La coltivazione di Caenorhabditis elegans In tre dimensioni in laboratorio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un sistema di coltivazione tridimensionale per nematodi che possa simulare meglio le condizioni naturali. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo, della fisiologia e del comportamento del C elegans. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo studiando il comportamento naturale dei nematodi nei frutti in decomposizione, che è un ambiente 3D.

Questa tecnica è vantaggiosa rispetto alle tecniche di coltivazione bidimensionali standard perché i nematodi risiedono in habitat 3D in natura. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato nella coltivazione di C elegans, può essere applicato anche ad altri nematodi. A dimostrare questa procedura sarà Tong Young Lee, uno studente laureato nel mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, Otto Clave le soluzioni preparate a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, preparare 50 millilitri di soluzione sterile di colesterolo a 5 milligrammi per millilitro. In un tubo conico da 50 millilitri, aggiungere 0,25 grammi di colesterolo e 50 millilitri di etanolo al 99,99% e mescolare bene.

Successivamente, sterilizzare la soluzione di colesterolo utilizzando una siringa da 50 millilitri con un filtro per siringa ventilato da 0,45 e rimuovere il colesterolo non sviluppato. Quindi, inoculare 10 millilitri di brodo di lisogenia con batteri. Coltivare l'inoculazione batterica a 37 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante durante la notte.

In preparazione per una diluizione seriale, allocare nove millilitri della soluzione di cloruro di sodio in sette provette coniche sterili da 15 millilitri. Per fare una tenda della diluizione settima piega di Opi 50 Ceppo E Coli. Successivamente, estrarre un millilitro della coltura batterica o della coltura batterica diluita in una nuova provetta con nove millilitri di soluzione di cloruro di sodio.

E agitare bene il composto. Dopo aver preparato la coltura batterica, aggiungere 0,6 grammi di cloruro di sodio, un grammo di coclea granulata e 0,5 grammi di peptone in un pallone da 500 millilitri. Inserire un'ancoretta magnetica nel pallone.

Quindi aggiungere 195 millilitri di acqua distillata e coprire il pallone con un foglio di alluminio. Successivamente, Otto Clave il campione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, mettere il pallone caldo Otto Claved in una piastra di agitazione, mescolare a velocità moderata per almeno due ore fino a raggiungere i 40 gradi Celsius.

In alternativa, il pallone può essere raffreddato a 40 gradi Celsius mettendolo in un bagnomaria a 40 gradi Celsius per 15 minuti prima di trasferirlo su una piastra di agitazione. Assicurati di raffreddare a sufficienza mentre prosegui da qui. Una temperatura elevata può portare all'opacizzazione della coclea finita, ma una temperatura troppo bassa può provocare un indurimento prematuro della coclea.

Quando la temperatura della coclea raggiunge i 40 gradi Celsius, aggiungere cloruro di calcio, soluzione di colesterolo, solfato di magnesio e tampone fosfato di potassio e continuare a mescolare la soluzione. Per il saggio della durata di vita di NGT-3D, aggiungere 80 microlitri di FUDR da 150 millimetri al terreno per ottenere una concentrazione finale di 120 micromolari. Quindi, rimuovere sei millilitri di terreno a coclea in un tubo conico sterile e tenerlo caldo in un'incubatrice.

Questo mezzo verrà utilizzato per lo strato superiore privo di batteri. Quindi aggiungere sei millilitri di coltura batterica diluita nel pallone direttamente su un banco sterilizzato. Per NGT-3D, versare 6,5 millilitri di terreno nelle provette di plastica trasparente da otto millilitri per formare uno strato di coclea batterica.

E dosare con cura 200 microlitri di terreno privo di batteri sopra il supporto 3D semiduro per creare un sottile strato privo di batteri sulla parte superiore. Quindi chiudere bene il coperchio della camera. Per NGB-3D, versare 65 millilitri di terreno in un flacone di coltura cellulare di plastica trasparente quadrato di 25 centimetri.

Quindi posizionare la camera verticalmente a temperatura ambiente per una settimana per consentire alle colonie batteriche di crescere fino a dimensioni considerevoli di almeno un millimetro di diametro. In questa procedura, prelevare un verme L a quattro stadi e trasferirlo su una piastra NGM priva di batteri. Quindi lascia che il verme si muova liberamente per alcuni minuti per rimuovere i batteri dal suo corpo.

E ripeti la procedura altre due volte. Successivamente, posiziona con cura il verme pulito sulla superficie del supporto 3D. Il verme avrebbe dovuto effettivamente entrare nella coclea nella matrice della coclea 3D.

Quindi chiudere il coperchio senza stringere per incubare per 96 ore a 20 gradi Celsius. Dopo quattro giorni, chiudere bene il coperchio e posizionare la camera di coltura NGT-3D in un bagno d'acqua a 88 gradi Celsius per sciogliere la coclea. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire il terreno fuso su una capsula di Petri di plastica di nove centimetri.

Successivamente, utilizzando un microscopio da dissezione stereo a trasmissione, contare il numero di vermi negli stadi L3, L4 e adulti. Come mostrato qui, la costruzione di NGT-3D è un protocollo semplice e diretto che si traduce in una provetta riempita a coclea con piccole colonie batteriche distanziate in tutta la coclea. Per confermare se il C elegans può ridursi e crescere normalmente in NGT-3D, la fertilità e lo sviluppo delle larve vengono confrontati in 3D con le piastre NGM 2D standard.

Nel saggio delle dimensioni relative della covata, gli ermafroditi adulti di C elegans in NGT-3D si sono riprodotti altrettanto bene degli ermafroditi nelle piastre MGM 2D standard quando le colonie batteriche sono abbondanti con almeno 60 colonie. Inoltre, lo sviluppo delle larve in NGT-3D procede normalmente anche quando ci sono molte colonie batteriche con la maggior parte dei vermi allo stato adulto dopo 96 ore. Tuttavia, se le colonie batteriche sono scarse nella matrice 3D, sia le dimensioni relative della covata che lo sviluppo delle larve sono influenzati negativamente.

Ecco una curva di sopravvivenza dell'elegans selvatico di tipo C nelle placche NGT-3D o NGM. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi della durata della vita e l'analisi del comportamento per rispondere a domande sull'invecchiamento e sul comportamento in 3D.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della genetica per esplorare le questioni relative all'ecologia e all'evoluzione nel Celegans. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare i nematodi in un ambiente di laboratorio 3D.