Name: Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per lespressione genica e analisi istologiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Impara il criosezionamento di sezioni contigue del muscolo scheletrico murino per analisi istologiche e di espressione genica. Questo metodo consente di correlare dati molecolari e istologici da un unico tessuto.

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Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre e Junna Luan hanno fornito assistenza tecnica. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health con il numero di premio AR065077. Il contenuto è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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L'autrice dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Per ottenere i migliori risultati con questo metodo, tenere embedding resina limitato al terzo inferiore o mezza del muscolo durante la crioconservazione di tessuto, perché la resina in eccesso rallenta la raccolta dei criosezioni pool e può aumentare l&#39;incorporamento contaminazione resina nell&#39;isolamento dell&#39;RNA. Inoltre, attenzione durante dell&#39;ago omogeneizzazione è importante per ottimizzare il rendimento e minimizzare la probabilità di intasamento dell&#39;ago. Il protocollo può essere modificato u...

L&#39;obiettivo di questa tecnica è quello di rendere più analisi sperimentali diverse modalità, quali l&#39;espressione genica e istologia, accessibili da un unico piccolo tessuto d&#39;origine muscolo scheletrico. applicazioni Microscopia sono più sensibili al campione metodi di conservazione, che devono essere controllati con attenzione per limitare la formazione di manufatti cristalli di ghiaccio durante crioconservazione. Pertanto, lo sviluppo del metodo si basa sulla tibiale anteriore (TA) muscolare congelati parzialmente coperto di incorporamento di resina in un raffreddato con azoto liquido vasca 2-metilbutano -140 ° C come materiale sorgente per immunofluorescenza e analisi dell&#39;espressione genica. La necessità di utilizzare lo stesso materiale di base per diversi approcci tecnici è particolarmente importante per gli esperimenti di iniezione a base intramuscolare cui i muscoli a destra e sinistra rappresentano differenti condizioni, una sperimentale e uno di controllo. Ad esempio, in studi di rigenerazione muscolare, uno muSCLE viene iniettato con una tossina provocare danni ai tessuti diffusa mentre il muscolo controlaterale serve come un controllo del veicolo iniettato 1. Analogamente, studi di terapia genica per disturbi muscolari tipicamente iniziano con la convalida del vettore terapia genica mediante iniezione intramuscolare da confrontare con vettore vuoto, vector estranei o controllo del veicolo sul lato controlaterale 2. Pertanto, non è possibile reperire ogni muscolo TA a un&#39;altra applicazione. Le strategie comuni per affrontare questo problema sono i seguenti: i) per utilizzare un gruppo muscolare diverso per ogni applicazione, ii) di utilizzare topi aggiuntivi, o iii) per tagliare un pezzo di muscolo per ogni applicazione. Tuttavia, le differenze sostanziali tra i gruppi muscolari rendono difficile il confronto dei dati da applicazioni separate, e altri animali aumentano spese e sono scarsamente giustificata se esistono altre alternative. Dividendo il muscolo dopo la dissezione di procurarsi diverse applicazioni è il migliore che l&#39;opzionen molti casi. Tuttavia, i pezzi muscolari sono spesso troppo piccole per utilizzare polverizzazione sotto azoto liquido o tecniche di macinazione meccanica per omogeneizzazione 2-5. Come il muscolo è un tessuto altamente strutturale ricco di proteine ​​della matrice extracellulare e contrattili, inadeguata omogeneizzazione meccanica porta ad una bassa resa di successive DNA, RNA o proteine. Il metodo descritto qui consente di piccole quantità di tessuto da un muscolo fonte per l&#39;utilizzo in diverse applicazioni, e l&#39;inclusione di criosezionamento e l&#39;ago triturazione migliora omogeneizzazione meccanica per una migliore resa RNA.

