Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel
18 gennaio 2017
Questo protocollo mostra un metodo di preparazione del campione di piante per la microscopia a foglio di luce. La configurazione è caratterizzata dal montaggio verticale della pianta sulla superficie di un gel e dal lasciarla crescere in condizioni di luminosità controllata. Ciò consente l'osservazione a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali in condizioni standardizzate.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di acquisire osservazioni a lungo termine di un apparato radicale vegetale utilizzando la microscopia a foglio ottico. Per raggiungere questo obiettivo, è essenziale disporre di un metodo di preparazione del campione delicato, condizioni di crescita controllate e una tecnica di imaging che non alteri lo sviluppo delle piante, come la microscopia a foglio ottico. Per cominciare, le piante vengono coltivate sulla superficie di uno strato sottile di gel di due millimetri.
Il gel con una piantina di Aribidopsis viene quindi tagliato, raccolto e trasferito sul portacampioni del microscopio. All'interno del microscopio, la pianta cresce nella sua naturale posizione eretta. Le radici crescono in un mezzo liquido, mentre le foglie rimangono nell'aria.
Un sistema di illuminazione illumina solo le foglie. La superficie dell'acqua è coperta in modo da mantenere le radici al buio. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione della radice all'interno del gel, è che siamo abituati a coltivare piante sulla superficie di un gel.
Pertanto, possiamo attenerci allo stesso protocollo di coltivazione di prima. E in secondo luogo, la radice è a diretto contatto con il mezzo liquido, che può essere sostituito per trattamenti farmacologici, ad esempio. Versare 30 millilitri di terreno MS semi-dosso appena autoclavato contenente l'1,5% di phytogel in una capsula di Petri quadrata per creare uno strato di circa 2 millimetri.
Semina semi sterili fianco a fianco con almeno un centimetro di spazio in mezzo. Quindi, avvolgere la piastra con un nastro adesivo a micropori. Coltiva la piastra nell'incubatore di crescita verticalmente per un massimo di 10 giorni.
In questo esperimento, utilizziamo piante di sei giorni per osservare lo sviluppo delle radici laterali. Forniamo un modello per la stampa 3D del portacampioni. Abbiamo testato diversi materiali.
Le resine trasparenti erano le più adatte in termini di rigidità e resistenza all'acqua. Una descrizione dettagliata delle dimensioni per la lavorazione di un portacampioni da materiale solido è descritta nel manoscritto. Taglia il gel intorno alla pianta usando un bisturi.
Quindi, raccogliere il blocco di gel su cui sta crescendo la pianta e trasferirlo con cura al portacampioni. Sciogliere l'1% di aggro a 80 gradi Celsius e raffreddarlo a 33 gradi Celsius. Incollare il blocco di gel sul portacampioni e incollare accuratamente la pianta sul gel.
Usa uno stereomicroscopio per verificare la posizione della pianta e assicurati che la regione di interesse non sia coperta da alcun gel. Per evitare che la pianta si secchi, far scorrere il portacampioni su un puntale per pipetta da 1.000 microlitri, quando possibile. Posizionare il supporto su una scatola per pipette e preparare altri campioni, se necessario.
Il nostro microscopio è un classico a rotazione aperta senza grandi modifiche. Abbiamo implementato un sistema di illuminazione per la coltura delle piante all'interno del microscopio. I LED rosso e blu sono disposti ad anello.
Le coppie di LED possono essere accese e spente individualmente per l'illuminazione direzionale. Lo spettro del sistema di illuminazione corrisponde a quello delle nostre camere di crescita. Quasi tutta l'illuminazione proveniente dai LED è bloccata dal filtro di emissione per GFP.
Non siamo riusciti a rilevare alcuna luce diffusa che raggiungesse la fotocamera. Pertanto, la luce può essere mantenuta accesa durante l'imaging. L'intensità della luce può essere regolata, variando da 30 a 250 micro moli per metro quadrato al secondo.
Avvitare o incollare l'anello LED sul lato inferiore del braccio del tavolino di rotazione aperto. Rimontalo sul microscopio e collega i fili. Montare il sistema a profusione.
Collegare i tubi alla camera del campione in una disposizione unidirezionale. Regolare la velocità a un millilitro al minuto. Aggiungi tre quadrati millimetrici di un foglio di plastica nera sterile e distribuiscili sulla superficie dell'acqua.
Inserire il campione nel microscopio. Verificare che non vi siano fogli di plastica attaccati al portacampioni. Chiudere la camera con due coperchi in foglio di alluminio nero.
Accendi la luce e regola l'intensità della luce. Spegni la luce della stanza e avvia la registrazione. Questo metodo consente di registrare la crescita delle radici per diverse ore fino a giorni, qui presentata dalla crescita di una radice laterale.
