Name: Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri come utilizzare un costrutto GFP-tagged di TMEM184A per confermare la sua identità come recettore dell'eparina nelle cellule vascolari. Questo metodo facilita l'identificazione funzionale di geni orfani.

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La ricerca nel laboratorio Lowe-Krentz è supportata da sovvenzioni di ricerca HL54269 dal National Institutes of Health a LLK.

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<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli qui riportati sono stati progettati per fornire la prova di conferma per l&#39;identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari 1. tecniche Knockdown sono abitualmente utilizzati come uno meccanismo per confermare l&#39;identificazione di nuove proteine. Tuttavia, qualche perdita funzionale dopo atterramento non è tipicamente una prova sufficiente che una proteina candidato è effettivamente il recettore corretta (o altra proteina funzionale). E &#39;anche impor...

L&#39;identificazione di proteine ​​candidate per le funzioni nuove, spesso dipende da protocolli di isolamento di affinità basata seguita da determinazione sequenza parziale. Esempi recenti di nuove proteine identificate sono proteine transmembrana 184A (TMEM184A), un recettore eparina identificato dopo interazioni eparina affinità 1, e TgPH1, una proteina dominio pleckstrin omologia che lega phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Altro novel identificazione delle proteine attraverso analisi di sequenza diretta dei peptidi come quello di Vit, et al. che ha usato peptidi transmembrana per identificare i prodotti proteici da geni precedentemente non caratterizzate 3. Allo stesso modo, l&#39;identificazione di nuove sequenze di proteine può essere realizzato utilizzando la bioinformatica alla ricerca di famiglie di proteine precedentemente caratterizzati come l&#39;identificazione di nuove proteine 4TM 4. L&#39;esame delle sequenze di geni della famiglia aquaporin ha alcosì ceduto l&#39;identificazione di nuovi membri caratterizzati da nuove funzioni 5. Dopo l&#39;identificazione, l&#39;analisi della funzione della proteina è tipicamente un passo successivo, che a volte può essere esaminato utilizzando un dosaggio specifico della funzione proteica come nel caso aquaporin. Quando possibile, la funzione di una proteina di recente identificazione può essere esaminato con particolare enzimatici o simili saggi funzionali in vitro. Poiché molte funzioni delle nuove proteine dipendono complesse interazioni che si verificano solo in cellule intatte o organismi, in vitro non sono sempre efficaci. Tuttavia, i saggi in vivo devono essere progettati in modo tale che essi dipendono dalla sequenza del gene. In coltura cellulare, e / o organismi modello semplici, atterramento in grado di fornire elementi di prova per l&#39;identificazione delle proteine / funzione 6. Con nuove proteine ​​identificate come notato sopra, è spesso insufficiente a battere semplicemente verso il basso una proteina per confermare la funzione, und progettazione di saggi in vivo funzionali che dipendono sequenza genetica diventa importante per la caratterizzazione di nuove proteine. La recente individuazione di TMEM184A come recettore eparina (che modula la proliferazione in muscolatura liscia vascolare e le risposte infiammatorie nelle cellule endoteliali) mediante cromatografia di affinità e MALDI MS 1, 7 fornito l&#39;opportunità di sviluppare una collezione di saggi dopo atterramento prodotto risultati coerenti con l&#39;identificazione . Una recente revisione ha confermato che l&#39;eparina interagisce specificamente con molti fattori di crescita, i loro recettori, i componenti della matrice extracellulare, recettori di adesione cellulare, e altre proteine 8. Nel sistema vascolare, eparina e proteoglicani eparan solfato (contenente catene eparan solfato di struttura simile a eparina) interagire con diverse centinaia di proteine 9. Per confermare funzionalmente that TMEM184A è stato coinvolto con l&#39;eparina assorbimento e vincolante, sono state sviluppate tecniche che hanno impiegato il costrutto gene per TMEM184A. La presente relazione comprende una raccolta di saggi sulla base di un GFP-TMEM184A costrutto per l&#39;uso nel confermare l&#39;identità di TMEM184A come recettore eparina.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A costrutto</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina-Eparina</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente-Eparina</td> sensibile alla luce <td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore sensibile alla</td> luce <td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA, senza metanolo)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, disponibile tramite Fisher Scientific</td><td>PI28908 presso Fisher</td><td>Uso in cappe chimiche</td></tr><tr><td>Piastre per neutravidina con legame reactico (piastre nere a 96 pozzetti rivestite con Avidin)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, tramite Fisher Scientific</td><td>PI15510 presso Fisher</td><td>Prestare attenzione alla durata di conservazione</td></tr><tr><td>Piastre nere a 96 pozzetti</td><td>Corning Life Sciences Plastic, acquistate tramite Fisher Scientific</td><td>064432 presso Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 cellula muscolare liscia vascolare linea</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Può essere sostituito in MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC cellule endoteliali aortiche bovine</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>La coltura B304-05</td><td>come raccomandato inizialmente, può essere sostituita in terreno MEM per la coltura continua1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC cellule muscolari lisce dell'aorta bovina</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>La coltura B354-05</td><td>come raccomandato inizialmente, può essere sostituita in terreno MEM per continuare la coltura1</td></tr><tr><td>RAOEC cellule endoteliali aortiche di ratto</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>La coltura R304-05a</td><td>, come raccomandato inizialmente, può essere sostituita in terreno MEM per la coltura continua7</td></tr><tr><td>Biotinilate anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, attraverso Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Perle rivestite di streptavidina</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Disponibile da Bio-Rad</td><td></td><td>Può essere preparato in laboratorio. Il pH è 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorpo contro l'N-terminale</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006 Solo</td><td>noto TMEM184A anticorpo alla regione N-terminale.</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorpo contro il C-terminale</td><td>Ottenuto da ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci utilizzato in anticorpi Figura 1</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotechnology sc9996</td><td>Utilizzato in Figura 5</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari, marcati con TRITC o Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (asino anti-coniglio, TRITC) 715 165 150 (asino anti-topo, Cy3)</td><td>Reattività crociata minima per ridurre al minimo qualsiasi colorazione aspecifica.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Acquistato da Sigma</td><td>C5849</td><td>Si noti che questo numero di catalogo specifico è stato interrotto. Il Fornitore fornirà informazioni in merito alla sostituzione.</td></tr><tr><td>Imaging dal vivo Piastre da 35 mm</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 - 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta con lente a immersione in olio 63X</td><td>Utilizzato per immagini e immagini dal vivo in Figure 1, 2 e 3</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>C2+ con lente a immersione in olio 60X</td><td>Utilizzato per immagini in Figura 5</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>LSM 880 con lente a immersione in olio 63X</td><td>Utilizzato per immagini in Figura 2C</td></tr><tr><td>Apparecchiature per elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Disponibile da MidSci</td><td>EC2L</td><td>Può essere ottenuto anche dal fornitore di apparecchiature</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro lettore</td><td>di piastre Letture al centro dei pozzetti piuttosto che in superficie.</td></tr><tr><td>Programma per computer per la misurazione dell'intensità di colorazione</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programma e informazioni disponibili on-line</td><td>Qualsiasi programma appropriato può essere utilizzato. Vedi https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html per ulteriori dettagli&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina per colture cellulari</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>acquistata come soluzione 10x</td></tr></tbody></table>

