Name: Chirurgia Shunt, Destra cuore cateterizzazione, e Vascolare Morfometria in un modello di ratto per Flow-indotta ipertensione arteriosa polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri come creare un modello di ipertensione arteriosa polmonare indotta da flusso nel ratto, utilizzando chirurgia shunt, cateterizzazione cardiaca destra e morfometria vascolare. Questo metodo standardizzato facilita la ricerca traslazionale.

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Questo studio è stato supportato dall'Iniziativa di Ricerca Cardiovascolare dei Paesi Bassi, dalla Fondazione Olandese per il Cuore, dalla Federazione Olandese dei Centri Medici Universitari, dall'Organizzazione Olandese per la Ricerca e lo Sviluppo Sanitario e dall'Accademia Reale delle Scienze dei Paesi Bassi (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Centrale olandese per la sperimentazione animale e il Comitato Animal Care presso University Medical Center di Groningen (NL). Entrambi sono stati utilizzati ratti Wistar e Lewis con pesi tra 180 e 300 g. 1. Corpo e acclimatazione <ol><li> Dopo l&#39;arrivo presso l&#39;impianto di animale centrale, ratti casa in gruppi di 5 per gabbia. Nel corso di un periodo di acclimatazione di 7 giorni, abituare i ratti per la manipolazione umana, ma non eseguire alcuna procedura sperimentale. </li></ol> 2. Preparazione e l&#39;iniezione di sterile Monocrotalin <ol><li> Per 1 ml di 60 mg / mL monocrotalin (MCT) soluzione, pesare 60 mg di monocrotalin in una provetta 2 mL. Aggiungere 700 microlitri di 0.9% NaCl. Aggiungere 200 ml di 1 M HCl. Riscaldare la soluzione della provetta sotto acqua corrente calda e vortex esso. Utilizzare 6 N NaOH per portare il pH verso 7.0. Utilizzare una tecnica sterile per la preparazione di MCT per iniezione in roditori. </li&gt; <li> Iniettare 1 ml di sterile 60 mg / mL soluzione MCT per kg per via sottocutanea nel collo (0,3 ml di 60 mg / mL MCT per 300 g ratto). NOTA: Non preferiamo usare volumi più piccoli a causa della maggiore probabilità che la dose iniettata non sarà opportuno. </li></ol> 3. Aorta-Caval Chirurgia Shunt <ol><li> Anestesia. <ol><li> Riempire la camera di induzione con 5% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min) e posizionare il topo nella camera. Verificare la presenza di un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Pesare il ratto. </li><li> Shave e pulire l&#39;addome su una superficie che è di circa 8 cm e larga 3 cm. Posizionare il topo sul dorso su una stuoia di calore (37 ° C) coperta da una stuoia sterile. </li><li> Posizionare il muso in una ventilazione in maschera / cappuccio con 2 - 3% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min). Controllare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li></ol></li><li> shunt Surgery. <ol><li> Macchia la pelle con cloruro-hexidine per la disinfezione. Iniettare 0,01 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina per l&#39;analgesia post-operatoria. </li><li> Utilizzare strumenti sterili per la chirurgia. Fare un&#39;incisione con un # 10 bisturi nell&#39;addome sulla linea mediana, a partire da 1 cm al di sotto del diaframma una che si estende verso il basso per appena sopra i genitali. </li><li> Sollevare l&#39;intestino con un tampone di cotone, coprire l&#39;intestino in una sterile, garza bagnata (0,9% NaCl), e metterli al lato sinistro dell&#39;animale. </li><li> Usare tamponi di cotone per separare le membrane che fissano l&#39;aorta addominale e la vena cava inferiore ai tessuti circostanti. NOTA: Non sezionare le membrane tra l&#39;aorta e la vena cava. </li><li> Utilizzando pinze scheggia, rimuovere il grasso aortica perivascolare appena sopra la biforcazione, solo sul lato destro dell&#39;aorta e solo nel luogo in cui viene inserito l&#39;ago. </li><li> Usare tamponi di cotone per separare l&#39;aorta e vena cava da mm supe 2rior al sito in cui verrà inserito l&#39;ago in modo da creare lo spazio per un morsetto Biemer. </li><li> In