosforo sono mostrate in conteggi al secondo. Le immagini quantitative sono mostrate per manganese, rame, ferro e zinco. La distribuzione del carbonio è stata utilizzata come standard interno.

Il ferro era più abbondante nella regione mediale del cervello e nel giro dentato. Lo zinco era più abbondante nelle aree corticali. Le informazioni provenienti da queste immagini possono quindi essere utilizzate per tracciare l'espressione e la funzionalità delle proteine leganti i metalli. Una volta acquisite le competenze, un esperimento che normalmente richiede diversi giorni può essere allestito in un'ora se eseguito correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante sincronizzare le linee di ablazione e i file di dati con l'ICPMS. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti metodi aggiuntivi come la colorazione istologica su sezioni adiacenti, al fine di ottenere informazioni supplementari, ad esempio la codistribuzione dei metalli con proteine specifiche. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando volevamo esaminare come i livelli di metalli cambiassero nei modelli di laboratorio della malattia di Parkinson.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sulla neurodegenerazione, può anche essere applicato a diversi tipi di tessuto e condizioni patologiche, inclusi tessuti umani e una vasta gamma di matrici biologiche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esaminare come i livelli di metalli cambiassero sia nei campioni umani sia nei modelli animali di malattia. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea abbastanza chiara di come impostare un esperimento di ICPMS con ablazione laser.

Non dimenticare che lavorare con materiale biologico può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, durante l'esecuzione di questa procedura.