Le immagini di uno z-stack di un singolo punto temporale mostrano buone proprietà ottiche sezionali. Abbiamo catturato l'intero processo di formazione delle radici laterali in 3D, il che ci permette di studiare la dinamica di questo processo. L'osservazione di una singola fetta di questa registrazione mostra una buona risoluzione, anche in profondità all'interno della radice.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione del metodo di preparazione del campione di piante per la microscopia a foglio di luce. Seguendo questo protocollo, ora siamo in grado di osservare la localizzazione proteica intracellulare o i modelli di espressione genica durante l'organogenesi, i tropismi delle piante o l'adattamento delle piante. Questo ci aiuterà a comprendere la regolazione spazio-temporale dello sviluppo delle piante.
Panoramica
Questo protocollo illustra un metodo di preparazione del campione vegetale per la microscopia a foglio luminoso, che consente l'osservazione a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali. L'allestimento prevede la coltivazione di piante su una superficie gelatinosa in condizioni controllate, permettendo un'analisi dettagliata senza alterare la crescita della pianta.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Tecniche di microscopia
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La microscopia a foglio luminoso fornisce una tecnica di imaging non invasiva.
- I metodi tradizionali possono alterare lo sviluppo della pianta.
- Condizioni controllate sono fondamentali per osservazioni accurate.
- I semenziali di Arabidopsis sono comunemente utilizzati per questi studi.
Scopo dello studio
- Acquisire osservazioni a lungo termine dei sistemi radicali delle piante.
- Sviluppare un metodo delicato di preparazione del campione.
- Utilizzare tecniche di imaging che non interferiscano con la crescita della pianta.
Metodi Utilizzati
- Le piante vengono coltivate su uno strato sottile di gel.
- Il blocco di gel viene trasferito in un portacampioni per microscopio.
- Viene implementato un sistema di illuminazione per condizioni ottimali di crescita.
- L'acquisizione di immagini cattura la dinamica della crescita radicale nel tempo.
Risultati principali
- Acquisizione di immagini riuscita della formazione delle radici laterali in 3D.
- Osservate buone proprietà ottiche nelle immagini z-stack.
- Il metodo consente lo studio dei processi intracellulari.
- Facilita la comprensione della regolazione spazio-temporale nelle piante.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la capacità di osservare lo sviluppo delle piante.
- Supporta la ricerca sull'espressione genica e sulla localizzazione delle proteine.
- Fornisce un approccio standardizzato per studi futuri.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione a lungo termine dei sistemi radicali vegetali in condizioni controllate, supportando studi meccanicistici sull'organogenesi e sulla dinamica dello sviluppo. Preservando la crescita naturale pur permettendo il ricambio del mezzo liquido, facilita lo screening di composti e la validazione di bersagli nei sistemi modello basati su piante. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando fenotipi cellulari a risposte a livello di tessuto in un formato riproducibile e scalabile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'osservazione diretta della dinamica cellulare durante l'organogenesi.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico visualizzando l'interazione con il bersaglio in tessuti in via di sviluppo e integri.
- Valore predittivo: Collega le perturbazioni molecolari agli esiti fenotipici in un contesto fisiologicamente rilevante.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione di composti successivi con capacità di scambio del mezzo liquido.
- Output quantitativi: Genera dataset temporali tridimensionali che consentono misurazioni precise di cambiamenti strutturali e funzionali.
- Riutilizzo della piattaforma: Un design standardizzato del portacampioni permette la scalabilità attraverso diverse campagne sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Fornisce un sistema rilevante per lo studio dei tropismi radicali e delle risposte adattative a stimoli ambientali.
- Continuità traslazionale: Collega l'imaging nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso letture continue e non invasive.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Riduce l'ambiguità nella validazione degli obiettivi correlando i cambiamenti molecolari con lo sviluppo strutturale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione di composti promettenti, consentendo un'affinamento iterativo dei bersagli biologici sulla base di dati fenotipici dinamici.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici visualizzando in tempo reale i processi cellulari all'interno dell'architettura tissutale nativa.
- Screening: Permette una valutazione affidabile dei composti mediante montaggio standardizzato e perfusione di mezzo liquido.
- Analisi: Fornisce letture spaziali e temporali ad alta risoluzione che facilitano l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le prime intuizioni meccanicistiche ai modelli preclinici attraverso processi di sviluppo conservati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile, adattabile a diverse specie vegetali e variabili sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta l'affidabilità predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un montaggio standardizzato su gel e un'illuminazione controllata.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una visualizzazione diretta delle risposte biologiche alle perturbazioni.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio grazie a dati fenotipici quantitativi e longitudinali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia vegetale, microscopia e manipolazione di campioni microfluidici.
- È vincolato alla disponibilità di un'infrastruttura per la microscopia a foglio luminoso dotata di illuminazione LED personalizzabile e controllo ambientale.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di preparazione del gel, trasferimento del campione e protocolli di illuminazione tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse specie vegetali, mezzi di crescita e profili di solubilità dei composti.
- È limitato dalla necessità di trasparenza ottica e compatibilità tra i materiali del gel e le lunghezze d'onda utilizzate per l'acquisizione delle immagini.
