Name: Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Impara a isolare e caratterizzare microvescicole da sangue periferico usando citometria a flusso e Western Blotting. Questo metodo permette di analizzare rapidamente le popolazioni di vescicole per studiare biomarcatori tumorali.

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Gli autori ringraziano Meike Schaffrinski per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo le seguenti persone per il loro aiuto nella raccolta di campioni di sangue periferico (tutti provenienti dal Centro Medico Universitario di Gottinga): Henrietta Vida (Dipartimento di Medicina Trasfusionale), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dipartimento di Chirurgia Generale, Viscerale e Pediatrica), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dipartimento di Neurochirurgia), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dipartimento di Otorinolaringoiatria, Chirurgia della testa e del collo) e tutti i dipendenti dell'oncologia interdisciplinare a breve termine. Ringraziamo Dirk Wenzel (Istituto Max Planck per la Chimica Biofisica, Gottinga) per il suo aiuto nella microscopia elettronica delle MV. 
Lo studio è stato finanziato dal progetto MetastaSys del Ministero tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) (sovvenzione n. 0316173) e dal German Cancer Aid (sovvenzione n. 109615).

Tutti gli esperimenti, tra cui soggetti umani sono stati approvati dal comitato etico locale (approvazione n. 3/2/14). Per la scelta dei pazienti si deve notare che diversi fattori quali l&#39;età, il sesso, regimi terapeutici attuali e molti altri possono influenzare la composizione MV nel sangue e quindi devono essere presi in considerazione prima del prelievo 22,23. 1. Preparazione dei campioni di plasma <ol><li> Pareggio 1 - 2 provette di sangue per donatore attraverso una 21-gauge farfalla ago in un tubo di raccolta del sangue Vacutainer contenente EDTA (1,6 mg / ml di sangue). Assicurati di invertire i tubi (s) più volte per garantire efficiente anticoagulante del sangue. NOTA: Il volume consigliato di sangue per la successiva citometria a flusso e Western Blot è di 5 - 15 ml. Al fine di prevenire il degrado e la perdita di MV, i campioni di sangue devono essere trattati &lt;30 min dopo il ritiro del sangue. </li><li> Preparare campioni di plasma mediante centrifugazione dei campioni per 15 min a 1200 xgatemperatura ambiente (RT). </li><li> Applicare un filtro della valvola al fine di aiutare la separazione del plasma (= strato superiore) rimanga cellule del sangue (= strato inferiore). </li><li> Trasferire il plasma in un tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1500 xg, RT a pellet più grande detriti cellulari e rimuovere le piastrine rimanenti. </li><li> Trasferire il surnatante in un tubo da 15 ml e procedere direttamente con i campioni di isolamento o conservare MV per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. NOTA: Il protocollo presentato può anche essere utilizzata per isolare MV (e Exos) da supernatanti di coltura cellulare. Per fare ciò, coltivare cellule a 60 - 80% di confluenza per 24 - 48 ore in terreno di coltura addizionato con vescicole impoverito FCS e raccogliere il surnatante. Centrifugare per 5 minuti a 750 xg, a 4 ° C per eliminare le cellule residue galleggianti, riempire il surnatante in una nuova provetta 15 mL e centrifugare ancora per 5 min a 1500 xg, a 4 ° C per sedimentare grande detriti cellulari. Questo supernatante può quindi essere utilizzato per l&#39;isolamento di MVcome descritto al punto 2,1-2,16. </li></ol> 2. Isolamento di MV <ol><li> Trasferire il campione di plasma in un tubo di centrifugazione adatto. Se necessario, riempire tubo con PBS per diluire il campione e prevenire il collasso dei tubi a parete sottile durante la procedura di centrifugazione. </li><li> Centrifugare per 35 minuti a 14000 g, 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante, mantengono tubi girato a testa in giù e mettere su un tovagliolo di carta. Attendere 3-5 minuti fino a quando tutti restante surnatante è stato immerso in un asciugamano e quindi rimosso dal campione. </li><li> Risospendere il pellet MV in 1,000 ml PBS, trasferire in una provetta da centrifuga e 1,5 ml per 35 min a 14.000 xg, a 4 ° C in una centrifuga da tavolo. