Un modello per perineurale Invasion in testa e del collo carcinoma a cellule squamose

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di valutare rapidamente molteplici condizioni di trattamento che influenzano l'invasione perineurale nel carcinoma squamoso della testa e del collo con tassi di successo e riproducibilità dei saggi molto elevati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oncologia della testa e del collo, come ad esempio quali sono i fattori che influenzano l'invasione perineurale delle cellule tumorali della testa e del collo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di saggi può essere eseguito in modo rapido e riproducibile da un topo in un periodo di tempo relativamente breve.

Prima di iniziare la procedura di dissezione del ganglio radicolare dorsale, o DRG, aggiungere un terreno fresco a temperatura ambiente ad almeno 40 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Quindi, usa un paio di forbici sottili per praticare un'incisione longitudinale lungo la colonna vertebrale dalla radice della coda alla testa del topo. E dividi trasversalmente il tessuto sotto la colonna vertebrale sacrale, sezionando entrambi i lati della colonna vertebrale, fino alla base del cranio.

Trasferire il campione al microscopio e osservare l'estremità cervicale della colonna vertebrale a bassa potenza. Il midollo spinale bianco è evidente al centro di un anello osseo, che è circondato da quantità variabili di muscoli perispinali e tessuti molli. Usando microscopiche forbici a molla, dividi l'aspetto dorsale, o superiore, dei primi due o tre corpi vertebrali.

Quindi, usa l'azione a molla delle forbici per aprire questo taglio osseo iniziale, per assicurarti che la dissezione del corpo vertebrale avvenga sulla linea mediana. Continuare a piccoli incrementi verso la colonna vertebrale sacrale, dividendo in due la colonna vertebrale con tagli identici sull'aspetto ventrale, o inferiore, dei corpi vertebrali. Mettendo da parte un'emipsina, trasferisci l'altra metà della colonna vertebrale a faccia in giù su una piastra sterile con il midollo spinale in posizione.

E usa due aghi calibro 18 per fissare entrambe le estremità dell'emispina sulla piattaforma di dissezione in polistirolo. Successivamente, partendo dall'estremità cervicale più stretta, staccare delicatamente il midollo spinale da circa quattro livelli vertebrali. Nella regione in cui i nervi sensoriali si inseriscono nel DRG, afferrare delicatamente la fascia circostante con una pinza microscopica e utilizzare microscopiche forbici a molla per tagliare questa fascia e altro tessuto nervoso per liberare il DRG.

Con un ingrandimento maggiore, usa le forbici a molla per tagliare il nervo periferico il più vicino possibile al DRG per rilasciare il tessuto e tagliare i rami prossimali. Quindi, tagliare il DRG da eventuali fibre nervose vaganti o attacchi fasciali e posizionare il tessuto isolato in un pozzetto della piastra con fondo a V a 96 pozzetti. Per preparare le goccioline di matrice semisolida, trasferire una piastra di vetro con fondo a pozzetto dal ghiaccio su un blocco di ghiaccio sotto il microscopio operatorio.

Posizionare la punta di una pipetta da non più di 10 microlitri direttamente sul bicchiere con un angolo di 45 gradi ed erogare con cautela una goccia di matrice da 1,5 microlitri sul bicchiere. Allontanare lentamente il puntale della pipetta dal vetro man mano che la matrice si innesta nella piastra. Depositare una goccia di matrice su ciascuno dei quattro angoli della piastra e trasferire la piastra su una superficie a temperatura ambiente per circa un minuto.

Quando la matrice si è leggermente irrigidita, rimettere la placca nel blocco di ghiaccio e utilizzare una pinza microscopica chiusa per raccogliere delicatamente il DRG con la mano sinistra. Usando la mano destra, trasferire con cura il tessuto nervoso sulla punta di un ago calibro 21 e utilizzare l'ago per inserire delicatamente il DRG al centro della gocciolina della matrice. Il DRG dovrebbe essere rilasciato facilmente nella matrice per il posizionamento centrale con l'ago.

Dopo aver inserito un pezzo DRG in ciascuna delle quattro goccioline, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quando tutti i DRG sono stati incorporati, tenere le piastre una alla volta, con una leggera angolazione e aggiungere lentamente quattro millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS alle piastre, in modo che il mezzo entri in contatto solo gradualmente con le unità DRG della matrice. Rimetti le piastre nell'incubatrice per altre 48-72 ore.

Quando i neuriti raggiungono almeno il 75% del percorso verso il bordo della matrice, aspirare il mezzo dai pozzetti senza rimuovere le unità DRG della matrice. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, con un grilletto regolare, posizionare due gocce da tre volte 10 a una quinta cellula per millilitro di terreno su ciascun test DRG della matrice. E rimetti le piastre nell'incubatrice.

Dopo un'ora, aggiungere delicatamente quattro millilitri di DMEM con il 10% di FBS lungo la parete laterale della piastra con fondo in vetro e rimettere le piastre nell'incubatore fino alla successiva valutazione microscopica. Dopo la loro dissezione e il posizionamento all'interno delle goccioline della matrice, l'aspetto del saggio dovrebbe assomigliare al DRG incorporato nella matrice mostrato qui. Si noti che il DRG non è perfettamente rotondo, ma è centrato all'interno della gocciolina della matrice, consentendo la crescita dei neuriti a 360 gradi.

Immediatamente dopo la placcatura, le cellule tumorali squamose della testa e del collo formano un anello circonferenziale attorno alla matrice, espandendosi lungo i neuriti nei successivi due o tre giorni. Le cellule placcate su goccioline di controllo bianche contenenti solo la matrice si dividono attivamente attorno alle matrici, ma non entrano o si estendono sopra la parte superiore. Per la quantificazione dell'invasione perineurale delle cellule tumorali, le immagini dei saggi sono divise in quattro quadranti tramite una linea verticale e una orizzontale.

Una serie di punti viene quindi valutata per ogni estensione di invasione perineurale osservata in ciascun quadrante, consentendo il confronto delle crescite delle cellule tumorali lungo i neuriti tra diverse linee cellulari tumorali. Una volta padroneggiata, la tecnica di isolamento dei gangli della radice dorsale può essere completata in meno di due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ridurre al minimo l'eccessiva manipolazione dei gangli della radice dorsale, poiché la lesione da schiacciamento è la causa più comune di fallimento del test.

A seguito di questa procedura, è possibile studiare i meccanismi dell'invasione perineurale, portando potenzialmente allo sviluppo di terapie mirate contro questo tipo di invasione dei tessuti molli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare i gangli della radice dorsale da un topo e impostare un test per esaminare l'invasione perineurale.