Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l'espressione genica e analisi istologiche
12 dicembre 2016
Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'analisi dei parametri istologici e molecolari da sezioni adiacenti di un singolo tessuto. Con questo metodo, possiamo aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia e della malattia del muscolo scheletrico. Ad esempio, quali sono gli effetti rigenerativi dopo una lesione muscolare e quali sono gli effetti della somministrazione genica virale mediante iniezione intramuscolare?
Il vantaggio di questo metodo è che i dati istologici e molecolari possono essere correlati direttamente da un singolo tessuto. Ciò rende più efficace l'analisi dei dati e un migliore utilizzo dei tessuti sperimentali. Cinque minuti prima di completare le dissezioni, raffreddare il bagno di crioconservazione.
Quando i campioni di tessuto sono pronti per essere incorporati, applicare prima la resina di inclusione sul terzo inferiore o sulla metà del tessuto, dove il muscolo incontra il tappo. Questo dovrebbe essere fatto in modo ordinato per ridurre l'interferenza della resina con i passaggi a valle. Quindi, far cadere immediatamente il tappo nel bagno di 2-metilbutano raffreddato a -140 gradi Celsius.
Includere fino a otto preparazioni di tessuti per lotto. Nella vasca da bagno, mescolare i fazzoletti per 30 secondi, raschiando il fondo del becher per evitare che i tappi di fazzoletto si congelino nella soluzione. Dopo 30 secondi, utilizzando uno strumento di metallo, estrarre un fazzoletto di sughero dal 2-metilbutano.
Quindi, rimuovere rapidamente il vetrino coprioggetti di supporto. Tamponare nuovamente il 2-metilbutano in eccesso nel bagno, quindi far cadere il tappo di tessuto nel bagno di azoto esterno. Dopo che tutti i tessuti sono stati trasferiti nell'azoto liquido, spostarli in un contenitore e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
Dopo aver preparato il criostato e montato un campione di tessuto, utilizzare i controlli grossolani e fini per far avanzare il campione fino alla lama in modo che tocchi la lama. A questo punto, reimpostate la somma degli spessori di sezione su zero. Quindi, impostare il criostato sulla funzione di rifilatura con uno spessore della sezione di 30 micron.
E tagliare e scartare le sezioni fino alla profondità di tessuto desiderata. Per raccogliere in modo efficiente le criosezioni per l'estrazione dell'RNA, aprire prima la provetta di raccolta e posizionarla vicino al portalame. Lì, usa una spazzola pulita e pre-raffreddata per raccogliere ogni sezione e trasferirla nel tubo.
Le sezioni anteriori del tibiale di topo da 30 micron prelevate da 400 a 4.000 micron di profondità del tessuto producono tipicamente da 25 a 50 milligrammi di muscolo. Se la resina incorporante circonda la criosezione, bloccare il freno a mano e utilizzare una lama di rasoio per radere piccoli pezzi di resina fino a quando non rimane solo uno strato sottile attorno alla parte superiore del muscolo. Tagliare sempre la resina con la lama angolata lontano dal muscolo.
Un sottile strato di resina incorporante non compromette sostanzialmente l'estrazione dell'RNA a valle. Se è presente una resina di inclusione più spessa, utilizzare delle spazzole per allontanarla dal muscolo prima di spostare la criosezione nella provetta di raccolta. Durante il processo di sezionamento, quando si desidera effettuare sezioni istologiche, reimpostare lo spessore della fetta a sette micron utilizzando i controlli del criostato.
Quindi, tagliare e scartare da quattro a sette sezioni per ottenere una superficie del tessuto uniforme e uniforme e prendere nota di questa profondità del tessuto. A questo punto, tagliate una buona sezione e orientatela sulla superficie del portalama. Utilizzando un vetrino da microscopio a temperatura ambiente, prelevare la sezione e riportare il vetrino a temperatura ambiente.
Raccogliere tutte le sezioni desiderate e quindi prendere nota della profondità finale del tessuto. Dopo aver completato il sezionamento, registrare rapidamente il peso delle criosezioni raggruppate per l'isolamento dell'RNA. Rimettere immediatamente il tubo nella camera del criostato per mantenere la temperatura delle sezioni vicino a -20 gradi Celsius.
Inizia trasferendo rapidamente le criosezioni raggruppate sul ghiaccio e aggiungendo circa un milliletro di reagente per l'estrazione dell'RNA organico per 50 milligrammi di criosezione. Prima viene applicato il reagente, meno l'RNA si degrada. Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro con un ago calibro 18, omogeneizzare le criosezioni senza formare troppe bolle aspirando ripetutamente una soluzione ed espellendola sulle pareti del tubo.