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet MV nel 50 - 500 microlitri di PBS, a seconda delle dimensioni del pellet. In alternativa, lisare MV direttamente, ad esempio, in RIPA tampone (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-desossicolato / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)per successiva analisi Western Blot. MV conservare a -20 ° C. Essi rimarranno stabili per diversi mesi, ma evitare ripetuti di congelamento e scongelamento cicli. </li><li> Opzionale: Determinare la concentrazione di proteine MV, con tenore di proteine (per esempio, Bradford o il metodo di Lowry) al fine di valutare le rese MT o dosare MV per successivi esperimenti. </li><li> Se Exos supplementari devono essere isolati dai campioni di plasma, decantare il surnatante dal punto 2.3 in una provetta ultracentrifugazione e centrifugare per 2 ore a 110.000 xg, 4 ° C. Decantare il surnatante come descritto al punto 2.3, risospendere Exo pellet in 1.000 ml di PBS e trasferire in piccole (1,5 ml) tubi ultracentrifugazione. <ol><li> Ultracentrifuga per 2 ore a 110.000 xg, 4 ° C, aspirare il surnatante e risospendere pellet in Exo 50 - 75 microlitri di PBS o tampone RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione di MV mediante citometria di flusso <ol><li> Trasferimento 15 microlitri di PBS + 1% vescicole-impoverito vitello siero fetale (FCS) in un tubo di citometria di flusso. NOTA: vescicole-impoverito FCS viene preparato mediante centrifugazione inattivato al calore (30 min a 56 ° C) FCS per 18 ore a 110.000 xg e filtrante il surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron come descritto in precedenza 24. </li><li> Aggiungere 5 mg (in caso di basse rese 3 mg sono applicabili anche) di MV in PBS. </li><li> Incubare campioni per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifici sulla superficie MV e quindi ridurre la colorazione di fondo. </li><li> Aggiungere un anticorpo fluorescente contro l&#39;interesse della proteina-di-. Titolare la quantità di anticorpo utilizzato per la colorazione prima dell&#39;uso per determinare la concentrazione ottimale e garantire un basso razione segnale-rumore. Assicurati di includere anche un tubo con MV non colorati come controllo negativo e un tubo di MV colorate con l&#39;anticorpo di controllo isotipo corrispondente alla stessa concentrazione (per esempio, se si usa 1 mg di anticorpo, utilizzare anche 1 mg di un controllo isotipicotibody) per quantificare la colorazione di fondo. NOTA: È anche possibile eseguire il flusso multicolore citometria aggiungendo più anticorpi accoppiati a diversi fluorocromi. </li><li> Incubare per 20 minuti a RT al buio. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di PBS e procedere con la misurazione del campione usando un citometro a flusso. <ol><li> Nel caso in cui i campioni non possono essere misurati immediatamente, aggiungere 150 microlitri di PBS e 50 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) per fissare campioni e conservare a 4 ° C. ATTENZIONE: PFA è tossico. Utilizzare guanti e idonei dispositivi di protezione individuale. </li></ol></li><li> Ridurre la soglia del citofluorimetro al valore più basso possibile e cercare la popolazione MV utilizzando un forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC) trama in scala logaritmica. Porta sulla popolazione MV e valutare il segnale fluorescente in un corrispondente istogramma. </li></ol> 4. Caratterizzazione di MV mediante western blotting <ol><li> Risospendere il pellet MV direttamenteun tampone di lisi adatto (per