Name: Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Impara la microscopia a luce foglio per osservare a lungo termine lo sviluppo delle radici di Arabidopsis su gel. Questo metodo non invasivo consente di studiare la formazione delle radici laterali in 3D.

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Ringraziamo Matyáš Fendrych per critica la lettura / visione e Stephan Stadlbauer per le apparecchiature audio. Grazie alla Miba Officina all&#39;IST Austria per il loro contributo alla OpenSPIM. La ricerca che ha portato a questi risultati è stata finanziata dal programma del Popolo (azioni Marie Curie) del Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (7 ° PQ / 2007-2013) REA convenzione di sovvenzione n ° [291.734] e del Consiglio europeo della ricerca (CER progetto del 2011 -StG-20101109-PSDP).

1. Arabidopsis Coltura Prima di Imaging <ol><li> Preparare ½ MS medio (half-resistenza Murashige e Skoog) aggiungendo 2,15 g MS-media, 10 g di saccarosio, 0.97 g MES (2- (N -morpholino) acido etansolfonico) e 1 L DDH 2 O (acqua bidistillata ) in una bottiglia 1 L. Regolare il pH a 5,8 con KOH. </li><li> Aggiungere 15 g / L gellano al mezzo ½ MS e autoclave per 20 minuti a 121 ° C. </li><li> Versare 30 ml del mezzo caldo in piastre di Petri quadrati (245 x 245 x 25 mm) per creare uno strato di gel con uno spessore di circa 2 mm. Lasciare i piatti raffreddare a temperatura ambiente per consentire solidificare il terreno. </li><li> Mettere semi di Arabidopsis sterilizzati in un tubo di reazione contenente 1,5 mL 1 mL sterile H 2 O. Raccogliere i semi utilizzando una pipetta di vetro o una punta di pipetta 1000 microlitri e seminare sulla superficie del gel. Mettere i semi separatamente circa 10 mm. Sigillare la piastra con nastro adesivo. </li><li> Incubare la piastra per 24 ore a 4° C (stratificazione). </li><li> Coltivare la piastra in un incubatore di crescita, ad esempio a 22 ° C in un 16/8 h ciclo giorno / notte con 120-140 mmol / mq / s quantità di luce per 6 giorni. Fino a 10 giorni vecchi impianti possono essere utilizzati. </li></ol> 2. Impianto metodo di preparazione del campione Nota: Il supporto del campione può essere formato 3D stampato o fatto a mano in un laboratorio macchina utilizzando le dimensioni illustrate nella figura 2C. Il file di modello 3D è previsto nel materiale supplementare (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Vedi il link per ordinare la stampa 3D nella distinta del materiale. <ol><li> Aggiungere 5 g bassofondente agarosio in un flacone da 50 mL contenente 50 mL ½ MS medio e autoclave per 20 minuti a 121 ° C. </li><li> Aliquota della soluzione di agarosio 1% low-melt in provette da 1,5 ml di reazione. Conservare a 4 ° C (può essere utilizzato per almeno due mesi). </li><li> Sciogliere un&#39;aliquota di 1 agarosio %% low-melt a 80 ° C e lasciate raffreddare a33 ° C. </li><li> Pulire il supporto del campione in una unità di ultrasuoni. Sterilizzare il supporto del campione con il 70% di etanolo e lavare con acqua sterile. </li><li> Tagliare il gel intorno alla pianta con un bisturi. </li><li> Sollevare il blocco con una spatola piatta e farla scorrere delicatamente sul supporto del campione utilizzando un secondo spatola. </li><li> Colla il gel sul supporto campione con 1% di agarosio (a 33 ° C) usando una pipetta 100 microlitri. </li><li> Incollare la pianta sul gel con 1% di agarosio con una pipetta 10 ml. Utilizzare uno stereo microscopio per verificare che le foglie non sono coperti con gel. Non posizionare il gel direttamente sulla regione di interesse. </li><li> Per evitare che l&#39;impianto si secchi, lavorare ininterrottamente. Inserire il supporto del campione in una punta della pipetta 1000 microlitri, quando possibile. Utilizzare la punta della pipetta da tappo