questa zona, il primo posto una legatura sciolto (5-0 di sutura) intorno all&#39;aorta. Creare tensione legatura posizionando un morsetto Kocher su di esso, e quindi inserire il Kocher superiore all&#39;incisione (Figura 1A). Posizionare il morsetto Biemer appena superiore alla legatura (Figur e 1A). </li><li> Usando un tampone di cotone, comprimere la vena cava più distalmente possibile ostruire il flusso (Figura 1A). Bend un ago (18 G in questo protocollo) in un angolo di 45 gradi, con la punta dell&#39;orifizio verso l&#39;esterno (Figura 1A). </li><li> Ad un angolo di 90 gradi, inserire l&#39;ago in aorta, appena sopra la biforcazione, con l&#39;orifizio della punta dell&#39;ago a sinistra (Figura 1A). Manipolare la punta dell&#39;ago a sinistra e inserirla nella vena cava. NOTA: La punta dell&#39;ago deve ora essere visiBLE nella vena cava (Figura 1B). </li><li> Utilizzare un secondo tampone di cotone per spingere il sangue rimanente nell&#39;aorta fuori del sito di inserimento per prevenire la trombosi. Essiccare la zona intorno al shunt con una garza sterile affinché depositi di colla adeguatamente. </li><li> Estrarre l&#39;intero ago dal aorta e immediatamente applicare una goccia di colla tessuto sul sito di puntura in aorta. Assicurarsi di non incollare il tampone di cotone per il tessuto. Sganciare l&#39;aorta. </li><li> Verifica shunt manualmente tirando e rilasciando la legatura sul prossimale dell&#39;aorta allo shunt. Allentamento dovrebbe colorare il distale della vena cava per lo shunt in rosso e creare turbolenze nel sito shunt. NOTA: serraggio diventerà il sangue nella vena cava torna al rosso scuro. </li><li> Inserire l&#39;intestino indietro nell&#39;animale. Chiudere lo strato di muscolo e pelle con riassorbibili 4-0 punti di sutura. Ventilare l&#39;animale con il 100% O 2 per recuperare da anestesia. NOTA: Non lasciare un aniMal incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. </li></ol></li><li> Chirurgia Sham. <ol><li> Eseguire tutte le procedure di cui sopra, tranne per l&#39;inserimento dell&#39;ago in aorta. </li></ol></li><li> la cura post-chirurgica. <ol><li> Posizionare il ratto in una singola gabbia e in un incubatore a 37 ° C fino alla mattina seguente. </li><li> Intorno a 6 ore dopo l&#39;intervento chirurgico, iniettare 0,01 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina per l&#39;analgesia post-operatoria. Ripetere la mattina successiva se il ratto mostra segni di disagio. NOTA: I primi 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico, i ratti tendono a mangiare e bere meno (questo è particolarmente importante quando chow o acqua potabile sono mescolati con la droga). La maggior parte dei ratti mostrano un comportamento normale 3 giorni dopo l&#39;intervento. In caso contrario, seguire da vicino. La perdita di peso superiore al 15% in 1 settimana è considerato anormale, e tali ratti dovrebbe essere eutanasia per estrazione del volume di sangue circolante mentre sotto anestesia. </li></ol></li></ol> NOTA: In questo protocollo, l&#39;animale è eutanasia per l&#39;estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia. <ol><li> Sacrificio 1 giorno dopo l&#39;intervento chirurgico (MF8) per le prime risposte cellulari e funzionale per aumento del flusso sanguigno polmonare (ad esempio, geni up-regolazione o fattori di trascrizione precoce). </li><li> Sacrificio 1 settimana dopo l&#39;intervento chirurgico (MF14) per un fenotipo PAH vascolare in stadio precoce (ipertrofia mediale senza lesioni neointimale). </li><li> Sacrificio 2 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico (MF21) per un fenotipo PAH vascolare in stadio avanzato (marcata ipertrofia mediale e formazione neointimale) con un lieve aumento nel RVP e mPAP. </li><li> Sacrificio 3 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico (MF28) per un fenotipo PAH vascolare allo stadio terminale (contrassegnato occlusione neointimale) e forte elevazione RVP e mPAP. I segni clinici di insufficienza