esempio, RIPA buffer). <ol><li> Nel caso il pellet MV è già stato risospeso in PBS, diluirlo almeno 1: 1 in un tampone di lisi adatto (per esempio, tampone RIPA). </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di proteine del campione MV, ad esempio, mediante saggio Lowry. </li><li> Preparare 10-20 mg di MV in 22,5 microlitri di buffer RIPA. Quindi aggiungere 7,5 microlitri di 4x Laemmli buffer di carico e di calore per 5 minuti a 95 ° C. </li><li> Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide ed eseguire elettroforesi e immunoblotting secondo protocolli standard. </li><li> Dopo il trasferimento delle proteine ​​sulla membrana, eseguire una colorazione Ponceau come controllo di caricamento secondo protocolli standard. </li><li> Membrana Decolorare in TBST per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Block membrana per 30 minuti fino a 1 ora a RT in 5% BSA in TBST. </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo primario a 4 ° C durante la notte o per 2 ore a RT. </li><li> Lavare la membrana con TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo secondario HRP-accoppiata ad una diluizione di 1: 10.000 in 5% BSA. Nota: In caso di alte segnali di fondo, utilizzare il latte in polvere al posto di BSA. </li><li> Lavare la membrana con TBST 3x 5 min. </li><li> Sviluppare membrana con un reagente di rilevamento ECL e rilevare segnali su film chemiluminescenza o un sistema di imaging chemiluminescenza. NOTA: Al fine di discriminare MV da Exos, proteine come tubulina, actinina-4 o mitofilin può essere utilizzato quale devono essere presenti principalmente sulla MV 16,25. Fare attenzione che gli anticorpi più tetraspanine (ad esempio, CD9, CD81), utilizzati come marcatori per Exos, non funzionano in condizioni riducenti e devono quindi essere preparati in tampone non riducente di carico seguita da riscaldamento per 10 minuti a 70 ° C. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Recenti studi su EVs nel sangue hanno dimostrato che la composizione e conta EV cambiano durante la causa di numerose malattie. Pertanto, l&#39;analisi e l&#39;ulteriore caratterizzazione di questi veicoli elettrici sono di grande interesse per valutare ulteriormente il loro potenziale utilizzo come biomarcatori di malattia per la diagnosi e la prognosi o per valutare le risposte di terapia. Il protocollo qui presentiamo permette l&#39;isolamento di vescicole con un diametro fino a 600 nm, che non contengono organelli cellulari. Queste osservazioni sono in linea con l&#39;attuale definizione di MV ed escludono la presenza di corpi apoptotici 2. Utilizzando Western Blotting, siamo stati in grado di dimostrare che le MV isolate mostrano una elevata espressione di tubulina, mentre i tetraspanine CD9 e CD81 che vengono spesso utilizzati come marcatori Exo sono stati solo leggermente espressi. Ciò conferma che gli MV differiscono da Exos e si adatta alla recente caratterizzazione approfondita e il confronto di entrambe le popolazioni eV di proteomica 25. content &quot;&gt; Durante acquisizione di campioni di sangue, è fondamentale per mantenere il tempo tra l&#39;iniezione in vena e preparazione plasma più breve possibile per evitare la degradazione MV. Inoltre, conservazione prolungata dei campioni di sangue potrebbe portare all&#39;attivazione di cellule del sangue causando maggiore MV spargimento e infine apoptosi che provoca il rilascio di corpi apoptotici. Un&#39;altra considerazione importante per isolamento MV è di evitare contaminazioni di preparati MT con le proteine ​​plasmatiche o Exos piccoli. Pertanto, è fondamentale per rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile dopo la filatura giù le MV a 14.000 x g. Poiché il pellet è normalmente visibile e saldamente fissato alla parete del tubo, il supernatante può essere facilmente rimosso con una pipetta. In contrasto Exos che tendono a formare aggregati durante la preparazione per ultracentrifugazione