e farla scorrere delicatamente su una estremità del supporto del campione in cui si trova l&#39;impianto. </li><li> Mettere il supporto del campione in una scatola di punta della pipetta e preparare più piante, se necessario. Le piante possono essere tivatly ripreso o rimesso nell&#39;incubatrice crescita. </li></ol> 3. Impostare il microscopio NOTA: Il sistema di illuminazione a LED è una lampada custom-built. I dettagli tecnici necessari per costruire l&#39;anello LED possono essere trovati nella figura 3 e l&#39;elenco dei materiali. Vedere il file materiale supplementare (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) per il design. <ol><li> Vite o colla (ad esempio nastro biadesivo) l&#39;anello di LED sul lato inferiore del braccio OpenSPIM x / y / z / θ stadi. </li><li> Collegare l&#39;anello LED con un alimentatore regolabile (0-30 V, max 2 A). </li><li> Regolare la tensione per l&#39;intensità della luce desiderata (ad Arabidopsis, 120-140 mmol / m 2 / s, Figura 3D). </li><li> Sterilizzare la camera del campione con il 70% di etanolo e lavare con acqua sterile. </li><li> Pulire la lente dell&#39;obiettivo con il tessuto benzina e la pulizia delle lenti. Sterilizzare la lente dell&#39;obiettivo con il 70% di etanolo. </li><li> Collegare i perfusisu tubi alla camera del campione in una disposizione unidirezionale. Mettere una bottiglia da 1 L contenente fresco ½ medio MS e un&#39;altra bottiglia vuota accanto alla pompa peristaltica perfusione. Collegare la bottiglia con mezzo con l&#39;ingresso inferiore della camera campione utilizzando un tubo di perfusione. Collegare l&#39;uscita superiore della camera del campione con la bottiglia vuota nel cestino mezzo utilizzato con un altro tubo di perfusione. </li><li> Impostare la velocità di flusso di 1 mL / min. NOTA: Per non traboccamento camera del campione, è importante avere un deflusso superiore al flusso. Aumentare la velocità di pompaggio o utilizzare un tubo con un diametro maggiore interno di efflusso. </li><li> Tagliare un foglio di plastica nera in 3 mm piccole piazze, lavare con il 70% di etanolo e lasciare asciugare prima di metterli nella camera del campione sulla superficie dell&#39;acqua. </li><li> Rimuovere la punta della pipetta dal supporto del campione e inserire il supporto del campione nella camera del campione. Se il titolare del campione di nuova produzione non rientra nel braccio fase, utilizzare una sabbia finecarta per renderlo più sottile o utilizzare un O-ring (∅ 6 mm) in caso è troppo sottile. </li><li> Per creare i coperchi, tagliare il foglio di alluminio nero in due 50 x 25 mm pezzi. Rendere a 5 mm tagliato nel mezzo di un lato di ciascun pezzo. Piegare per creare un triangolo di rientro (Figura 1D). Chiudere la camera del campione con due coperchi mettendo i coperchi sulla parte superiore della camera del campione con le rientranze triangolo di fronte al supporto del campione. Assicurarsi che le foglie delle piante non sono in ombra delle palpebre e ricevere luce dal sistema di illuminazione. </li><li> Trova la regione di interesse utilizzando il x / y / z e la rotazione fase di posizionare una radice laterale emergente nel campo visivo. </li><li> Prima della registrazione, consentono al sistema di stabilizzare almeno 15 min. </li><li> Imposta l&#39;acquisizione delle immagini. <ol><li> Impostare una pila di 217 immagini con 3 micron z-spacing (650 micron) e impostare l&#39;intervallo di tempo con 15 min intervallo di imaging per un periodo complessivo di 17 h. NOTA: una documentazione dettagliata sucome far funzionare il software OpenSPIM può essere trovato su (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Inizia a registrare. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Foglio leggero microscopia a fluorescenza ha il grande vantaggio di combinare bassa fototossicità e velocità di acquisizione ultraveloce, che può essere usata per catturare un grande volume con un&#39;alta risoluzione spazio-temporale, mantenendo il campione in uno stato fisiologico. La risoluzione di un microscopio foglio leggero può essere paragonato a quello di un microscopio confocale 9. Tuttavia, light scattering e assorbimento avviene lungo il percorso di eccitazione ed emissione individualmente e la qualità dell&#39;immagine può essere significativamente inferiore all&#39;interno tessuti opachi rispetto alla superficie. Per aggirare questo complicazione si può utilizzare la possibilità di ruotare il campione lungo l&#39;asse verticale e osservare lo stesso volume da direzioni diverse. Ma questo non è sempre vantaggioso, ad esempio radici laterali emergono su un lato della radice e immagini da dietro determina una bassa qualità delle immagini senza ottenere maggiori informazioni. Tuttavia, la rotazione può essere utilizzato principalmente per posizionare il SAMPle nel modo migliore. La disposizione orizzontale classico degli obiettivi obiettivi permette di nuovi modi di montaggio del campione. Piante beneficio da una posizione verticale. Qui presentata, il &quot;sulla superficie del gel&quot; metodo di montaggio ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di fissaggio come incorporamento radice all&#39;interno di un gel 24,25. 1) Il sistema radicale è a diretto contatto con il mezzo liquido. La camera del campione è collegata ad un sistema di perfusione che fornisce supporto continuo fresca. Può anche essere utilizzata per scambiare rapidamente l&#39;intero volume della camera del campione per applicare diversi supporti o farmaci. 2) Prima di assaggiare impianti di preparazione crescere come essi sono utilizzati per far crescere in laboratorio. Le piante possono essere selezionate da un microscopio a fluorescenza e solo le piante desiderati devono essere preparati. 3) L&#39;impianto viene trasferito dalla piastra Petri al supporto del campione senza essere toccato. In tal modo l&#39;impianto può sviluppare ulteriormente sullo stesso gel che cresceva sul nel incubato crescitar e stress meccanico è ridotto al minimo. 4) La vista sul provino sia libero e aberrazioni ottiche sono ridotti al minimo in quanto lo spazio tra il campione e l&#39;obiettivo rilevamento viene esclusivamente occupata dal mezzo e senza altri materiali con differenti indici di rifrazione. Per eseguire l&#39;imaging a lungo termine, il sistema di illuminazione dell&#39;impianto è necessario per garantire attività fotosintetica della pianta. Nella maggior parte dei laboratori piante crescono su un gel trasparente, cioè le radici sono esposti alla luce. Ciò può causare risposte diverse al loro ambiente e induce cambiamenti nella loro biochimica e sviluppo 26,27. Al fine di ridurre la quantità di luce sul sistema radice, pellicola di plastica nera è stato utilizzato per coprire la superficie dell&#39;acqua e un coperchio in foglio di alluminio nero coperto camera campione. Luce può raggiungere la pianta esce attraverso il foro centrale nel coperchio. In questa configurazione, nessun aumento della luce di fondo è stato osservato, suggesting che la quantità di luce diffusa dai LED rossi e blu è stata significativamente ridotta dal filtro GFP e gli approcci ombreggiatura. Ciò ha consentito mantenere la luce accesa durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine senza aumentare il rumore macchina di sfondo. Il titolare del campione è stata progettata per la stampa 3D. Tuttavia, la scelta del materiale è fondamentale in quanto diverse materie plastiche che sono stati testati erano stabili non al 100%, con conseguente una deriva del campione. Pertanto, si raccomanda di usare resine invece o