A Rapid, metodo scalabile per l'isolamento, studio funzionale, e analisi di Cell-derivati ​​matrice extracellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare la matrice extracellulare dalle cellule in coltura per un'ampia varietà di esperimenti a valle, per aiutare a comprendere le funzioni e le proprietà della matrice extracellulare nei tessuti normali e nei processi patologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della matrice extracellulare, come l'organizzazione, la composizione molecolare, le interazioni proteiche o le proprietà funzionali della matrice extracellulare. Inoltre, la matrice extracellulare potrebbe essere preparata da qualsiasi tipo di cellula aderente.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possono essere eseguite su diverse scale per rimuovere in modo efficiente le cellule e trattenere le proteine della matrice extracellulare. A dimostrare la procedura saranno Silvia Rosini, una studentessa laureata nel mio laboratorio, e Andrew Hellewell, un ricercatore post-dottorato. Per iniziare, piastreggiare le cellule su vetrini coprioggetti per l'imaging di cellule vive e matrice extracellulare o ECM.

Per gli studi di microscopia a fiorescenza, una ECM fissa. O per la preparazione di ECM derivate da cellule per studi funzionali su piccola scala. Incubare le cellule a una temperatura e umidità adeguate per un tempo adeguato affinché le cellule depositino la MEC.

In genere superiore a 16 ore. In una cappa aspirante, preparare 20 millimolari di idrossido di ammonio in un recipiente adatto utilizzando acqua deionizzata per diluire la soluzione madre da uno a 14. Rimuovere le cellule dall'incubatore e rimuovere delicatamente il terreno di coltura.

Quindi aggiungere PBS senza calcio o magnesio versando delicatamente contro la parete del piatto. Scuoti il piatto due volte e versa via il liquido. Quindi ripetere il lavaggio altre due volte.

Nella cappa aspirante, rimuovere l'ultimo lavaggio PBS, aggiungere 1,5 millilitri di idrossido di ammonio per piatto da 60 millimetri e incubare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti. Agitare delicatamente le stoviglie ogni minuto per garantire la lisi di tutte le cellule. Quindi, aggiungi abbondanti quantità di acqua deionizzata a ciascun piatto e scuoti il piatto.

Quindi versare il materiale solubilizzato in idrossido di ammonio, che è composto da idrossido di ammonio, celle lisate e acqua deionizzata. Lavare lo strato insolubile della MEC in abbondanti quantità di acqua deionizzata altre quattro volte, per garantire la completa rimozione di tutto il materiale solubilizzato in idrossido di ammonio. È essenziale che le cellule vengano completamente rimosse con abbondanti lavaggi in acqua deionizzata.

Se questi passaggi non vengono eseguiti in modo adeguato, il materiale cellulare può rimanere sulla piastra e contaminare l'analisi a valle. Per l'esame della MEC mediante immunofluorescenza, rimuovere l'acqua deionizzata rimanente, fissare la MEC aggiungendo il 2% di paraformaldeide, abbreviato in PFA, e incubare le piastre a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare PBS per lavare due volte ogni campione di fix e smaltire la soluzione in un contenitore per rifiuti liquidi prima di eseguire la microscopia a fluorescenza secondo il protocollo di testo.

In una cappa a flusso laminare preparare soluzioni sterili di PBS senza calcio e magnesio, idrossido di ammonio 20 millimolare e acqua deionizzata facendo passare ciascuna soluzione attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri in un contenitore sterile appropriato. Pur mantenendo la tecnica sterile, utilizzare il PBS sterile per lavare delicatamente le cellule produttrici della matrice sui vetrini coprioggetti tre volte. Dopo aver rimosso il lavaggio finale con PBS, aggiungere 1,5 millilitri di idrossido di ammonio sterile alla piastra da 60 millimetri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti con oscillazione intermittente.

Aggiungere abbondanti quantità di acqua deionizzata sterile al piatto a dondolo, versare il lisato cellulare in un apposito contenitore per rifiuti. Ripetere questo lavaggio altre quattro volte per garantire la completa rimozione del materiale solubilizzato. Dopo aver tripsinizzato e pellettato le cellule secondo il protocollo di testo, risospendere le cellule di prova in un terreno sterile fresco e utilizzare un emocitometro per contare le cellule.

