Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

Gli obiettivi generali di questo metodo sono la caratterizzazione e lo studio di popolazioni di microvescicole derivate dalla membrana plasmatica nel sangue periferico. Le microvescicole di pazienti affetti da tumore, sono dosaggi proinvasivi e funzionali. Pertanto, un'ulteriore caratterizzazione fornirà informazioni su come queste vescicole contribuiscano effettivamente all'invasione e alla metastasi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'analisi relativamente rapida delle microvescicole nel sangue, senza la necessità di materiali e attrezzature sofisticate o costose. Dopo aver ottenuto una o due provette di sangue da un volontario in provette di raccolta contenenti EDTA, capovolgere le provette più volte per garantire un'efficace anticoagulazione del sangue. Entro mezz'ora dal prelievo di sangue, centrifugare i campioni e aggiungere un filtro valvolare alle provette per aiutare a separare il plasma dal sangue rimanente.

Trasferire il plasma in una provetta da 15 millilitri per una seconda centrifugazione. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungi PBS se necessario.

Centrifugare il plasma contenente surnatante diluito in PBS se necessario per raccogliere le microvescicole. Quindi decantare il surnatante e posizionare i tubi capovolti su un tovagliolo di carta per tre-cinque minuti. Quando tutto il surnatante rimanente si è impregnato nell'asciugamano, rimuovere il plasma rimanente dal bordo dei tubi e risospendere il pellet di microvescicola in un millilitro di PBS.

Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Quindi, dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 50-500 microlitri di PBS, a seconda delle dimensioni del pellet. Quindi determinare la concentrazione proteica delle microvescicole con un saggio proteico.

Per caratterizzare le microvescicole mediante citometria a flusso, trasferire 15 microlitri di PBS, integrati con FCS impoverito all'1% di vescicola in una provetta per citometria a flusso, seguiti da tre a cinque microgrammi di microvescicole sospese in PBS. Incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame aspecifico sulla superficie della microvescicola. Quindi aggiungere l'anticorpo di interesse marcato con fluorescenza per un'incubazione a temperatura ambiente di 20 minuti al buio.

Successivamente, diluire il campione in 250 microlitri di PBS fresco e caricare le microvescicole sul citometro a flusso. Ridurre la soglia del citometro a flusso al valore più basso possibile e cercare la popolazione di microvescicole utilizzando un grafico di dispersione in avanti rispetto a quello laterale in scala logoritmica. Quindi creare un cancello attorno alla popolazione di microvescicole e valutare il segnale fluorescente in un istogramma corrispondente.

La resa di microvescicole da campioni di sangue di donatori può essere valutata nel saggio delle proteine di Lowry con rese tipiche comprese tra 10 e 30 microgrammi di vescicola per milliletro di sangue e una concentrazione di particelle che varia da 1,66 volte 10 al 9°, a 2,36 volte 10 al 10°, come determinato dall'analisi di tracciamento interparticellare. Un'ulteriore caratterizzazione delle microvescicole mediante microscopia elettronica a trasmissione rivela una popolazione di vescicole con un diametro superiore a 100 nanometri circondate da un doppio strato lipidico che non contiene organelli cellulari. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle conferma inoltre che la dimensione media delle microvescicole isolate varia da 100 a 600 nanometri con una media di 201 nanometri.

La colorazione per i tipici marcatori di microvescicole ed esosomi mediante western blotting dimostra che le microvescicole isolate nel sangue sono tipicamente positive per il tubulante, con una debole espressione di CD9 e CD81, mentre gli esosomi sono generalmente negativi per il tubulante e sono arricchiti con gli altri due marcatori. La citometria a flusso rivela una popolazione definita di vescicole derivate da donatori che possono essere controllate utilizzando gli stessi parametri utilizzati per le microvescicole isolate con surnatante di coltura cellulare. Questo è anche chiaramente diverso dal segnale di fondo osservato per il PBS controllato, integrato con campioni di FCS impoveriti all'1%.

La colorazione delle microvescicole con marcatori stabiliti per diverse popolazioni di cellule del sangue rivela che la percentuale di sottopopolazioni di microvescicole differisce tra i campioni di sangue dei donatori di sangue, con la maggior parte delle microvescicole che sembrano essere state rilasciate dalle piastrine in tutti i campioni. Una volta padroneggiato, l'isolamento delle microvescicole e la loro successiva caratterizzazione mediante citometria a flusso possono essere eseguiti in circa 2-1/2 ore. La caratterizzazione delle sottopopolazioni di microvescicole aiuterà a identificare una firma tumorale nei pazienti rispetto ai controlli.

Questo può essere utile come biomarcatore per la diagnostica e la terapia di contrasto.