alta velocità e sono spesso difficili da riportare in sospensione, questo problema non si verifica con MV. Il nostro studio dimostra che è possible per caratterizzare le sottopopolazioni MV presenti nel sangue mediante citometria di flusso. Anche se il limite di rilevamento della maggior parte dei citometri a flusso è di circa 200-300 nm, MV sono stati misurati in modo riproducibile donatore così come campioni di colture cellulari con gli stessi parametri di analisi e delle porte che permettevano chiaramente la loro distinzione da segnali di fondo. È importante verificare prima delle misurazioni che il PBS utilizzata per le analisi non contiene particelle contaminanti che potrebbero causare un fondo elevato durante citometria di flusso (figura 3). Anche se alcuni MV più piccoli non potrebbero essere catturati in un approccio citometria a flusso, abbiamo rilevato MV da tutte le principali popolazioni di cellule del sangue (ad esempio, piastrine, globuli rossi, leucociti, cellule endoteliali). Nella nostra analisi abbiamo utilizzato gli indicatori standard, per le diverse cellule del sangue che sono stati precedentemente riportati sulla MV 26 - 29. Va notato che, al fine di ottenere i migliori risultati possibili per citometria a flusso, tlui di concentrazione di tutti gli anticorpi deve essere titolato su un campione MV che esprimono l&#39;antigene di interesse. Se specifiche sottopopolazioni MV nel sangue sono identificati con maggiore specificità, è possibile effettuare doppia colorazione contro due antigeni differenti presenti sulle rispettive MV e non solo tutti gli MV doppio positive per la successiva analisi 23. Attualmente, ci sono gli sforzi per definire una gamma standard di sottopopolazioni MV nel sangue di individui sani 23,30. Questi studi hanno già dimostrato che gli MV di derivazione piastrinica costituiscono la più grande popolazione di MV nel sangue, che è in corrispondenza con le nostre osservazioni. Uno dei vantaggi di citometria a flusso per caratterizzare campioni MV è che questo metodo è già ben stabilito a scopo diagnostico nella maggior parte dei centri clinici che permettano l&#39;eventuale uso di MV come biomarcatori nella diagnostica clinica di tutti i giorni. Precedenti studi sui veicoli elettrici nel sangue che hanno per lo più attenzioneEd il Exos più piccoli, si basano sia su procedure di selezione specifici per analizzare in modo selettivo l&#39;Exo popolazione target desiderato 31,32 o richiedono un (2 giorni) processo di isolamento in termini di tempo con accoppiamento di Exos al lattice perle prima dell&#39;analisi 18. Le nostre osservazioni non pubblicate suggeriscono che l&#39;analisi di citometria di flusso della MV da preparazioni di sangue intero consente anche l&#39;individuazione di MV come MV tumore-derivato senza tali processi di selezione. Nel loro insieme, il protocollo presentato qui permette l&#39;isolamento veloce di MV da campioni di sangue periferico con apparecchiature di laboratorio di serie e la loro successiva caratterizzazione mediante citometria a flusso e Western Blotting. L&#39;intero processo può essere eseguito in circa 2 ore, che faciliterà gli studi futuri sui profili MV nel sangue dei pazienti che sono necessari per valutare il potenziale di MV come biomarcatori di malattia.

Negli ultimi anni molti studi in vitro hanno dimostrato che le vescicole extracellulari (EV) svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare. Le cellule viventi capannone costantemente vescicole che si differenziano per dimensioni, contenuti e biogenesi. I veicoli elettrici più studiati sono esosomi che hanno origine dal sistema endosomal dove vengono memorizzati come vescicole endoluminali nei corpi multivesicular. Una volta che questi ultimi si fondono con la membrana plasmatica, le vescicole contenuti sono rilasciati come esosomi (Exos, diametro 30-100 nm 1). Una seconda popolazione di EV, che ha guadagnato crescente attenzione