Quindi piastrate il numero appropriato di cellule di prova e il terreno di coltura sulla ECM sterile isolata su vetrini coprioggetti e incubate per due o tre ore o per il tempo necessario. Per esaminare l'organizzazione del citoscheletro di actina, fissare le cellule di prova in PFA al 2% e colorarle con FITC-falloidina per visualizzare la F-actina e DAPI per visualizzare i nuclei. Dopo aver coltivato un gran numero di cellule, quindi aver rimosso le cellule e aver lavato l'ECM come mostrato in precedenza nel video, inclinare ciascuna piastra di un angolo per drenare l'acqua residua sul fondo della piastra e utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con cura l'acqua residua fino a quando la piastra non è completamente asciutta.

Allo stesso tempo, riscaldare il tampone del campione SDS-PAGE contenente 100 millimolari di DDT a 95 gradi Celsius per due minuti e aggiungere 200 microlitri a ciascuna piastra da 100 millimetri da esaminare mediante immunoblot. Utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere il campione su un lato del piatto e utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri per trasferirlo in una provetta. Per analizzare l'ECM mediante spettrometria di massa, preparare un campione più concentrato raccogliendo il tampone di campionamento SDS-PAGE dalla capsula, riscaldandolo nuovamente a 95 gradi Celsius e utilizzando la stessa aliquota su due o tre piastre aggiuntive.

Trasferire l'estratto residuo del tampone del campione SDS-PAGE dalla punta del raschietto cellulare nella provetta per ridurre al minimo la perdita di materiale ECM. Per un'efficace estrazione dell'ECM isolata nel tampone del campione SDS-PAGE, è essenziale che il tampone del campione sia riscaldato a 95 gradi, contenga un agente riducente e che la piastra sia ampiamente raschiata. Qui sono mostrate cellule COS-7 cresciute su vetrini.

Il trattamento con idrossido di ammonio ha rimosso le cellule in modo efficace, come stabilito dalla perdita dei nuclei cellulari e del citoscheletro di actina. In questa figura, le cellule COS-7 sono state trasfettate con il tag RFP trombospondina-1. E la ECM è stata visualizzata prima e dopo il trattamento con idrossido di ammonio.

Si deduce che i punti fluorescenti identificati in entrambe le immagini siano associati alla MEC. In questo esperimento i fibroblasti dermici umani sono stati rimossi con idrossido di ammonio e la ECM è stata sondata con anticorpi anti-collagene 1, che hanno dimostrato un caratteristico pattern di colorazione fibulare e meshwork. Come mostrato qui, la colorazione con fibronectina è stata eseguita sulla ECM da cellule di condrosarcoma di ratto estratte con idrossido di ammonio.

In questo esempio, le cellule COS-7 di prova sono state piastrate per due ore su ECM sterile prodotta da cellule RCS e analizzate per l'organizzazione della F-actina mediante colorazione FITC-falloidina. Rispetto alle cellule COS-7 che producono la propria ECM. In questo esperimento, la ECM è stata isolata da cellule di condrosarcoma di ratto e le proteine derivate dalla ECM sono state poi separate mediante SDS-PAGE.

E le quattro bande principali sono state isolate e analizzate mediante spettrometria di massa. Sono stati identificati la fibronectina, la trombospondina-1 e cinque e la matrilina-1. Infine, la ECM endogena dei fibroblasti dermici umani è stata analizzata mediante immunoblotting.

Sono state rilevate la fibronectina e la trombospondina-1, mentre le proteine intracellulari alfa-tubulina e beta-actina erano assenti. Una volta padroneggiata, la rimozione delle cellule con idrossido di ammonio e l'estrazione della ECM con tampone campione caldo SDS-PAGE da tre piastre da 100 millimetri possono essere eseguite in un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di preparare ogni volta soluzioni di lavoro fresche di idrossido di ammonio per rimuovere le cellule.

È anche molto importante utilizzare lavaggi abbondanti con acqua deionizzata per assicurarsi di rimuovere tutte le cellule. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come la proteomica, l'analisi della ECM estratta per rispondere a ulteriori domande, come l'abbondanza relativa di proteine ECM prodotte da diversi tipi di cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rimuovere le cellule in modo efficiente dai piatti di coltura cellulare e di come estrarre l'ECM.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale.