Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una procedura solida, riproducibile e semplice per l'isolamento di mioblasti primari da esseri umani adulti e anziani. Questo protocollo propone un flusso di lavoro ottimizzato per l'isolamento di mioblasti umani primari come modello in vitro per studi funzionali dei processi associati all'omeostasi muscolare durante l'invecchiamento. Il protocollo mantiene il comportamento naturale delle cellule evitando stress come la centrifugazione, consentendo l'isolamento e la coltura a lungo termine di mioblasti primari per mantenere il fenotipo.

Iniziare questa procedura preparando una piastra di Petri da 60 millilitri o due pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, pipettare una quantità minima di soluzione di laminina per coprire completamente la superficie della piastra. Quindi, incubare la piastra per almeno 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, prima di seminare le cellule.

Successivamente, preparare la soluzione enzimatica in DMEM privo di siero. Mescolare accuratamente e filtrare la soluzione enzimatica attraverso una membrana filtrante da 0,2 micrometri per sterilizzarla. Dopo il prelievo del campione, mantenere il muscolo a quattro gradi Celsius in DPBS fino alla digestione.

Preparare almeno due millilitri di soluzione enzimatica per 18-20 milligrammi di tessuto muscolare e riscaldarla a 37 gradi Celsius prima della dissociazione del tessuto. Successivamente, immergere brevemente la biopsia muscolare in etanolo al 70 percento. Lavare con DPBS fresco, quindi con etanolo al 70 percento, e poi posizionare il tessuto su una nuova piastra di Petri in una quantità sufficiente di soluzione enzimatica da coprire il campione.

Eliminare la maggior parte possibile di tessuto fibrotico e adiposo e strappare delicatamente il muscolo in piccoli pezzi distinguibili. Successivamente, trasferire il campione in una provetta da 50 millilitri contenente almeno un millilitro di soluzione enzimatica. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per un massimo di 30 o 40 minuti, muovendo il tessuto muscolare agitando delicatamente la provetta ogni cinque-dieci minuti.

Successivamente, ricoprire le pipette con il mezzo per evitare l'adesione delle cellule rilasciate alla parete di plastica delle pipette. Quindi, aggiungere quattro millilitri di mezzo di crescita sterile per arrestare la digestione. Aspirare e dispensare più volte per favorire il distacco delle cellule dalle fibre muscolari.

Successivamente, filtrare la soluzione muscolare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Lavare le cellule residue con ulteriore mezzo di coltura e filtrarle attraverso il filtro.

Quindi, centrifugare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare. Dopo cinque minuti, eliminare con attenzione il soprannatante. Quindi, risospendere il pellet nel mezzo di crescita F12.

In questo passaggio, prelevare il contenitore per colture precedentemente rivestito con laminina dall'incubatrice. Rimuovere con attenzione l'eccesso di laminina dalla piastra di coltura, evitando di toccare la superficie. Successivamente, lavare delicatamente la piastra di coltura con DPBS.

Successivamente, seminare le cellule direttamente nel contenitore rivestito con laminina. Incubarle per 24 ore in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Esaminare le cellule al microscopio in campo chiaro il giorno successivo.

Le piccole cellule rotonde si attaccano alla superficie e i restanti detriti dovrebbero essere visibili nel mezzo di coltura. Successivamente, sostituire il mezzo con mezzo F12 fresco. In questo procedimento, cambiare il mezzo ogni due o tre giorni e suddividere le cellule non appena si osservano gruppi di cellule al microscopio, al fine di evitare una differenziazione spontanea.

Per il passaggio cellulare, rimuovere il mezzo e lavare le cellule due volte con DPBS. Aggiungere la minima quantità di tripsina al 0,25 percento con EDTA necessaria per coprire la superficie delle cellule. Agitare delicatamente per assicurarsi che tutte le cellule siano ricoperte dalla soluzione di distacco, quindi incubare per 10 secondi a temperatura ambiente prima di rimuoverla.

Successivamente, incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per tre a cinque minuti. Toccare delicatamente e verificare al microscopio a luce brillante che le cellule siano arrotondate ma non completamente staccate dalla superficie. Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo di crescita per raccogliere le cellule, mescolare bene e trasferire le cellule con il nuovo mezzo in un’allevola T75.

Successivamente, lavare le cellule residue con altri 5 millilitri di mezzo di crescita. Per eseguire il prelievo al primo passaggio, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 40 minuti fino a un'ora. Successivamente, raccogliere il soprannatante contenente le cellule non aderenti e incubarle in una nuova fiasca T75.

Questo dovrebbe arricchire la coltura e i mioblasti, poiché la maggior parte dei fibroblasti dovrebbe essersi attaccata nel primo flacone. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni e suddividere le cellule non appena raggiungono il 70 percento di confluenza.

Per la differenziazione, una volta che le cellule raggiungono una confluenza del 70-80%, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di differenziazione. La differenziazione delle cellule dovrebbe avvenire entro cinque a sette giorni, a seconda della qualità e della purezza della coltura di mioblasti. Al passaggio zero e dopo cinque giorni dal seeding, le cellule sono ancora rotonde e di piccole dimensioni, ma visibili al microscopio ottico in campo chiaro.

I mioblasti assumeranno quindi una forma allungata, come nel passaggio. Come mostrato qui, MyoD è espresso nei mioblasti, ma non nei fibroblasti. I mioblasti primari umani possono essere caratterizzati mediante colorazione per la vitalità cellulare, immunocolorazione per Ki67 per la proliferazione, immunocolorazione per MF20 per la differenziazione e colorazione per la beta-galattosidasi associata alla senescenza per saggi di senescenza.

I mioblasti primari possono essere utilizzati per saggi funzionali. In questa figura, la colorazione immunologica con MF20 dei miotubi primari differenziati provenienti da esseri umani adulti mostra gli effetti dell'overespressione o dell'inibizione di miR-378 sulla dimensione e il numero dei miotubi. Le analisi mediante QPCR mostrano che le trasfezioni con mimico di miR-378 e con anti-miR sono state efficaci e hanno determinato variazioni nell'espressione relativa di miR-378 e di LGF1R, un gene bersaglio validato di miR-378, a seguito dell'overespressione o dell'inibizione di miR-378 nei mioblasti primari umani.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore. Questo protocollo solido e riproducibile è particolarmente utile quando altri metodi più sofisticati e costosi, come il sorting cellulare, non sono possibili o praticabili. Questa tecnica semplificata è utile per i ricercatori nel campo della muscolatura per esplorare il fenomeno dell'invecchiamento in modelli sperimentali umani in vitro.

In sintesi, questo metodo proposto consente l'isolamento di cellule progenitrici miogeniche dal muscolo non solo di esseri umani adulti, ma anche di soggetti anziani, per studi funzionali in vitro che possono essere applicati anche a modelli animali.