Utilizzare la punta dell'ago per disperdere i pezzi raggruppati. Dopo ogni cinque colpi, rimettere brevemente il campione nel ghiaccio per mantenerlo fresco. Una volta omogeneizzato, utilizzare un ago calibro 22 per triturare accuratamente il campione utilizzando altri cinque tratti.
Quindi rimettere il campione nel ghiaccio. Ripetere questo processo tre o quattro volte per ottenere un'omogeneità tissutale molto finemente dispersa. Una volta realizzato l'omogeneizzato finale, lasciarlo incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per interrompere i complessi molecolari.
Quindi, in una cappa aspirante, aggiungere 0,1 millilitri di BCP per millilitro di reagente di isolamento dell'RNA. Quindi, agitare energicamente il tubo per 15 secondi. Non utilizzare un vortice.
Quindi, incubare il campione a temperatura ambiente per due o tre minuti. Dopo la breve incubazione, centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 g e quattro gradi Celsius. Quindi, raccogliere con cura la fase superiore trasparente contenente l'RNA.
Trasferiscilo in una provetta pulita e aggiungi un volume uguale di etanolo al 70%, composto in acqua di mare profonda. Dopo aver agitato brevemente la provetta, lasciarla incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere seguendo il protocollo di testo. Le preparazioni di RNA del muscolo scheletrico sono state effettuate dal tibiale anteriore del topo.
Tre giorni prima, ad alcuni muscoli era stata iniettata una cardiotossina 10 micromolare e ad altri una soluzione fisiologica. La purezza e la resa dell'RNA di questi campioni erano eccellenti. La resa dell'RNA era sostanzialmente più alta nei muscoli tibiale anteriori dopo la lesione da tossina.
L'integrità dei tessuti e la produzione di RNA potrebbero essere un fattore determinante per questa osservazione. La persistenza della qualità dell'RNA preparato è stata valutata utilizzando un microlitro di RNA che era stato conservato a 20 gradi Celsius negativi per 18 mesi. Bande prominenti di RNA ribosomiale 18S e 28S sono ancora evidenti nei campioni che dimostrano un'elevata qualità dell'RNA.
Sezioni di sette micron sono state colorate per l'espressione della catena pesante della miosina embrionale, vista in rosso. Per rilevare le fibre rigeneranti, colorate per il collagene sei, viste in verde, che delineano le fibre muscolari e colorate con dappy, in blu, per osservare i nuclei. Quando c'è una scarsa iniezione di tossine, la lesione appare minima.
Un'iniezione di tossina riuscita provoca l'impatto di una regione molto più ampia del compartimento muscolare mirato. Il grado di lesione potrebbe essere utilizzato come criterio di inclusione per l'analisi dell'RNA. Una volta padroneggiate, le sezioni di taglio per l'estrazione dell'RNA e il vetrino istologico, possono essere completate in meno di mezz'ora per un singolo tessuto.
Dopo questa procedura, è possibile seguire altre colorazioni istologiche o immunofluorescenti per rispondere a un'ampia varietà di domande. Le criosezioni raggruppate possono essere utilizzate anche per raccogliere DNA o proteine.
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Panoramica
Questa procedura consente l'analisi di parametri istologici e molecolari da sezioni adiacenti di un singolo tessuto, in particolare del muscolo scheletrico del topo. Facilita la correlazione tra dati istologici e molecolari, migliorando l'analisi dei dati e l'utilizzo dei tessuti sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sul Muscolo Scheletrico
Sfondo
- Si raccolgono sezioni consecutive in criostato per applicazioni istologiche.
- Il ripristino dell'RNA per le misurazioni dell'espressione genica viene effettuato utilizzando regioni adiacenti.
- Si ottiene RNA di alta qualità da sezioni crioconservate raggruppate.
- Questo metodo consente un confronto diretto tra diverse applicazioni.
Scopo dello studio
- Analizzare gli effetti rigenerativi dopo un danno muscolare.
- Studiare gli effetti della somministrazione genica virale mediante iniezione intramuscolare.
- Correlare dati istologici e molecolari provenienti da un singolo tessuto.
Metodi Utilizzati
- Criopreservazione di campioni di tessuto.
- Acquisizione di sezioni consecutive criogeniche.
- Estrazione di RNA da sezioni criogeniche raggruppate.
- Analisi istologica di sezioni di tessuto adiacenti.
Risultati principali
- È possibile ottenere RNA di alta qualità da 20 - 30 mg di sezioni crioconservate raggruppate.