costruire il portacampioni macinando un polietilene (PEP) dell&#39;asta. Quando si utilizza una configurazione microscopio ottico foglio con sistema di illuminazione su due lati del supporto del campione può interferire con uno dei fogli di luce a seconda dell&#39;angolo di rotazione. Per ridurre lo stress meccanico durante scavare la pianta dal piatto, utilizzare un angolo piatto della spatola. L&#39;impianto può asciugare rapidamente e il flusso d&#39;aria esperienza per la prima volta. Cercate di evitare qualsiasi progetto di aria (movimenti rapidi, il flusso di aria condizionata), work ininterrottamente e far scorrere il supporto del campione in una punta della pipetta 1000 microlitri, quando possibile. All&#39;interno del microscopio, è fondamentale non immergere l&#39;intera pianta in un liquido e mantenere le foglie secche. La tecnica è ideale per l&#39;imaging prime fasi di formazione delle radici laterali. Quando si esegue l&#39;imaging a lungo termine di apici radicali maturi si deve tenere a mente che le radici di Arabidopsis crescono con 100-300 micron / h rapidamente fuori dal campo visivo. Un utilissimo futura attuazione potrebbe essere un algoritmo automatizzato di monitoraggio, che consentirebbe la crescita punta a seguito della radice per periodi di tempo prolungati. La capacità di controllare le condizioni ambientali, quali luce e la composizione nutrizionale del supporto durante il processo di acquisizione permette indagare come piante si adattano ai cambiamenti. La radice è a diretto contatto con il mezzo liquido, che può essere utilizzato per applicare farmaci per attivare chimicamente espressione genica, per esempio usando il desametasone inducibile 28 o β-estradiol sistema inducibile 29. Tuttavia, ci vuole tempo per scambiare l&#39;intero volume della camera del campione per lavare un farmaco. La configurazione potrebbe essere migliorata riducendo al minimo il volume della camera del campione per accelerare fluido di scambio. Tuttavia, questa tecnica ha un grande potenziale. La combinazione di procedure di montaggio, condizioni di crescita standardizzate e l&#39;acquisizione dell&#39;immagine delicata utilizzando la luce fogli microscopio permette di studi a lungo termine di sviluppo delle piante ad alta risoluzione ad un livello fisiologico. Questo aiuterà i ricercatori a esplorare i meccanismi fondamentali di sviluppo della pianta.

Una delle questioni chiave dello sviluppo dell&#39;impianto comprensione è come le singole cellule si comportano durante la differenziazione degli organi e la crescita. Idealmente, eventi cellulari, come pattern di espressione genica e la localizzazione intracellulare di proteine, possono essere visti alla luce di un contesto più ampio del tessuto. Questo obiettivo pone sfide tecniche e richiede l&#39;osservazione organo complesso con un alto spaziale e risoluzione temporale per periodi prolungati di tempo, che possono causare effetti foto-tossicità. Dal momento che le piante si adattano rapidamente ai cambiamenti ambientali, le condizioni di crescita devono essere strettamente controllati. Per fare immagini a lungo termine senza interferire con lo stato fisiologico della pianta, tre cose devono essere assicurato condizioni, 1) in crescita nella camera del campione, 2) campione stabile montaggio per lunghi periodi di tempo, e 3) imaging con basse intensità di luce per evitare foto-danni e condizioni non fisiologiche. Fisiologico conditi crescenteons nella camera microscopio campioni sono cruciali per esperimenti a lungo termine. Ci sono una serie di protocolli disponibili che descrivono le camere di crescita di imaging per i microscopi confocale 1 - 3. Tuttavia, la microscopia confocale introduce luce ad alta intensità per l&#39;impianto, che può causare reazioni di stress e