negli ultimi anni sono grandi microvescicole (MVS, diametro 100 - 1.000 nm) che germogliano fuori direttamente dalla membrana plasmatica 2. Entrambi i tipi di vescicole sono circondati da un doppio strato lipidico e contengono acidi nucleici, ad esempio, DNA, mRNA o miRNA 3 - 5, e una pletora di proteine che possono trasferire alla vicina cells. Mentre in generale la composizione proteica delle vescicole riflette lo stato della cella di origine, alcune proteine sembrano essere selettivamente mirati e arricchito su EVs 1. Uno dei principali interessi di ricerca è quello di caratterizzare i veicoli elettrici dalle cellule anormali e malate al fine di definire le firme EV specifici che potrebbero consentire l&#39;uso di veicoli elettrici come nuovi biomarcatori. Soprattutto nel cancro, in cui spesso il tumore stesso non è facilmente accessibile, biopsie liquidi destinati EVs tumore-specifici nel sangue potrebbero consentire il monitoraggio delle risposte terapeutiche o aiutare caratterizzare il tumore primario senza la necessità di procedure invasive 6. Infatti, i veicoli elettrici sono già stati isolati con successo da vari fluidi corporei, tra cui l&#39;urina 7, 8 CSF, il latte materno 9 o del sangue 10. Diversi studi identificati cambiamenti nella conta EV e la composizione di diverse malattie umane. Per esempio, in pazienti con sepsi numero di MV pro-coagulanti èsignificativamente aumentata rispetto ai soggetti sani 11. Anche in pazienti con grave malaria cerebrale un aumento della MV totale nel sangue può essere osservato e conti di MV di derivazione piastrinica correlano con la profondità coma e trombocitopenia 12. Altri studi riportano numeri elevati di vescicole endotelio-derivati in pazienti con lupus eritematoso sistemico o insufficienza cardiaca e, nel caso di quest&#39;ultima, questo correla con una maggiore probabilità di eventi cardiovascolari 13,14. In particolare nel cancro, i veicoli elettrici nel sangue sono attualmente discussi come nuovi biomarcatori con valore diagnostico e prognostico. I livelli di MV che esprimono proteine associati al tumore, come MUC1, EGFR o FAK sembrano essere elevati nel sangue di pazienti affetti da cancro al seno 15,16. Anche per Exos, recenti studi hanno dimostrato che Exos derivati ​​dal sangue che portano antigeni tumore-specifici, come Glypican-1 per il cancro del pancreas o Del-1 per il cancro al seno permette precoce della malattia deprotezione con elevata specificità e sensibilità 17,18. Inoltre, tumore siero derivato Exos può contenere DNA che può essere utilizzato per il rilevamento di mutazioni come KRAS e p53 che suggerisce il loro uso per la terapia previsione 19. I recenti progressi hanno dimostrato che l&#39;analisi di Exos nel sangue di pazienti con glioblastoma utilizzando uno specifico chip microfluidico consente il monitoraggio della terapia 20. Presi insieme, questi risultati implicano che l&#39;analisi di sottopopolazioni specifiche per la malattia di vescicole fornisce preziose informazioni circa diagnosi, prognosi così come le opzioni terapeutiche e il successo. Tuttavia, l&#39;isolamento e l&#39;analisi di Exos dal sangue è tempo, richiede attrezzature speciali laboratorio e quindi non è ancora adatto per diagnostica clinica di routine. Al contrario, gli MV possono essere isolati molto più veloce e, a causa della loro dimensione più grande, può essere facilmente analizzati mediante citometria di flusso senza la necessità di loro Coppia di perle di lattice, come è necessario per Exos 18, 21. Così, qui vi presentiamo un protocollo che può essere utilizzato per l&#39;isolamento standardizzato di MV da campioni di sangue e la successiva caratterizzazione di sottopopolazioni MV mediante citometria di flusso. Questo protocollo consente l&#39;ulteriore studio e in profondità caratterizzazione dei profili MV in grandi gruppi di pazienti che saranno richiesti per utilizzare gli MV per diagnostica clinica quotidiana.

<table><tbody><tr><td>ago a farfalla (calibro 21)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina Frazione V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>Per 10x TBS pesare 24,2 g di Tris base e 80 g di NaCl, ad 1 L H2O e regolare il pH a 7,6</td></tr><tr><td colspan="4">Per 1x TBS-T miscelare 100 mL 10x TBS con 900 mL di H2O e aggiungere 1 mL di Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>utilizzare 5 &micro; l per colorazione</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>uso 5 &micro; l per la colorazione</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>uso 0,8 &micro; g per colorazione</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>utilizzare 0,1 &micro; g per la colorazione</td></tr><tr><td>dell'anticorpo CD81</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2.000 in 5% BSA in TBS-T; utilizzare condizioni non riducenti per il Western Blotting</td></tr><tr><td>Anticorpo CD9</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1.000 in 5% BSA in TBS-T; utilizzare condizioni non riducenti per Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000112</tr><tr><td>reagente per la rilevazione di ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>vacutainer EDTA per prelievo di sangue</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>inattivato a caldo (30 min, 56 &deg; C)</td></tr><tr><td>filtro 0,22 &micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo accoppiato a HRP</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>uso 1:10.000 in 5% di latte in polvere in TBS-T</td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-coniglio accoppiato a HRP</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>uso 1:10.000 in 5% di latte in polvere in TBS-T</td></tr><tr><td>4x tampone di caricamento Laemmli, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuga SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>latte in polvere (Blotting-Grade Blocker, latte in polvere scremato)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, senza Ca e Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>siringa perfusore 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante Ponceau-S</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotore Sw32.1 Ti per ultracentrifugazione (6 x 17 mL)</td><td>Rotore Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 per ultracentrifugazione (10 x 1,5 mL)</td><td>Beckman Provette Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per citometria a flusso (5 mL, fondo tondo)</td>Provette <td>per 352054</td><td></td> <td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>per ultracentrifugazione (15 mL)</td>Provette <td>per 344061</td><td></td> <td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>per ultracentrifugazione (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo della tubulina</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5.000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuga Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuga TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro valvola Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53.428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Il rilascio di vescicole extracellulari (SVE) comprese le piccole exosomes endosomali-derivato (Exos, diametro &lt;100 nm) e microvescicole membrana derivata da plasma di grandi dimensioni (MV, diametro&gt; 100 nm) è un processo cellulare fondamentale che si verifica in tutte le cellule viventi. Queste proteine di trasporto vescicole, lipidi e acidi nucleici specifiche per il loro cellulare di origine e in vitro hanno evidenziato la loro importanza come mediatori di comunicazione intercellulare. I veicoli elettrici sono stati isolati con successo da vari fluidi corporei e, soprattutto, i veicoli elettrici nel sangue sono stati identificati come promettenti biomarcatori per il cancro o le malattie infettive. Per consentire lo studio delle sottopopolazioni MV nel sangue, presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento e la caratterizzazione standardizzata di MV da campioni di sangue periferico. MV sono in pellet da campioni di plasma EDTA-coagulato mediante centrifugazione differenziale e tipicamente possiedono un diametro di 100 - 600 nm. Grazie alla loro dimensione più grande, possonofacilmente essere studiato mediante citometria di flusso, una tecnica che viene normalmente usato in diagnostica clinica e disponibile nella maggior parte dei laboratori. Diversi esempi di test di controllo della qualità delle MV isolate saranno dati e gli indicatori che possono essere utilizzati per la discriminazione delle diverse sottopopolazioni MV nel sangue saranno presentati.