ventricolare destra sono comuni in questa fase. </li><li> Sacrificio dopo giorno 28 (MF-RVF) Per l&#39;insufficienza del ventricolo destro PAH associata (RVF), clinicamente definita come la dispnea, grave letargia, e perdita di peso (&lt;10% in 1 settimana). Termina ratti quando è presente uno di questi segni. Spesso, i ratti sviluppano questi sintomi tra i giorni 28 e 35 e, se lasciato incustodito, muoiono spontaneamente durante questo intervallo di tempo. </li></ol> 5. Diritto Cuore Catheterization <ol><li> Anestesia. <ol><li> Riempire la camera di induzione con il 5% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min) e posizionare il topo nella scatola. Verificare la presenza di un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia eseguendo un pizzico dito posteriore. Pesare il ratto. </li><li> Shave e pulire il collo a destra-ventrale del ratto e, per il protocollo ecocardiografia torace e dell&#39;addome superiore. </li><li> Posizionare il ratto sulla sua schiena su una stuoia di calore (37 ° C) e posizionare il muso in una ventilazione in maschera / cappuccio con 2 - 3% isoflurano / 100% O 2 (flusso: 1 L / min). Il muso deve essere affrontato verso il ricercatore. </li><li&gt; Controllare la profondità dell&#39;anestesia. Fate attenzione con i ratti con grave PH. Se la frequenza cardiaca diminuisce, ridurre la profondità dell&#39;anestesia. Preferibile, eseguire tutte le misure entro 20 min. Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li></ol></li><li> protocollo ecocardiografia. <ol><li> Eseguire l&#39;ecocardiografia secondo il protocollo descritto da Brittain et al. in JoVE 13. </li></ol></li><li> protocollo cateterizzazione. NOTA: Questo protocollo utilizza una cannula rigida con una punta preformata piegato 20 gradi per guidare il catetere di silicio 15 cm con una sfera 2 mm dalla punta. Un ago 20-G con suo orifizio leggermente piegato verso l&#39;interno viene utilizzato per inserire la cannula nella vena giugulare destra (vedere l&#39;elenco dei materiali). Ratti in ogni fase della PAH progressione e di controllo possono essere utilizzati in questo protocollo. <ol><li> Disinfettare il collo con il cloruro-hexidine. Fare un 1,5 cm incisione con un # 10 bisturi nella parte destra-ventraledel collo, dalla clavicola fino all&#39;osso mandibolare. </li><li> Stendere il tessuto con le forbici. Utilizzando una pinzetta, tirare delicatamente il tessuto a parte fino a quando appare la vena giugulare. Sezionare le membrane intorno alla vena giugulare con pinze scheggia. </li><li> Mettere tensione sulla vena giugulare posizionando una legatura allentata (5-0 sutura) intorno al vaso. Aumentare la tensione e il nastro la legatura sulla maschera di ventilazione (Figura 2A). </li><li> A valle del sito di inserimento, inserire una legatura allentata intorno al vaso per stringere dopo la cannula è in situ, per evitare perdite e la perdita di pressione. </li><li> Utilizzando le maniglie di una pinza, piegare leggermente la punta di un ago 20-G con l&#39;orifizio all&#39;interno di condurre la cannula con il catetere. </li><li> Introdurre la punta dell&#39;ago 20-G nella vena e posizionare rapidamente la cannula contenente il catetere all&#39;interno del vaso. Estrarre l&#39;ago, e quindi chiudere la legaturache è stato preparato nel passaggio 5.3.4. </li><li> Effettuare la cannula contenente il catetere nella vena giugulare. La punta della cannula è in una curva di 20 gradi (vedi punto 5.3.5). Manovra la cannula sotto la clavicola e far avanzare un po &#39;per entrare nell&#39;atrio destro (Figura 2C). </li><li> Per entrare nel ventricolo destro, puntare la punta della cannula verso sinistra, verso il cuore (Figura 2D). Sul monitor posto letto, una curva di pressione RV dovrebbe comparire, corrispondenti figura 2D. </li><li> Quando la curva di pressione RV è costante, annotare la pressione del ventricolo destro sistolica e diastolica 1 (sRVP1 / dRVP1). </li><li> Manipolare la punta della cannula e verso l&#39;alto