di solito inibisce la crescita 4. Inoltre, la maggior parte dei microscopi convenzionali consentono solo posizionamento orizzontale del campione, che non è ottimale per le piante poiché cercano di riorientarsi e crescere verso il vettore di gravità. Negli ultimi dieci anni, la luce fogli microscopio è emerso come un potente strumento per catturare lo sviluppo di grandi campioni con risoluzione cellulare per periodi di tempo fino a diversi giorni 5 - 9. Luce-sheet microscopio permette di posizionare il campione in verticale ed è sempre più utilizzato nella ricerca impianto di studiare lo sviluppo delle radici 10 - 21, recentemente recensito da Berthet e Maizel 22. Molti degli studi citati 10,13 - 18,21 sono state ottimizzate e condotti in laboratorio di Ernst HK Stelzer impiegando un modo speciale di campione montaggio caratterizzato dalla crescita della radice sulla superficie di un gel 17. In questi studi, un microscopio misura è stato utilizzato, in cui la pianta è tenuta dal fondo. In contrasto, la maggior parte dei microscopi luce fogli ampiamente disponibili tenere il campione dall&#39;alto. Così, questo particolare metodo di preparazione non può essere facilmente applicata. Il metodo presentato qui fornisce un protocollo per il metodo consolidata on-superficie di montaggio applicabile per la OpenSPIM 23, una piattaforma di accesso aperto per l&#39;applicazione e il miglioramento selettivo piano di illuminazione Microscopy (SPIM). L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di consentire l&#39;imaging a lungo termine delle radici di Arabidopsis nel OpenSPIM microscopio ottico-sheet. Questo si ottiene crescere una pianta eretta sulle surface di un gel con le radici in un liquido pur foglie rimangono nell&#39;aria. Al fine di garantire un&#39;attività fotosintetica della pianta, un sistema di illuminazione su misura illumina le foglie ma non le radici (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Agarosio, basso punto di fusione</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio nero</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di plastica nero</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blu (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&nbsp; CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED rosso (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Scheda LED - Software di progettazione PCB</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monoidrato</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico a micropori</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Portacampioni Stampa 3D</td><td>i.materialise</td><td><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri quadrate (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

luce foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Una delle domande chiave per comprendere lo sviluppo delle piante è come si comportano le singole cellule in un contesto più ampio del tessuto. Pertanto, richiede l'osservazione dell'intero organo con un'elevata risoluzione spaziale e temporale per periodi di tempo prolungati, che può causare effetti fototossici. Questo protocollo mostra un metodo di preparazione del campione di pianta per la microscopia a foglio di luce, che è caratterizzato dal montaggio verticale della pianta sulla superficie di un gel. La pianta è montata in modo tale che le radici siano immerse in un mezzo liquido mentre le foglie rimangono nell'aria. Al fine di garantire l'attività fotosintetica della pianta, un sistema di illuminazione su misura illumina le foglie. Per mantenere le radici al buio, la superficie dell'acqua è coperta con fogli di pellicola di plastica nera. Questo metodo consente l'imaging a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali in condizioni standardizzate.