Al fine di quantificare il rendimento di MV che possono essere isolati seguendo il protocollo descritto, abbiamo calcolato la quantità di MV isolati da campioni di sangue di 10 donatori. La resa MV, che è stata valutata in un test di proteine Lowry, variava da 10 a 30 mg con una media di 19,2 ug MV al sangue mL (Tabella 1). La concentrazione di particelle determinata mediante analisi nanoparticelle inseguimento (NTA) varia da 1,66 x 10 9 al 2.36 x 10 10 con una media di 5,9 x 10 9 particelle per campione di plasma mL (Tabella 2). Ulteriore caratterizzazione dei MV di microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato una popolazione di vescicole con un diametro&gt; 100 nm che sono stati circondati da un doppio strato lipidico e non conteneva alcun organelli cellulari (Figura 1A). NTA confermato che la dimensione delle MV isolati variava da 100 a 600 nm (Figura 1B) e la dimensione media era MV 201nm (Figura 1C). Colorazione per tipici marcatori MT e Exo tramite Western Blotting dimostrato che i MV isolati sono risultati positivi per la tubulina e ha mostrato solo una leggera espressione di CD9 e CD81, mentre Exos sono risultati negativi per la tubulina e arricchito in CD9 e CD81 (Figura 2). Analisi delle MV isolate mediante citometria di flusso (figura 3A) ha rivelato una popolazione vescicole definita che potrebbe essere gated utilizzando gli stessi parametri normalmente utilizzati per MV isolati da surnatanti di coltura cellulare e che era chiaramente diverso dal segnale di fondo ottenuto dalla misurazione di PBS + 1% vescicole-esaurite FCS, senza aggiunta di MV (Figura 3B). Al fine di analizzare le diverse popolazioni MV presenti nel sangue, MV sono state colorate con indicatori stabiliti per le diverse popolazioni di cellule del sangue, ad esempio, CD62p per MVS derivazione piastrinica, CD45 per MVS leucociti-derivati, CD235a perMV e CD62E rosso sangue cellule-derivato per MVS derivati dalle cellule endoteliali (Figura 4). Questa caratterizzazione ha mostrato che la percentuale di sottopopolazioni MT differiva tra i campioni di sangue del donatore esaminati, mentre la maggior parte di MV sembrava essere versato dalle piastrine in tutti i campioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Dimensioni Distribuzione di MV isolate da sangue periferico. A, MV isolati sono stati visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione. B, analisi inseguimento rappresentativa nanoparticelle (NTA) del MV illustrano la distribuzione delle dimensioni delle vescicole. C, La dimensione media MV da 10 preparati indipendenti è stata misurata mediante NTA (media). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere al</a>Versione Arger di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caratterizzazione di MV isolato mediante Western Blotting. espressione della proteina differenziale sul MV isolati e Exos da due donatori è stato visualizzato mediante Western Blotting. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi di MV mediante citometria di flusso. A, MV vengono prima visualizzati su avanti (FSC) rispetto sidescatter trame (SSC) per cancello sulla rispettiva popolazione di MV. Successivamente, queste MV si caratterizzano per l&#39;antigene di interesse da parte<html> utilizzando fluorescente anticorpi diretti contro l&#39;antigene. B, Tipica FSC rispetto piazzole SSC per MV isolate dal plasma di due donatori. Come confronto, una trama tipica per MVS derivati ​​dalle cellule tumorali da cellule del cancro del polmone A549 isolati dal surnatante coltura delle cellule così come un controllo negativo usando solo PBS + 1% vescicole-impoverito FCS senza MV vengono visualizzati sulla destra. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caratterizzazione di MV isolati mediante citometria di flusso. MV da tre donatori sono state caratterizzate per l&#39;espressione di marcatori di cellule del sangue stabiliti (rosso) di citometria a flusso. I rispettivi controlli isotipo sono mostrati in grigio.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campione </td><td> MV / ml di sangue [mg] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: MV proteine Yield da campioni di sangue periferico. </strong&gt; Visibile è la quantità di MV al sangue periferico mL che è stata elaborata a partire da 10 donatori. rendimenti MV sono stati quantificati mediante test Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campione </td><td> MV / plasma mL [count particelle] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: MV particelle Yield da campioni di sangue periferico. </strong&gt; MV sono stati isolati da campioni di plasma di 10 donatori e conteggi delle particelle sono stati determinati con l&#39;analisi di nanoparticelle di monitoraggio. Viene mostrato il valore medio di tre misurazioni indipendenti.

Le vescicole extracellulari presenti nel sangue sono state suggerite come nuovi biomarcatori per varie malattie. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di microvescicole derivate da grandi membrane plasmatiche da campioni di sangue periferico e la loro successiva analisi mediante citometria a flusso convenzionale e Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Gli obiettivi generali di questo metodo sono la caratterizzazione e lo studio di popolazioni di microvescicole derivate dalla membrana plasmatica nel sangue periferico. Le microvescicole di pazienti affetti da tumore, sono dosaggi proinvasivi e funzionali. Pertanto, un'ulteriore caratterizzazione fornirà informazioni su come queste vescicole contribuiscano effettivamente all'invasione e alla metastasi.