a sinistra. Far avanzare il catetere all&#39;interno della cannula (Figura 2E). </li><li> Avanzare il catetere nell&#39;arteria polmonare principale (PA). Nessuna resistenza deve essere sentito quando si passa la valvola polmonare. NOTA: Quando il catetere entra l&#39;arteria polmonare principale, la dpressione iastolic aumenterà. Sul monitor posto letto, una curva di pressione PA dovrebbe comparire, corrispondenti Figura 2E. </li><li> Quando la curva di pressione PA è costante, annotare la pressione sistolica, diastolica e pressione media PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1). </li><li> Ulteriori avanzare il catetere all&#39;interno della cannula fino a quando la palla sulla punta del catetere viene incastrata in una arteria polmonare. Osservare la curva di pressione sulla goccia monitor al posto letto e abbinare la curva di pressione a cuneo in Figura 2F. </li><li> Quando la curva di pressione cuneo è costante, annotare la pressione sistolica, diastolica e pressione media cuneo. </li><li> Tirare indietro il catetere lentamente e successivamente misurare e annotare i valori per sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, e dRVP2, come visualizzato sul monitor al posto letto. </li><li> Quando, nel camper, un po &#39;tirare indietro la cannula e il catetere per misurare la pressione atriale destra (RAP) dire. La curva deve corrispondere alla curva di RAP in figura 2A. NOTE: In questo protocollo, i topi sono eutanasia dopo il protocollo di cateterizzazione per l&#39;estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia. </li></ol></li></ol> 6. Valutazione Morfologia e Morfometria NOTA: In questo protocollo, l&#39;animale è eutanasia per l&#39;estrazione del volume del sangue circolante mentre sotto anestesia. Ratti in ogni fase della PAH progressione e di controllo possono essere utilizzati in questo protocollo. <ol><li> Dopo il sacrificio, estrarre i polmoni tagliando la trachea circa 5 mm al di sopra della biforcazione bronchiale ed i vasi che collegano i polmoni al cuore. Mettere i polmoni in soluzione salina fredda. Sezionare il polmone sinistro. Tagliare il bronco principale di sinistra alla biforcazione. </li><li> Riempire una siringa da 50 ml con 4% paraformaldeide, collegare un tubo con una cannula alla siringa, e appendere la siringa circa un metro dal piano di lavoro. Montare la cannula nel bronco principale di sinistra per riempire passivamente il polmone con paraformaldeide.Maneggiare con cautela paraformaldeide. </li><li> Incubare polmone sinistro in paraformaldeide per 48 h. </li><li> Disidratare il polmone sinistro incubando consecutivamente in etanolo al 70% (1 h), 80% di etanolo (1 h), 90% di etanolo (1 h), 100% di etanolo (3 h), xilolo (2 h), e paraffine ( 2 h). </li><li> Incorporare polmone sinistro in paraffina, con l&#39;ilo del polmone di fronte alla cassetta. </li><li> Macchiare le sezioni polmonari 4 micron inclusi in paraffina utilizzando una colorazione Verhoeff o Elastica-van Gieson, secondo le istruzioni del produttore 29. Assicurarsi che le lamine elastiche sono ben differenziate (come in figura 3). Eseguire la scansione delle sezioni colorate a 40X di ingrandimento. </li><li> Dividere il polmone in 4 quadranti. In ogni quadrante, trovare 10 navi con un diametro esterno &lt;50 micron (intra-acinose) e 10 navi con un diametro esterno&gt; 50 micron (pre-acinose). Scatta una foto (2 x 40 immagini al polmone). Zoom in maniera casuale fino a 20x e fotografare ogni vasoin questo campo di vista per minimizzare errori di selezione. </li><li> Esclusione navi che hanno / minor rapporto più lungo diametro&gt; 2, di forma circolare incompleta, o un crollo di più di un quarto della parete del vaso. NOTA: Un esempio di un recipiente escluso è mostrato in Figura 3b Rendere ogni immagine sullo stesso ingrandimento (40X) e comprendono una barra di scala. </li><li> Aprire ImageJ e la prima immagine. Tracciare una linea retta sulla barra di scala nella foto per impostare la scala tramite &quot;Analyse&quot; e &quot;Set scala.