La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell'orecchio medio e l'analisi istologica

L'obiettivo generale della procedura di dissezione è isolare la bolla uditiva e la capsula, seguite dai singoli ossicini uditivi da topi postnatali per varie analisi istologiche e a montatura intera. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare questioni chiave nel campo della biologia delle ferite, come i meccanismi di scarsa morfogenesi, ossificazione endocondrale o scarso metabolismo dei minerali. Questo metodo si basa su una conoscenza approfondita dei dettagli anatomici.

In generale, gli individui che non conoscono il topo come sistema biologico possono avere difficoltà, perché la loro conoscenza dell'orecchio medio umano potrebbe non essere applicabile alla controparte del topo. A dimostrare la procedura sarà Ayako Sakamoto, un tecnico del mio laboratorio. Iniziare posizionando la bolla uditiva e la capsula con l'osso cranico circostante in un piatto per campioni contenente soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4 a temperatura ambiente.

Sotto un microscopio binoculare da dissezione, identificare le ossa del cranio che circondano la capsula uditiva come mostrato qui. Usa una serie di pinze per afferrare il cranio circostante e una seconda serie per estrarre il basisfenoideo e l'osso occipitale. Quindi utilizzare la pinza per estrarre delicatamente le ossa interparietali e parietali dalla capsula e rimuoverle quando sono completamente allentate.

Quindi, estrarre lo squamoso dalla bulla e dalla capsula e stuzzicare delicatamente l'osso e i tessuti molli. Quindi, afferrare l'orecchio esterno e capovolgere il campione per rivelare il lato mediale. Quindi, ruotare il campione di 180 gradi, afferrare la capsula e tirare via i tessuti molli rimanenti.

La cresta dorsale è ora visibile. A questo angolo, i nervi facciale e vestibolo-cocleare nel canale uditivo interno, nella fossa subarcuata e nel canale semicircolare anteriore sono chiaramente visibili. Quando la cresta dorsale è angolata verso il fondo del piatto di dissezione, la bolla uditiva è chiaramente visibile.

Se la preparazione è leggermente angolata, il martello è visibile all'interno della bolla. Inizia usando una pinza per fratturare il canale uditivo esterno sopra il martello e lateralmente al solco timpanico. Create una seconda facture anteriore alla prima.

Quindi rimuovere il pezzo di canale uditivo esterno in modo che la membrana timpanica sia visibile. Successivamente, rimuovere parte della membrana timpanica e l'osso timpanico vicino al processo breve malleale sia alle pareti ventrali che posteriori. Il martello, l'incudine, la staffa e il tensore del timpano dovrebbero ora essere esposti.

Sollevare il martello e tagliare il muscolo tensore del timpano con il bordo smussato di un ago calibro 27. Si noti che il manubrio malleale si attacca saldamente alla membrana timpanica, come si vede in altri mammiferi. Dislocare il martello dall'incudine all'articolazione ossiculare fratturando il processo anteriore del martello al goniale.

Isolare il martello dalla bolla uditiva usando una pinza. Rimuovere la maggior parte della bolla uditiva per esporre l'incudine e la staffa. Quindi utilizzare il bordo smussato di un ago calibro 27 per tagliare il legamento posteriore dell'incudine in corrispondenza della cresta corta.

Isolare l'incudine usando una pinza. Tagliare l'arteria stapediale vicino alla staffa con il bordo smussato di un ago calibro 27. Ruotare il campione in modo che la finestra rotonda sia posizionata nella parte inferiore.

Quindi inserire un ago da cucito nel forame otturatore della staffa e sollevare la staffa. Dopo aver rimosso la staffa, l'apertura ovale della finestra dovrebbe essere chiaramente visibile. Usa l'ago calibro 27 per spingere la staffa fuori dall'ago da cucito.

Per iniziare l'inclusione dei tessuti, utilizzare prima le forbici per interrompere il processo stiliforme all'estremità anteriore della bolla. Il martello e la cresta dorsale sono visibili attraverso la parte tagliata. Immergere la bulla e la capsula in 1-2% di paraformaldeide in PBS.

Se l'aria è intrappolata nella bolla, rimuoverla con un ago e una siringa. Lasciare la bulla e la capsula nel fissativo a quattro gradi Celsius per una notte su un rotatore di tubi. Il giorno successivo, lavare rapidamente la bulla e la capsula in PBS.

Quindi immergere immediatamente in un composto liquido crio-incorporante a quattro gradi Celsius. È comune che si formino bolle d'aria nel composto crio-incorporante a livello dell'orecchio medio ed esterno. Rimuovere la bolla d'aria dall'orecchio medio attraverso l'aspirazione con un ago.

Usa la stessa tecnica per la bolla d'aria nell'orecchio esterno. Una volta rimosse tutte le bolle d'aria, orientare il tessuto in base al tipo di sezioni che si vogliono ottenere. Il tessuto può quindi essere incorporato in blocchi congelati prima del sezionamento.

Questa immagine mostra la colorazione H ed E di una sezione longitudinale di paraffina di martello decalcificato, indicata dalla lettera M, e la bolla uditiva e la capsula di un topo P14. La membrana timpanica è indicata dalla lettera TM. Questa immagine mostra l'etichettatura dell'osso di calcio di una sezione longitudinale di martello congelato non decalcificato, indicata dalla lettera M, e la bolla uditiva di un topo P21. I segnali del verde calcio rivelano la formazione di nuovo osso nel martello, nella bolla e nella capsula.

Una volta padroneggiata la tecnica, la bolla uditiva e la capsula possono essere isolate in dieci minuti se la procedura viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione degli orientamenti anatomici degli ossicini uditivi e della bulla nel topo, che è stato descritto nel testo principale.