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'analisi relativamente rapida delle microvescicole nel sangue, senza la necessità di materiali e attrezzature sofisticate o costose. Dopo aver ottenuto una o due provette di sangue da un volontario in provette di raccolta contenenti EDTA, capovolgere le provette più volte per garantire un'efficace anticoagulazione del sangue. Entro mezz'ora dal prelievo di sangue, centrifugare i campioni e aggiungere un filtro valvolare alle provette per aiutare a separare il plasma dal sangue rimanente.Trasferire il plasma in una provetta da 15 millilitri per una seconda centrifugazione. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungi PBS se necessario.Centrifugare il plasma contenente surnatante diluito in PBS se necessario per raccogliere le microvescicole. Quindi decantare il surnatante e posizionare i tubi capovolti su un tovagliolo di carta per tre-cinque minuti. Quando tutto il surnatante rimanente si è impregnato nell'asciugamano, rimuovere il plasma rimanente dal bordo dei tubi e risospendere il pellet di microvescicola in un millilitro di PBS.Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Quindi, dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 50-500 microlitri di PBS, a seconda delle dimensioni del pellet. Quindi determinare la concentrazione proteica delle microvescicole con un saggio proteico.Per caratterizzare le microvescicole mediante citometria a flusso, trasferire 15 microlitri di PBS, integrati con FCS impoverito all'1% di vescicola in una provetta per citometria a flusso, seguiti da tre a cinque microgrammi di microvescicole sospese in PBS. Incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame aspecifico sulla superficie della microvescicola. Quindi aggiungere l'anticorpo di interesse marcato con fluorescenza per un'incubazione a temperatura ambiente di 20 minuti al buio.Successivamente, diluire il campione in 250 microlitri di PBS fresco e caricare le microvescicole sul citometro a flusso. Ridurre la soglia del citometro a flusso al valore più basso possibile e cercare la popolazione di microvescicole utilizzando un grafico di dispersione in avanti rispetto a quello laterale in scala logoritmica. Quindi creare un cancello attorno alla popolazione di microvescicole e valutare il segnale fluorescente in un istogramma corrispondente.La resa di microvescicole da campioni di sangue di donatori può essere valutata nel saggio delle proteine di Lowry con rese tipiche comprese tra 10 e 30 microgrammi di vescicola per milliletro di sangue e una concentrazione di particelle che varia da 1,66 volte 10 al 9°, a 2,36 volte 10 al 10°, come determinato dall'analisi di tracciamento interparticellare. Un'ulteriore caratterizzazione delle microvescicole mediante microscopia elettronica a trasmissione rivela una popolazione di vescicole con un diametro superiore a 100 nanometri circondate da un doppio strato lipidico che non contiene organelli cellulari. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle conferma inoltre che la dimensione media delle microvescicole isolate varia da 100 a 600 nanometri con una media di 201 nanometri.La colorazione per i tipici marcatori di microvescicole ed esosomi mediante western blotting dimostra che le microvescicole isolate nel sangue sono tipicamente positive per il tubulante, con una debole espressione di CD9 e CD81, mentre gli esosomi sono generalmente negativi per il tubulante e sono arricchiti con gli altri due marcatori. La citometria a flusso rivela una popolazione definita di vescicole derivate da donatori che possono essere controllate utilizzando gli stessi parametri utilizzati per le microvescicole isolate con surnatante di coltura cellulare. Questo è anche chiaramente diverso dal segnale di fondo osservato per il PBS controllato, integrato con campioni di FCS impoveriti all'1%.La colorazione delle microvescicole con marcatori stabiliti per diverse popolazioni di cellule del sangue rivela che la percentuale di sottopopolazioni di microvescicole differisce tra i campioni di sangue dei donatori di sangue, con la maggior parte delle microvescicole che sembrano essere state rilasciate dalle piastrine in tutti i campioni. Una volta padroneggiato, l'isolamento delle microvescicole e la loro successiva caratterizzazione mediante citometria a flusso possono essere eseguiti in circa 2-1/2 ore. La caratterizzazione delle sottopopolazioni di microvescicole aiuterà a identificare una firma tumorale nei pazienti rispetto ai controlli.Questo può essere utile come biomarcatore per la diagnostica e la terapia di contrasto.

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Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Presentiamo un semplice protocollo per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da sangue intero ottenuto da pazienti con diagnosi di Sindrome di Sézary, seguito dalla selezione di cellule T CD4+, dalla loro stimolazione con phorbol12-myristate13-acetato e A23187 ionoforo, e dalla preparazione dell'RNA per la profilazione trascrittomica.

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.

Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Impara a isolare e caratterizzare microvescicole da sangue periferico usando citometria a flusso e Western Blotting. Questo metodo permette di analizzare rapidamente le popolazioni di vescicole per studiare biomarcatori tumorali.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

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