&quot; Per &quot;distanza nota,&quot; utilizzare il valore sulla barra della scala dell&#39;immagine. Utilizzare micrometri (micron) come unità di lunghezza. Impostare la scala al globale. </li><li> L&#39;utilizzo di &quot;selezioni a mano libera,&quot; disegnare una linea sul bordo interno della superficie luminale (Figura 3), e l&#39;uso &quot;su misura&quot; (Crtl m) per misurare questa zona. Poi, tracciare una linea intorno al elast esternoic lamina (figura 3) per misurare l&#39;area totale recipiente. </li><li> Calcolare il luminale e diametro esterno ( <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq1.jpg" /> ) usando <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq2.jpg" /> . </li><li> Calcolare lo spessore della parete utilizzando <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq3.jpg" /> . </li><li> Calcolare il rapporto parete / lume utilizzando <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq4.jpg" /> . </li><li> Calcolare il punteggio di occlusione tramite <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55065/55065eq5.jpg" /> . </li><li> Punteggio l&#39;imbarcazione su muscolarizzazione (no, parziale o totale muscolarizzazione) (Figura 3B). NOTA: imbarcazioni con una doppia lamina elastica per più della metà della circonferenza sono definiti come totalmente muscularized. Le navi con una doppia lamina elastica inferiore alla metà della circonferenza sono definite come parzialmente muscularized. </li><li> Punteggio l&#39;imbarcazione sulla presenza di un Neointima (sì o no) (Figura 3C). NOTA: le navi senza lamina elastica interna ben definita in combinazione con occlusione (spesso eccentrico) luminale sono definiti come lesioni neointimale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo descrive la procedura chirurgica di uno shunt aorto-cavale nei ratti pre-trattati con MCT per creare PAH indotto dal flusso e le tecniche per valutare il principio emodinamico e punti finali istopatologici che caratterizzano PAH e questo modello. I passaggi critici all&#39;interno del protocollo e risoluzione dei problemi Chirurgia e post-operatorio. Durante l&#39;intervento shunt aorto-cavale, la fase più critica è la dissezione dell&#39;aorta e vena ...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di creare un modello riproducibile per grave ipertensione arteriosa polmonare indotto dal flusso in ratti e misurare il suo principio emodinamico e finale istopatologici. Arteriosa polmonare (PAH) è una sindrome clinica che comprende un progressivo aumento della resistenza vascolare polmonare che porta a insufficienza ventricolare destra e di morte. All&#39;interno dello spettro malattia sovraordinata malattie ipertensive polmonari (PH), PAH è la forma più grave e uno che rimane senza cura 1. L&#39;arteriopatia sottostante PAH è caratterizzata da una forma tipica di rimodellamento vascolare che occlude il lume del vaso. Muscolarizzazione delle navi e l&#39;ipertrofia dello strato nave mediale normali non muscularized sono considerati come fenomeni malattia precoce in PAH, sono visti anche in altre forme di PH 2, e si pensa di essere reversibile 3. Come PAH undvances, lo strato intimale inizia a rimodellare, eventualmente formando caratteristiche lesioni neointimale 2. Neointimale-tipo rimodellamento vascolare polmonare è esclusivo di PAH ed è attualmente considerato essere irreversibili 4. Come PAH è una malattia rara, i progressi nella sua comprensione patobiologico e lo sviluppo di nuove terapie hanno fatto affidamento su modelli animali. L&#39;(MCT) modello monocrotalin nei ratti è un semplice modello singolo di successo che è stato, ed è tuttora, utilizzato di frequente. MCT è una tossina che provoca lesioni alle arteriole polmonari e infiammazione regionale 5. 