Questo metodo di preparazione del campione permette la coltivazione della pianta all&#39;interno della camera del campione microscopio osservando l&#39;apparato radicale con un microscopio ottico fogli (figura 1). La pianta cresce sulla superficie di uno strato di gel (½ mezzo MS contenente 1,5% gellano) montato su un portacampioni progettato su misura (Figura 2). Il supporto del campione è 3D stampato utilizzando una resina trasparente come materiale. Una versione prodotta mettendo in evidenza le dimensioni è rappresentata nella Figura 2C. Le radici vengono immerse in un liquido (½ substrato MS), che viene continuamente aggiornata da un sistema di perfusione. Le foglie rimangono in aria e sono continuamente illuminati con un&#39;intensità luminosa di 130 mmol / mq / s proveniente dal LED blu e rosso che sono disposti in un anello sopra la pianta (figura 1A, B e Figura 3A-C). L&#39;anello LED è prodotto nel nostro laboratorio e macchineNoi forniamo i dettagli tecnici su come costruire l&#39;anello a LED in figura 3 e l&#39;elenco del materiale. L&#39;intensità della luce può essere regolata in modo continuo che vanno 30-250 mmol / m 2 / s (Figura 3D). Il sistema radicale è ombreggiato da piccoli fogli di un foglio di plastica nera che copre la superficie dell&#39;acqua (Figura 1). Qualsiasi luce diffusa dalla illuminazione che vengono raccolte dalla lente rilevamento viene filtrata dal filtro GFP (Figura 3E). Con questa impostazione, un lasso di tempo di un radici laterali Arabidopsis crescita è stata registrata per 17 h utilizzando un obiettivo 20X / 0.5 (Figura 4). La radice laterale ha la sua origine nello strato di cellule pericycle, che si trova in profondità all&#39;interno del radice primaria. Per dimostrare la capacità di imaging ancora più profonde all&#39;interno di un tessuto per periodi di tempo prolungati, un più alto ingrandimento (40X / 0.75) è stato utilizzato per catturare la formazione di un ro lateraliot dal primo primordium fase fino alla nascita dalla radice primaria entro un periodo di tempo di 38 ore (Figura 5). Una fetta 2D esemplare del set di dati è mostrato in Fig. 5B. Questa registrazione ci permette di seguire le dinamiche di formazione delle radici laterali in 3D (Figura 5A) con una risoluzione cellulare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Figura 1: condizioni di crescita all&#39;interno della camera del campione OpenSPIM. A) Schizzo della camera di imaging. La pianta cresce eretta sulla superficie di un gel, montato su un portacampioni su misura (vedi anche figura 2). Le radici sono in crescita in un mezzo liquido, che viene continuamente scambiato da un sistema di perfusione. L&#39;impianto lascia crescere in aria e sono illuminati da LED rossi e blu (vedere anche figura 3). Il sistema radicale è ombreggiato ingegno<html> h piccoli fogli di un foglio di plastica nera che copre la superficie dell&#39;acqua. Un coperchio in due pezzi di fogli di alluminio nero riduce ulteriormente la quantità di luce sotto la superficie dell&#39;acqua e mantiene l&#39;umidità nella camera campione. Il pannello ingrandita a destra evidenzia la pianta che cresce sulla superficie di un blocco di gel immerso nel mezzo liquido. Una goccia di agarosio monta radice sul gel. La casella tratteggiata indica la regione di interesse osservata al microscopio. B) Fotografia della camera di imaging (senza coperchio). Numeri (1) - (10) in A e B rappresentano: (1): x / y / z / θ stadi con anello a LED, (2): portacampioni, (3): coperchio (4): Arabidopsis thaliana , (5): fogli di pellicola di plastica nera, (6): sistema di perfusione, (7): la rilevazione lente dell&#39;obiettivo, (8): mezzo liquido, (9): camera per campioni, (10): illuminazione lente dell&#39;obiettivo. C) Il coperchio è realizzato in due pezzi di fogli di alluminio nero.