<table><tbody><tr><td>Sughero</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Tagliare in piccoli quadrati con una lama affilata.</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Utilizzato per orientare il muscolo durante il congelamento.</td></tr><tr><td>Termometro a bassa temperatura</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Attenzione: sostanza chimica pericolosa. Conservare in un armadio infiammabile.</td></tr><tr><td>Resina di inclusione: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Altre resine di inclusione possono essere sostituite alla cryomatrix.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 con portalama monouso</td><td>Qualsiasi criostato funzionante dovrebbe essere sufficiente per il protocollo.</td></tr><tr><td>Lama monouso per criostato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Utilizzare una lama o un coltello appropriati per il criostato da utilizzare.</td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione dell'RNAsi: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Utilizzare per gestire le criosezioni. Può essere trovato nei negozi con semplici forniture artistiche.</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per estrazione organica a RNA: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Attenzione: TRIzol è una sostanza chimica pericolosa. Nota: per l'estrazione dell'RNA dal muscolo scheletrico si raccomandano solo reagenti di estrazione organica.</td></tr><tr><td>Ago calibro 18</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 22</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 26</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Opzionale. Può essere utilizzato per un terzo ciclo di triturazione del campione nel protocollo di estrazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Per campioni di valore molto elevato, si consiglia una siringa Luer-Lok (es., VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-cloropentano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: 200 alcol proof</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Mescolare 35 ml di alcol a 200 gradi + 15 ml di acqua DEPC.</td></tr><tr><td>Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: acqua trattata con DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Mix 35 ml di alcol 200 proof + 15 ml di acqua DEPC.</td></tr><tr><td>Kit di purificazione dell'RNA: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Fasi finali della preparazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>Acqua priva di DNasi/RNASI&nbsp;</td><td>È possibile utilizzare anche acqua trattata</td> <td>con Gibco</td><td>10977</td> DEPC.</tr><tr><td>Spettrofotometro: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific NanoDrop</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Trattare l'RNA purificato per rimuovere qualsiasi contaminazione del DNA prima delle applicazioni a valle.</td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS per protocollo di immunofluorescenza.</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Reidratare il normale stock di siero d'asino secondo le istruzioni del produttore, quindi diluire un'aliquota al 5% per l'immunofluorescenza. Può essere utilizzato anche il normale siero di capra.</td></tr><tr><td>eMHC Anticorpo</td><td>Università dell'Iowa Studi sullo sviluppo Ibridoma Banca</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Collagene VI</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-fenilidolo)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio acquosi: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Utilizzare solo mezzi di montaggio progettati per applicazioni fluorescenti con proprietà anti-sbiadimento.</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Utilizzo per il montaggio di vetrini alla fine del protocollo di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, o prodotti più avanzati</td><td>Freeware ImageJ dovrebbero funzionare anche per il conteggio manuale. Software più avanzati con capacità di segmentazione possono consentire una parziale automazione del processo; ad esempio, ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Unisci e mappa le immagini delle sezioni: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 è stato interrotto. Altre opzioni per la cardiotossina sono EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; o Ge Script # RP17303; Ma questi non sono stati convalidati.</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa: Sistema di sintesi del primo filamento Superscript III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi reagente di trascrizione inversa convalidato e di alta qualità.</td></tr><tr><td>PCR standard: Sistema GoTaq Flexi polimerasi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi sistema Taq polimerasi convalidato e di alta qualità. Se il sequenziamento del DNA deve essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle della PCR, è necessario utilizzare un sistema PCR ad alta fedeltà.</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Per l'uso in qPCR quando non si utilizza una master mix qPCR dedicata. Utilizzabile con SuperROX (per strumenti Applied Biosystems) e GoTaq Flexi polimerasi e tamponi.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX è più stabile nella reazione PCR, quindi è preferibile per l'uso come colorante di riferimento passivo qPCR rispetto a ROX (carbossi-X-rodamina). Per qPCR con strumenti Applied Biosystems</td></tr><tr><td>PCR in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Con questo metodo, criosezioni consecutivi sono raccolti per permettere alle applicazioni di microscopia per istologia dei tessuti e l&#39;arricchimento di RNA per l&#39;espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. In genere, è difficile da ottenere una adeguata omogeneizzazione dei piccoli campioni del muscolo scheletrico a causa volumi buffer può essere troppo bassa per le applicazioni di macinazione efficiente, ma senza sufficiente rottura meccanica, l&#39;architettura del tessuto denso di limiti muscolari penetrazione dei reagenti tampone, in ultima analisi, causando bassa resa di RNA. Seguendo il protocollo qui riportato, 30 sezioni micron sono raccolti ed aggregati permettendo criosezionamento e successiva omogeneizzazione ago per interrompere meccanicamente il muscolo, aumentando l&#39;area superficiale esposta per la penetrazione buffer. I limiti principali della tecnica sono che richiede un criostato, ed è relativamente ridotto. Tuttavia, RNA di alta qualità può essere ottenuto da piccoli campioni di m poolcriosezioni uscle, rendendo questo metodo accessibile per molti muscoli scheletrici diversi e altri tessuti. Analisi Inoltre, questa tecnica permette abbinato (ad esempio, istopatologia tessuto e di espressione genica) dalle regioni adiacenti di un singolo muscolo scheletrico in modo che le misurazioni sono direttamente confrontabili tra applicazioni per ridurre l&#39;incertezza sperimentale e per ridurre gli esperimenti su animali replicativi necessario fonte un piccolo tessuto per la applicazioni multiple.

Muscle cryosection RNA è ad alto contenuto di qualità e fornisce il rendimento sufficiente per la maggior parte delle applicazioni Analisi di sedici preparati di RNA muscolo scheletrico sono mostrati nella Tabella 1 utilizzando 19,4 a 41 mg di pool muscolo tibiale anteriore (TA) da 8 topi di controllo. Sia a sinistra (L) e destra muscoli (R) TA sono stati preparati in esperimenti di rigenerazione con muscoli racc...

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l&#39;arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'analisi dei parametri istologici e molecolari da sezioni adiacenti di un singolo tessuto. Con questo metodo, possiamo aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia e della malattia del muscolo scheletrico. Ad esempio, quali sono gli effetti rigenerativi dopo una lesione muscolare e quali sono gli effetti della somministrazione genica virale mediante iniezione intramuscolare?Il vantaggio di questo metodo è che i dati istologici e molecolari possono essere correlati direttamente da un singolo tessuto. Ciò rende più efficace l'analisi dei dati e un migliore utilizzo dei tessuti sperimentali. Cinque minuti prima di completare le dissezioni, raffreddare il bagno di crioconservazione.Quando i campioni di tessuto sono pronti per essere incorporati, applicare prima la resina di inclusione sul terzo inferiore o sulla metà del tessuto, dove il muscolo incontra il tappo. Questo dovrebbe essere fatto in modo ordinato per ridurre l'interferenza della resina con i passaggi a valle. Quindi, far cadere immediatamente il tappo nel bagno di 2-metilbutano raffreddato a -140 gradi Celsius.Includere fino a otto preparazi

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