Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità

L'obiettivo generale dell'utilizzo di un costrutto marcato con GFP è confermare l'identità di una proteina precedentemente sconosciuta utilizzando la GFP come handle. Questo metodo può aiutare con l'identificazione funzionale dei geni orfani quando una specifica attività enzimatica non è disponibile per la conferma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tag GPF consente di utilizzare lo stesso costrutto per diversi tipi di esperimenti.

In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo possono avere problemi, perché la trasfezione non sempre porta all'espressione del costrutto forte e le cellule non sempre si rianimano. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta, quando abbiamo iniziato a riconoscere le difficoltà di identificare una proteina utilizzando solo gli anticorpi creati contro di essa. Iniziare risospendendo le cellule di interesse in un millilitro di tampone di elettroporazione salina tamponato con HEPES e posizionare immediatamente le cellule sul ghiaccio.

Aggiungere alle cellule un volume sufficiente di plasma marcato con GFP-TMEM184A per ottenere una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro di DNA e trasferire circa 0,4 millilitri di cellule in una cuvetta per elettroporazione pre-raffreddata. Elettroporare le cellule. Quindi vedere le cellule trasfettate su piastre di coltura tissutale e posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare per 24-72 ore.

La fase di trasfezione è la fase più critica della procedura, perché la maggior parte del lavoro sperimentale rimanente non può essere completato efficacemente se le cellule non sono vitali e non esprimono livelli significativi del costrutto marcato con GFP. Al momento sperimentale appropriato, aggiungere 100 microgrammi per millilitro di rodamina eparina al terreno di coltura cellulare che esprime il plasmide GFP e incubare le cellule, al riparo dalla luce, fino a raggiungere il livello di colorazione desiderato, come osservato dalla microscopia a fluorescenza. Successivamente, sciacquare le cellule con PBS e alcuni secondi di agitazione delicata, al riparo dalla luce, seguito da fissazione con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Per valutare la co-localizzazione della rodamina eparina marcata con GFP, utilizzare un microscopio confocale con l'eccitazione appropriata di GFP e rodamina e laser diminuiti per visualizzare almeno 50 cellule da ciascun esperimento di marcatura separato. Esaminare le immagini nel programma di analisi delle immagini appropriato per determinare il reperimento e l'assorbimento relativo di rodamina in ciascuna cellula, utilizzando uno strumento a mano libera per cerchiare le cellule all'interno di ciascuna immagine fluorescente. Usa lo strumento di misurazione per determinare l'intensità all'interno di ogni spazio cerchiato, quindi esporta i dati di intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo per calcolare l'area moltiplicata per l'intensità, sottraendo lo sfondo per la stessa quantità di area per ogni cella.

La fluorescenza per cellula può quindi essere mediata per tutte le cellule, per ottenere dati statisticamente significativi. Per facilitare il trasferimento dell'energia di risonanza della fluorescenza dalla GFP TMEM184A alla rodamina eparina, è stato prima montato il GFP fisso TMEM184A trasfettato le cellule marcate con rodamina eparina su vetrini da microscopio. Eccitare le cellule a 405 nanometri per l'imaging dell'emissione di rodamina, seguito da un'eccitazione di 488 nanometri per visualizzare l'emissione di GFP.

Quindi eccitare le cellule a 561 nanometri per un secondo imaging dell'emissione di rodamina. Per l'imaging su cellule vive dell'assorbimento della rodamina eparina, seminare una coltura confluente da 100 millilitri di cellule GFP TMEM184A trasfettate in piastre di imaging di cellule vive da 635 millimetri per ottenere cellule vicine alla confluenza. Dopo 48 ore, sostituire il surnatante con un terreno di coltura privo di rosso fenolo e trasferire una capsula di cellule in un microscopio confocale con un tavolino di riscaldamento impostato a 37 gradi Celsius.

Metti a fuoco il microscopio e aggiungi 100 microgrammi per millilitro di rodamina eparina alle cellule mescolando delicatamente. Quindi inizia immediatamente a registrare le immagini dal vivo. Se non si verifica alcun assorbimento di eparina all'interno del campo visivo, muovere leggermente la capsula per identificare le cellule con almeno una vescicola verde, contenente l'etichetta della rodamina.

Per la valutazione del legame con l'eparina in vitro, sciacquare una piastra nera da 96 pozzetti rivestita in ativan e una piastra nera non rivestita da 96 pozzetti con 200 microlitri di CHAPS PBS pro-well allo 0,2% per tre lavaggi di cinque minuti con agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di 60 picomoli per pozzetto di anti-GFP biotinilato in triplicato alla piastra rivestita di ativan per ciascun gruppo di reperto GFP. Quindi, aggiungere il tampone solo ai pozzetti di controllo e sigillare tutti i pozzetti con un coperchio a piastra per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente con agitazione.