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Figura 2: il porta-campioni. A) modello 3D. Il file di modello 3D è previsto nel materiale supplementare. B) Fotografia di stampe 3D utilizzando diversi materiali (1) - (3): materie plastiche acriliche trasparenti, (4) e (5): Resina, (6): resina trasparente. C) Disegno tecnico del supporto del campione, numeri rappresentano millimetro. D) fotografico del supporto del campione realizzato con un impianto montato. L&#39;area tratteggiata può essere osservato al microscopio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> caricare / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: installazione di illuminazione delle piante. A) schema circuitale della lampada. Coppie di LED possono essere attivati ​​/ disattivati ​​singolarmente per l&#39;illuminazione direzionale. LED: diodi emettitori di luce, R: resistenza, T: transistor, JP: capocchia di spillo. B) Il progetto definitivo della lampada di illuminazione è stato redatto utilizzando un PCB-software (PCB: circuito stampato). Forniamo il file di disegno bordo nel materiale supplementare. La scheda è stata poi prodotta e assemblata in officina MIBA del nostro istituto. C) la fotografia dell&#39;anello LED acceso. Quattro coppie di rosso e un LED blu sono disposti in un anello. D) La gamma di tensione può essere regolata tra 3,5 V e 14,0 V. Le resistenze sono stati usati per raggiungere la quantità di luce che vanno 30-250 mmol / m 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) Lo spettro di emissione della lampada, GFP e YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Figura 4: tempo di registrazione lasso di Arabidopsis thaliana radici laterali. Il 5 giorni piantina esprime un marcatore di membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e un giornalista nucleare (NLS pGATA23 ::-GUS-GFP) specificamente marcatura pericycle cellule che si sviluppano in una delle radici laterali. Una pila di 217 immagini (3 micron z-spaziatura) è stato catturato ogni 15 minuti per la registrazione 17 h utilizzando un obiettivo 20X / 0.5. A) Quattro punti di tempo di 69 sono mostrati in una proiezione massima intensità. B) sono mostrati Sei su 217 singole fette di z-pila di un punto di tempo. Barre di scala in A e B rappresentano 100 micron.carico / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Figura 5: tempo di registrazione lasso di Arabidopsis thaliana radici laterali. Il 6 giorni piantina esprime un marcatore di membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e un giornalista nucleare (NLS pGATA23 ::-GUS-GFP) specificamente marcatura pericycle cellule che si sviluppano in una delle radici laterali. Una pila di 200 immagini (1,5 micron z-spaziatura) è stato catturato ogni 15 minuti per la registrazione 38 h utilizzando un obiettivo 40X / 0.75. A) Rappresentazione 3D di quattro punti di tempo, i numeri nella griglia rappresentano micron, B) singola fetta attraverso il piano centrale della radice principale. barra della scala rappresenta 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">per favore</a>clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Il file di modello 3D è fornito. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Clicca qui per scaricare il file.</a> File supplementare LED Anello Board.brd. Il file di disegno scheda è dotata. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Clicca qui per scaricare il file.</a>

Questo protocollo mostra un metodo di preparazione del campione di piante per la microscopia a foglio di luce. La configurazione è caratterizzata dal montaggio verticale della pianta sulla superficie di un gel e dal lasciarla crescere in condizioni di luminosità controllata. Ciò consente l'osservazione a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali in condizioni standardizzate.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere osservazioni a lungo termine di un sistema radicale vegetale mediante microscopia a foglio luminoso. Per raggiungere questo scopo, è essenziale disporre di un metodo delicato di preparazione del campione, di condizioni di crescita controllate e di una tecnica di imaging che non alteri lo sviluppo della pianta, come la microscopia a foglio luminoso. Per iniziare, le piante vengono coltivate sulla superficie di uno strato sottile di gel dello spessore di due millimetri.Il gel con una piantina di Aribidopsis viene quindi ritagliato, prelevato e trasferito sul portacampioni del microscopio. All'interno del microscopio, la pianta cresce nella sua posizione naturale eretta. Le radici crescono in un mezzo liquido, mentre le foglie rimangono nell'aria.Un sistema di illuminazione illumina esclusivamente le foglie. La superficie dell'acqua è ricoperta per mantenere le radici al buio. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'inclusione della radice all'interno di un gel, è che siamo abituati a far crescere le piante sulla superficie di un gel.Pertanto, possiamo attenerci allo stesso identico protocollo di crescita di prima. In secondo luogo, la radice è a diretto contatto con il mezzo liquido, che può essere sostituito per trattamenti farmacologici, ad esempio. Versare 30 millilitri di mezzo MS a mezza concentrazione, appena autoclavato e contenente il 1,5 percento di fitogel, in una piastra di Petri quadrata per creare uno strato di circa 2 millimetri.Seminare i semi sterili uno accanto all'altro con uno spazio di almeno un centimetro tra loro. Quindi, avvolgere la piastra con del nastro micro-poro. Coltivare la piastra nel proprio incubatore di crescita in posizione verticale per un massimo di 10 giorni.In questo esperimento, utilizziamo piante di sei giorni per osservare lo sviluppo delle radici laterali. Forniamo un modello per la stampa 3D del portacampioni. Abbiamo testato diversi materiali.Le resine trasparenti si sono rivelate le più adatte in termini di rigidità e resistenza all'acqua. Una descrizione dettagliata delle dimensioni necessarie per lavorare un porta-campione a partire da materiale solido è riportata nel manoscritto. Tagliare il gel attorno alla pianta utilizzando un bisturi.Quindi, prelevare con cura il blocco di gel su cui sta crescendo la pianta e trasferirlo con attenzione sul portacampioni. Sciogliere l'aggros all'1 percento a 80 gradi Celsius e raffreddarlo fino a 33 gradi Celsius. Incollare il blocco di gel sul portacampioni e fissare la pianta sul gel con attenzione.Utilizzare un microscopio stereoscopico per verificare la posizione della pianta e assicurarsi che la regione di interesse non sia coperta da alcun gel. Per evitare che la pianta si secchi, inserire il portacampioni su una punta di pipetta da 1.000 microlitri ogni volta che possibile. Posizionare il portacampioni su una scatola per punte di pipetta e preparare ulteriori campioni se necessario.Il nostro microscopio è un modello open-spin classico senza modifiche significative. Abbiamo implementato un sistema di illuminazione per la coltivazione di piante all'interno del microscopio. I LED rossi e blu sono disposti in un anello.Le coppie di LED possono essere accese e spente singolarmente per un'illuminazione direzionale. Lo spettro del sistema di illuminazione corrisponde a quello delle nostre camere di crescita. Quasi tutta la luce proveniente dai LED viene bloccata dal filtro di emissione per GFP.Non siamo riusciti a rilevare alcuna luce parassita che raggiunge la fotocamera. Pertanto, la luce può rimanere accesa durante l'acquisizione delle immagini. L'intensità luminosa può essere regolata, con valori compresi tra 30 e 250 micromoli per metro quadrato al secondo.Avvitare o incollare l'anello LED sul lato inferiore del braccio del portacampioni aperto. Rimontarlo sul microscopio e collegare i cavi. Assemblare il sistema di perfusione.Collegare i tubi alla camera del campione in un'organizzazione unidirezionale. Regolare la velocità a un millilitro al minuto. Aggiungere tre quadratini di un foglio di plastica nera sterile e distribuirli sulla superficie dell'acqua.Inserire il campione nel microscopio. Verificare che non ci siano fogli di plastica attaccati al portacampione. Chiudere la camera con due coperchi realizzati in foglio di alluminio nero.Accendere la luce e regolare l'intensità luminosa. Spegnere la luce della stanza e iniziare la registrazione. Questo metodo consente di registrare la crescita radicale per diverse ore fino a giorni, come illustrato qui dalla crescita di una radice laterale.Le immagini di un z-stack relativo a un singolo punto temporale mostrano buone proprietà di sezione ottica. Abbiamo catturato l'intero processo di formazione delle radici laterali in 3D, il che ci permette di studiarne la dinamica. L'analisi di una singola sezione di questa registrazione rivela una buona risoluzione, anche nelle profondità della radice.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione del metodo di preparazione del campione vegetale per la microscopia a foglio luminoso. Seguendo questo protocollo, siamo ora in grado di osservare la localizzazione intracellulare di proteine o i modelli di espressione genica durante l'organogenesi, i tropismi vegetali o l'adattamento della pianta. Questo ci aiuterà a comprendere la regolazione spazio-temporale dello sviluppo vegetale.

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