60 mg / kg MCT porta ad un aumento nella pressione media arteriosa polmonare (mPAP), resistenza vascolare polmonare (PVR), e ipertrofia ventricolare destra (RVH) dopo 3 - 4 settimane 6. Il istomorfologia è caratterizzata da ipertrofia isolato mediale senza lesioni neointimale 5. la MCTratto rappresenta quindi una forma moderata di PH, e non PAH, anche se è comunemente presentato come quest&#39;ultimo. Nei bambini con PAH associata con uno shunt congenito sinistra a destra (PAH-CHD), aumento del flusso sanguigno polmonare è considerato come trigger essenziale per lo sviluppo di lesioni neointima 7, 8, 9. Nei ratti, aumento del flusso sanguigno polmonare può essere indotta dalla creazione di uno shunt tra l&#39;aorta addominale e la vena cava, una tecnica descritta nel 1990 10. Alternative per la creazione di un aumento del flusso polmonare sono da pneumonectomia unilaterali o succlavia di arteria polmonare anastomosi 11. svantaggi concettuali di questi modelli sono composti da un potenziale di crescita compensatoria del restante polmone e l&#39;attivazione della via adattativa indotta dalla pneumonectomia, o di danni iatrogeni del sistema vascolare polmonare dovutaper anastomosi arteria polmonare, sia confondendo gli effetti di aumento del flusso sanguigno polmonare. Quando si crea uno shunt aorto-cavale e aumento del flusso sanguigno polmonare è indotta da un secondo colpo in ratti MCT-trattati, lesioni neointimale caratteristici si verificano, e una grave forma di IPA e insufficienza del ventricolo destro associato (RVF) sviluppano 3 settimane dopo l&#39;aumento flusso 12. La progressione emodinamica della PAH in questo modello può essere valutata in vivo mediante ecocardiografia e cateterizzazione cardiaca destra. Il istomorfologia vascolare, spessore parete del vaso, il grado di arteriolare dell&#39;occlusione, ed i parametri della disfunzione ventricolare destra costituiscono i pilastri della ex vivo caratterizzazione dei PAH. Questo metodo descrive i protocolli dettagliati per la chirurgia aorto-cavale shunt (AC-shunt), il cateterismo cardiaco destro, e la valutazione qualitativa e quantitativa dei istomorfologia vascolare.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Shunt Surgery</td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td>chirurgici sterili</tr><tr><td>Duratears Unguento per gli occhi</td><td>Alcon</td><td>10380</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro-Esadina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamponi</td><td></td><td></td><td></td>di cotone</tr><tr><td>Colla tissutale istoacrilica</td><td>B. Braun Medical</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 suture nere non riassorbibili</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Suture Safil 4-0 viola riassorbibili</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G ago</td><td>Luer</td><td>NN1838R punta BD</td><td>piegata in orifizio di 45 gradi verso l'esterno</td></tr><tr><td>Garze 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Temgesic Buprenorphine</td><td>RB Pharmaceuticals</td><td>5429</td><td>sottocutaneo iniezione</td></tr><tr><td>Cloruro di Sodio 0,9%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschera di ventilazione Lama</td> per scalpo di ratto <td></td><td></td><td></td></tr> Morsetto <tr><td></td> Biemer 18 mm, apertura 5 mm&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td><a href="https://www.google.nl/url?sa=i&amp; rct=j& q=& esrc=s& fonte=immagini& cd=& cad=rja& uact=8& ved=0ahUKEwitqICpkITNAhWiL8AKHe6iCC8QjhwIBQ& url=http%3A%2F%2Fwww.agnthos.se%2Fquote%2Fquote%2Fcaturl%2Fid%2F242%2FBiemer& psig=AFQjCNEnfRXuMQ6Doi4_-2KMYu3qeRovMA& ust=1464777707579746">AgnTho</a></td><td>64-562</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino</td><td></td><td></td><td></td>termico</tr><tr><td>Kocher Clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina</td><td></td><td></td><td></td>da barba</tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cateterismo cardiaco destro</td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td> <td>chirurgici sterili</td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi</td><td>Duratears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro-Esadina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garze 