utilizzando un tmem184a gfp-tagged construct per la conferma della eparina receptor identità

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Quando nuove proteine ​​vengono identificati attraverso l&#39;isolamento e la bioinformatica market basket analysis-based, sono spesso in gran parte indefinita. Gli anticorpi contro peptidi specifici all&#39;interno della sequenza prevista consentono alcuni esperimenti di localizzazione. Tuttavia, spesso non possono essere escluse altre interazioni possibili con gli anticorpi. Questa situazione ha offerto l&#39;opportunità di sviluppare una serie di saggi dipendenti dalla sequenza della proteina. In particolare, un costrutto contenente la sequenza genica accoppiato alla sequenza codificante GFP all&#39;estremità C-terminale della proteina è stata ottenuta e utilizzata per questi scopi. Gli esperimenti per caratterizzare la localizzazione, ligando di affinità, e guadagno di funzione sono stati originariamente progettati e realizzati per confermare l&#39;identificazione di TMEM184A come recettore eparina 1. Inoltre, il costrutto può essere impiegato per studi che riguardano domande topologia di membrana e le interazioni proteina-ligando dettagliate. La presente relazione presenta arange di protocolli sperimentali basati sul costrutto GFP-TMEM184A espresso in cellule vascolari che potrebbe essere facilmente adattato per altre nuove proteine.

Mentre, in teoria, trasfezione di DNA qualsiasi costrutto in cellule potrebbe essere realizzato con i reagenti di trasfezione lipofili, relazioni precedenti indicano più efficace trasfezione di GFP costrutti in cellule endoteliali mediante elettroporazione 12. Il protocollo fornito qui realizzato tipicamente GFP-costrutto di espressione in più del 80% delle cellule endoteliali primarie derivate e cellule muscolari lisce utilizzati. Progettazione del costrutto impi...

Un TMEM184A codifica costrutto con un tag GFP al carbossi-terminale progettato per l&#39;espressione eucariotica, è stato impiegato in saggi progettati per confermare l&#39;identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari.

Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

L'obiettivo generale dell'utilizzo di un costrutto marcato con GFP è confermare l'identità di una proteina precedentemente sconosciuta utilizzando la GFP come handle. Questo metodo può aiutare con l'identificazione funzionale dei geni orfani quando una specifica attività enzimatica non è disponibile per la conferma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tag GPF consente di utilizzare lo stesso costrutto per diversi tipi di esperimenti.In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo possono avere problemi, perché la trasfezione non sempre porta all'espressione del costrutto forte e le cellule non sempre si rianimano. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta, quando abbiamo iniziato a riconoscere le difficoltà di identificare una proteina utilizzando solo gli anticorpi creati contro di essa. Iniziare risospendendo le cellule di interesse in un millilitro di tampone di elettroporazione salina tamponato con HEPES e posizionare immediatamente le cellule sul ghiaccio.Aggiungere alle cellule un volume sufficiente di plasma marcato con GFP-TMEM184A per ottenere una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro di DNA e trasferire circa 0,4 mi

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Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

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