Al termine dell'incubazione, lavare tutti i pozzetti tre volte in CHAPS PBS, come appena dimostrato, e aggiungere 100 microlitri di cinque nanomoli per pozzetto di GFP TMEM184A, o GFP da solo, ai pozzetti appropriati nella piastra rivestita di ativan. Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con agitazione, lavare tutti i pozzetti con CHAPS PBS fresco e aggiungere 100 microlitri di ogni concentrazione sperimentale di fluoresceina-eparina, ai pozzetti di prova appropriati in triplicato, alla piastra rivestita di ativan. Aggiungere gli standard di concentrazione sia alle piastre rivestite di ativan che a quelle non rivestite e incubare entrambe le piastre per 10 minuti a temperatura ambiente, agitando, al riparo dalla luce.

Ora, utilizzare un lettore di piastre per registrare l'emissione iniziale di eparina-fluorescenza nei pozzetti di controllo di entrambe le piastre e l'emissione iniziale di fluorescenza totale dai pozzetti con la GFP immobilizzata o la GFP TMEM184A nella piastra rivestita in ativan. Quindi trasferire l'eparina fluorescente non legata dai pozzetti con la GFP immobilizzata TMEM184A o GFP nei pozzetti corrispondenti nella piastra nera non rivestita. Dopo aver letto immediatamente l'emissione di fluorescenza sulla piastra nera non rivestita, aggiungere 100 microlitri di CHAPS PBS fresco nei pozzetti da cui è stata rimossa la fluoresceina-eparina e leggere le emissioni di fluorescenza per questi pozzetti per ottenere l'emissione di fluorescenza dai campioni rimossi e non legati nella piastra non rivestita.

Quando tutte le letture non associate sono state ottenute, utilizzare i valori di emissione totale di eparina per confermare che i livelli corretti di eparina sono stati aggiunti a ciascun pozzetto, sottraendo le letture medie di fondo dai valori. Quindi creare un grafico dell'emissione rispetto alla fluoresceina-eparina totale aggiunta, per determinare la scala dell'emissione rispetto alla quantità di eparina, e tracciare l'eparina legata corretta, rispetto all'eparina aggiunta per i triplicati da entrambi i pozzetti di GFP e GFP TMEM184A. Il periodo di tempo dopo la trasfezione influisce sulla distribuzione della GFP TMEM184A, che sembra accumularsi nell'arco di almeno 72 ore, con più GFP evidente nella regione paranucleare nel tempo.

Il modello di colorazione della GFP in questa coltura cellulare vascolare rappresentativa sembra essere molto simile a quello di un anticorpo sollevato contro un peptide C-terminale, un risultato logico, dato che la GFP si trova al C-terminale della proteina. L'uso di un ligando fluoresceina-rodamina-eparina può essere utilizzato anche per la valutazione in tempo reale della co-localizzazione del recettore del ligando nel tempo. L'assorbimento di eparina è aumentato nella GFP TMEM184A costruiscono cellule knockdown stabili trasfettate, con conseguente riacquisto della capacità di internalizzare l'eparina rodamina al livello o al di sopra del livello delle cellule wild-type.

Utilizzando il sistema tattile GFP codificato da plasmide dimostrato, il costrutto GFP isolato anti-GFP TMEM184A dimostra un legame specifico con tripla eparina, mentre la GFP di controllo non lega alcuna eparina. La semplice colorazione in immunofluorescenza con anticorpi può anche fornire informazioni sulla posizione della GFP, in base all'accesso degli anticorpi nelle cellule non permeabilizzate, fornendo prove preliminari che la GFP espressa sulla membrana plasmatica è extracellulare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può portare a un'eccellente espressione del costrutto GFP, dopo 24-48 ore di coltura.

Quando si tenta il protocollo di imaging dal vivo, è importante ricordare che alcune cellule potrebbero non mostrare l'assorbimento co-localizzato, quindi è spesso necessario esaminare altre cellule. I saggi di legame con i ligandi GFP possono essere complicati da dimeri o aggregati di ordine superiore della proteina GFP, in particolare se si trovano in micelle detergenti. Nel complesso, l'espressione di proteine marcate con GFP può facilitare un'ampia varietà di esperimenti per confermare l'identità di una proteina precedentemente sconosciuta.