- Dati istologici e molecolari possono essere efficacemente correlati.
- Il metodo migliora l'analisi dei tessuti sperimentali.
- È possibile affrontare questioni fondamentali nella biologia del muscolo scheletrico.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio solido per lo studio della biologia muscolare.
- Permette un'analisi efficace dei dati a partire da una singola fonte di tessuto.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per ottenere approfondimenti più dettagliati sulla rigenerazione muscolare e sul trasferimento genico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una correlazione diretta tra dati istologici e molecolari provenienti da sezioni adiacenti di muscolo scheletrico, riducendo l'incertezza sperimentale e l'uso di animali nei flussi di lavoro di scoperta. Migliorando il rendimento di RNA da campioni tissutali di piccole dimensioni mediante l'accumulo di criosezioni e l'omogeneizzazione con ago, supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei modelli precoci di malattie muscoloscheletriche. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva collegando osservazioni fenotipiche a modifiche dell'espressione genica provenienti dallo stesso sistema biologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche correlando marcatori di danno istopatologico a modifiche dell'espressione genica nello stesso tessuto.
- Valore operativo: Riduce la necessità di esperimenti replicati su animali ottenendo dati abbinati di istologia e molecolari da un singolo muscolo scheletrico.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione dei rischi associati ai bersagli grazie a letture fenotipiche e molecolari allineate, che aumentano la fiducia nell'interpretazione dei meccanismi della malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una preparazione standardizzata dei tessuti per l'estrazione successiva di RNA, consentendo un profilo di espressione genica coerente tra diverse condizioni sperimentali.
- Valore operativo: Facilita la prontezza per i saggi generando lisati omogeneizzati da sezioni crioconservate in pool, adatti a protocolli di qPCR o sequenziamento.
- Scalabilità: Permette l'elaborazione di più tessuti per ogni lotto mediante l'uso di un criostato, supportando applicazioni di scoperta a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Permette una transizione fluida dalla scoperta istologica alla validazione molecolare mediante regioni tessutali adiacenti, rafforzando la correlazione dei biomarcatori.
- Rilevanza del Modello Preclinico: Consente la valutazione delle risposte rigenerative e degli effetti della terapia genica in modelli di lesione attraverso un'analisi strutturale e molecolare abbinata.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo la variabilità tra gli endpoint istologici e molecolari ottenuti dallo stesso campione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta consentendo un'analisi guidata da ipotesi sulla biologia del muscolo scheletrico, in cui lo screening istologico orienta il successivo approfondimento molecolare a partire dalla stessa fonte tessutale.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione dei bersagli collegando fenotipi strutturali (ad esempio fibrosi, rigenerazione) con risposte trascrizionali in sezioni adiacenti.
- Screening: Produce pool standardizzati di criosezioni che fungono da input riproducibili per l'estrazione di RNA e saggi analitici successivi.
- Analisi: Genera metriche quantitative di resa e qualità dell'RNA che consentono il confronto tra gruppi di trattamento e condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il punteggio di danno istopatologico con le firme molecolari di rigenerazione o di trasferimento genico, sostenendo la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di preparazione dei tessuti riutilizzabile, applicabile a diversi muscoli scheletrici e modelli di malattia, riducendo lo sviluppo ridondante di protocolli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo il rumore biologico grazie a dati istologici e molecolari abbinati provenienti da regioni tissutali identiche.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione mediante il pooling di sezioni crioconservate e l'omogeneizzazione controllata con ago, riducendo al minimo la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale massimizzando il rendimento dei dati per animale, riducendo la necessità di studi replicati nelle campagne di validazione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi attraverso evidenze fenotipiche e molecolari concordanti, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto a un allineamento meccanicistico inadeguato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso del criostato e nell'inclusione dei tessuti per garantire la qualità delle sezioni ed evitare interferenze della resina con l'estrazione successiva di RNA.
- È vincolato alla disponibilità di un criostato e di un'infrastruttura per l'azoto liquido per la conservazione del tessuto e la sezionatura a temperature controllate.
- Necessita della standardizzazione dello spessore delle sezioni (30 µm per l'RNA, 7 µm per l'istologia) e delle procedure di raccolta tra diversi operatori per assicurare la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri tipi di tessuto potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri di sezionatura e delle tecniche di omogeneizzazione in base alla densità e all'architettura del tessuto.
- I limiti pratici includono una produttività relativamente bassa e la necessità di un'accurata manipolazione per prevenire il degrado dell'RNA durante la raccolta e la lavorazione delle sezioni.
