Metalli di imaging in tessuto cerebrale di Laser Ablation - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (LA-ICP-MS)

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare la distribuzione spaziale dei metalli nelle sezioni di tessuto utilizzando la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con ablazione laser. Questo metodo può rispondere a domande chiave sia della biologia di base che della ricerca sulle malattie, in particolare per le condizioni in cui la biochimica dei metalli è coinvolta nella patologia delle malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che conserva le informazioni spaziali sui metalli che tradizionalmente vengono perse utilizzando le tecniche di analisi dei metalli di palude.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi delle malattie neurodegenerative perché ci consente di monitorare come i metalli cambiano nelle regioni del cervello che mostrano la morte cellulare. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, organizzando questi esperimenti lunghi e complessi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la progettazione dell'esperimento e l'analisi dei dati possono essere impegnative perché ogni passaggio deve essere eseguito in un ordine specifico.

Innanzitutto, posizionare un campione di tessuto cerebrale e tutti gli standard di tessuto corrispondenti alla matrice nella camera di ablazione laser. Assicurarsi che i campioni rientrino nella profondità di campo della telecamera LACCD. Chiudere lo sportello della camera e serrare a mano le viti.

Quindi, nel software ICPMS, aprire la valvola del gas di trasporto e impostare la portata su 1,2 litri al minuto. Nel software LA, eseguire uno spurgo di 30 minuti della cella di ablazione con il gas di trasporto. Per una cella di ablazione a due volumi, ogni dieci minuti spostare il tavolino del campione in ciascun angolo della camera per ridurre la quantità di aria residua nella cella.

Accendere l'ICPMS e lasciare che lo strumento si riscaldi per due ore. Mentre lo strumento si sta riscaldando, nel software di ablazione laser tracciare una linea di ablazione lunga circa tre millimetri lungo la superficie del primo standard tissutale. Fare clic sulla linea di ablazione e impostare il diametro del fascio predefinito, la velocità di scansione e la fluenza radiante.

Duplicare la linea sei volte, distanziandole in base al diametro della trave. Ripetere questo processo per ogni standard. Quindi, usa lo strumento linea per disegnare l'area di ablazione sul campione dall'angolo in alto a sinistra attraverso il punto più largo del campione utilizzando gli stessi parametri degli standard.

Duplicare la linea secondo necessità per una copertura completa del campione con la stessa spaziatura utilizzata negli standard. Quindi, tracciare una serie di linee per la scansione intermittente degli standard entro e non oltre 20 ore dalla scansione del campione o tra ciascun campione. Aggiungi una scansione degli standard alla fine dell'esperimento.

In base alla lunghezza della linea e alla velocità di scansione, determinare il tempo di analisi per il campione e le linee standard. Quindi, creare un nuovo batch nel software ICPMS e selezionare l'analisi risolta nel tempo. Scegliere i valori del rapporto massa/carica di interesse e impostare i tempi di integrazione per ciascun rapporto, in modo che il tempo di integrazione totale per un ciclo sia di 0,25 secondi.

Salvare il batch. Per un lotto standard, inserire il tempo di analisi per ogni linea con un buffer aggiuntivo di 15 secondi per tenere conto dei tempi di riscaldamento e lavaggio del laser. Impostare un elenco di esecuzione di esempio con un'acquisizione per ogni linea standard.

Per il lotto di campioni, duplicare il lotto standard e regolare i tempi e il numero di acquisizioni di conseguenza per il modello di ablazione del campione. Una volta che l'ICPMS si è riscaldato, aggiungere il primo batch alla coda e assicurarsi che il software sia in attesa di un trigger dallo strumento LA. Quindi, nel software LA, accendere l'alimentazione del laser e impostare i tempi di riscaldamento e lavaggio del laser.

Avviare la sequenza laser e verificare che l'ICPMS avvii correttamente la raccolta dei dati dopo l'ablazione. Una volta raccolti i dati, estrarre i dati per gli standard dai file CSV. Eseguire le linee di base della trazione ed escludere il segnale di fondo.

Identificare le cadute di segnale causate da fori negli standard dei tessuti. Maschera queste aree a basso segnale, quindi esporta i dati come foglio di calcolo. Calcola un fattore di conversione da CPS a PPM per ogni elemento identificato.

Ripetere questo processo per ogni standard. Quindi, apri il software di costruzione quantitativa delle immagini e importa i dati di esempio dai file CSV. Seleziona diverse aree dello sfondo per applicare la correzione dello sfondo.

Seleziona lo strumento di modifica del grafico, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e seleziona Modifica aspetto immagine. Modificare il primo colore in corrispondenza di Z con un valore negativo elevato e fare clic su Fine per migliorare il segnale di sfondo. Quindi, nella scheda standard, immettere i fattori di correzione CPS PPM per ogni standard e fare clic su Vai.

Apri il browser dei dati nella scheda dei dati, fai clic con il pulsante destro del mouse su un file immagine corretto e fai clic su nuova immagine. Apri la finestra di modifica dell'aspetto dell'immagine e imposta la tabella dei colori e la scala. Utilizzare l'utilità Aggiungi annotazione per posizionare una scala di colori sull'immagine.

Regolare la scala dei colori nella finestra della scala dei colori. Una volta che l'immagine è stata colorata e annotata, copiala e incollala in un altro programma o esporta l'immagine dal software di costruzione delle immagini. Per attivare gli strumenti ROI, selezionare l'elaborazione delle immagini dai pacchetti di analisi e scegliere un'immagine.

Nella scheda immagine, fai clic su ROI e avvia il disegno ROI. Seleziona l'area di interesse, quindi fai clic su Termina ROI. Nella scheda immagine, fai clic su statistiche per ottenere i dati sul ROI.

Copia e incolla i dati in un foglio di calcolo, assicurandoti di salvarli quando viene aggiunto ogni ROI. Ripetere il processo secondo necessità. Il contenuto di metalli e la distribuzione di un cervello di topo wild type sono stati studiati utilizzando questa tecnica.

Qui, le distribuzioni di carbonio, magnesio e fosforo sono mostrate in conteggi al secondo. Immagini quantitative sono mostrate per manganese, rame, ferro e zinco. La distribuzione del carbonio è stata utilizzata come standard interno.

Il ferro era più abbondante nel cervello medio e nel giro dentato. Lo zinco era più abbondante nelle aree corticali. Le informazioni provenienti da queste immagini possono quindi essere utilizzate per tracciare l'espressione e la funzionalità delle proteine leganti i metalli. Una volta padroneggiato, un esperimento che dura diversi giorni può essere impostato entro un'ora, se eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante sincronizzare le linee di ablazione e i file di dati con ICPMS. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come la colorazione istologica su sezioni adiacenti al fine di fornire informazioni aggiuntive come la colocalizzazione di metalli con proteine specifiche. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo esaminare come cambiavano i livelli di metallo nei modelli di laboratorio nella malattia di Parkinson.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sulla neurodegenerazione, può anche essere utilizzato per diversi tipi di tessuto e stati patologici, compresi i tessuti umani e una serie di matrici biologiche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esaminare come sono cambiati i livelli di metalli sia nei campioni umani che nei modelli animali di malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza precisa di come impostare l'esperimento ICPMS di ablazione laser.

Non dimenticare che lavorare con materiale biologico può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.