L'utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di individuare gli agenti prodotti da un ceppo batterico che sono inibitori nei confronti del secondo ceppo batterico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande in una serie di campi microbiologici, ma è particolarmente utile nell'ecologia microbica, nella comprensione delle interazioni batteriche antagoniste. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica e facile da eseguire e interpretare.

A dimostrare la procedura sarà Aretha, una studentessa del laboratorio. Per iniziare l'esperimento, inoculare una singola colonia di siringa P in 3 millilitri di brodo King's Medium B, o KB. Incubare la coltura durante la notte. La mattina seguente, diluire il brodo di coltura da 1 a 100 in 3 millilitri di brodo KB fresco.

Incubare la coltura per tre o quattro ore agitando a temperatura ambiente. Assicurarsi che la coltura abbia un notevole aumento della torbidità, quindi aggiungere la mitomicina C.Successivamente, incubare la coltura durante la notte agitando a temperatura ambiente. Il giorno successivo, pellet da uno a due millilitri di mitomicina C ha indotto colture in una microcentrifuga da banco.

Rimuovere e sterilizzare i surnatanti di coltura facendo passare il surnatante attraverso un filtro poroso da 0,22 micrometri. Aggiungere cloruro di sodio per raggiungere una concentrazione di un molare e aggiungere glicole polietilenico, o PEG 8000, a una concentrazione finale del 10%, al surnatante sterile. Capovolgere ripetutamente i campioni fino a quando sia il cloruro di sodio che il PEG non sono completamente disciolti.

Incubare i campioni in un bagno di ghiaccio per un'ora. Quindi, centrifugare i campioni. Dopo la centrifuga, decantare il surnatante e risospendere il pellet nel tampone pipettandolo ripetutamente.

Rimuovere il PEG residuo mediante due estrazioni sequenziali con un volume uguale di cloroformio. Unire il cloroformio al pellet risospeso e agitare la miscela per 15 secondi. Quindi centrifugare la miscela a 20.000 volte G per cinque minuti.

Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microfuge. Ripetere l'estrazione due volte, fino a quando non è visibile alcuna interfaccia bianca tra la fase acquosa e quella organica. Lasciare evaporare il cloroformio residuo dai surnatanti estratti in una cappa aspirante.

Inoculare una singola colonia di un ceppo di P syringae in tre millilitri di KB e incubare la coltura durante la notte con agitazione a temperatura ambiente. La mattina seguente, diluire la coltura da 1 a 100 in KB fresco. Incubare la coltura per tre o quattro ore agitando a temperatura ambiente. Successivamente, preparare l'agar d'acqua sterilizzata sterilizzando in autoclave una sospensione di agar in acqua ultrapura.

Mantenere l'agar morbido fuso in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius prima dell'uso. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, trasferire tre millilitri di agar morbido in una provetta di coltura sterile. Rimettere la provetta di coltura nel bagnomaria per mantenerla allo stato fuso.

Prima di versare il rivestimento, lasciare raffreddare l'agar fuso, ma non lasciarlo solidificare. È fondamentale che l'agar venga mantenuto in uno stato caldo e completamente fuso prima dell'inoculazione. In caso contrario, la sovrapposizione avrà un aspetto sgranato e sarà più difficile da interpretare.

In una cappa sterile, inoculare 100 microlitri di coltura del ceppo tester nell'agar morbido e nel vortice da mescolare. Ruotare la coltura a mano per 10-15 secondi, quindi versarla sul fondo di una piastra di agar. Inclinare la piastra in tutte le direzioni per assicurarsi che l'agar morbido copra uniformemente l'agar inferiore.

Coprite il piatto e lasciatelo solidificare per 20-30 minuti. Fare attenzione a non disturbare la piastra durante la solidificazione. Una volta solidificato, posizionare da due a cinque microlitri di surnatante sulla sovrapposizione.

Lasciare incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente. Osservare e registrare i risultati la mattina seguente. Utilizzando questo metodo, due ceppi di siringhe P sono inibiti da diverse batteriocine.

Il ceppo A è sensibile a una batteriocina ad alto peso molecolare Tailocin, ma non è sensibile a una batteriocina alternativa a basso peso molecolare. Al contrario, il ceppo B è insensibile alla taiolina, ma è sensibile alla batteriocina a basso peso molecolare. La taiocina viene recuperata in modo efficiente dopo la precipitazione del PEG, mentre le batteriocine a basso peso molecolare non lo sono.

L'uccisione mediata dai batteriofagi si distingue da altri antimicrobici non replicativi confrontando una serie di diluizioni. Nel caso della chiarificazione mediata da batteriofagi, la diluizione del surnatante si è risolta in singole placche, o zone di chiarezza, mentre la chiarificazione mediata da batteriocina non si è risolta in tali placche. Questa procedura può essere utilizzata come screening iniziale per identificare gli agenti inibitori e può essere combinata con manipolazioni genetiche a valle per identificare o confermare la fonte di questa attività.