10 x 10 cm</td><td>Paul Hartmann</td><td>407825</td><td></td></tr><tr><td>Silkam 5-0 suture nere non riassorbibili</td><td>B. Braun Medical</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Ago 20 G</td><td>Luer</td><td></td><td>Punta leggermente piegata verso l'interno</td></tr><tr><td>Cannula 20 G</td><td>Luer</td><td></td><td>per introdurre il catetere, punta preformata in 20 gradi</td></tr><tr><td>Catetere Silastico lungo 15 cm Sfera da</td><td></td><td></td><td>0,5 mm a 2 mm dalla punta</td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione</td><td>Ailtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor da comodino Cardiocap/5</td><td>Datex-Ohmeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasatrice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td></td><td></td> da 10 ml<td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,9%</td><td></td><td></td> <td>per lavaggio</td></tr><tr><td colspan="4">Morfologia vascolare</td></tr><tr><td>50 mL Siringa</td><td></td><td></td><td></td></tr> 4<tr><td>% Formaldeide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G cannula con tubo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit colorazione Verhoef</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&amp; region=NL">HT254</a></td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Scanner digitale per vetrini</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastic (colorazione del tessuto connettivo)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150667</td><td>http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html 
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(sito web).pdf</td></tr></tbody></table>

chirurgia shunt, destra cuore cateterizzazione, e vascolare morfometria in un modello di ratto per flow-indotta ipertensione arteriosa polmonare

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

In questo protocollo, la PAH viene indotta combinando un'iniezione di 60 mg/kg di monocrotalina (MCT) con un aumento del flusso sanguigno polmonare attraverso uno shunt aorto-cavale (MCT+Flow). Lo shunt viene creato inserendo un ago da 18 G dall'aorta addominale nella vena cavale adiacente. L'aumento del flusso polmonare si è dimostrato un fattore scatenante essenziale per una forma grave di PAH con fasi distinte di progressione della malattia, caratterizzata da ipertrofia mediale precoce seguita da lesioni neointimali e dalla progressiva occlusione dei piccoli vasi polmonari. Per misurare l'emodinamica del cuore destro e polmonare in questo modello, il cateterismo cardiaco destro viene eseguito inserendo una cannula rigida contenente un catetere flessibile a punta sferica attraverso la vena giugulare destra nel ventricolo destro. Il catetere viene quindi fatto avanzare nell'arteria polmonare principale e in quella più distale. L'istopatologia del sistema vascolare polmonare viene valutata qualitativamente, valutando i vasi pre- e intra-acinari in base al grado di muscolarizzazione e alla presenza di una neointima, e quantitativamente, misurando lo spessore della parete, i rapporti parete-lume e il punteggio di occlusione.

Risultati rappresentativi sono presentati nella Figura 4. I risultati presentati mostrano caratteristiche di MCT + FLOW nei ratti di Lewis nei seguenti gruppi: controllo (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), e MF-RVF ( n = 10). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il one-way ANOVA con correzione di Bonferroni. 60 mg / kg MCT e aumenta polmonare vantaggio il flusso di sangue ad un ...

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per creare un modello per l'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) indotta dal flusso nei ratti e le procedure per analizzare i principali endpoint emodinamici e istologici in questo modello.

Chirurgia Shunt, Destra cuore cateterizzazione, e Vascolare Morfometria in un modello di ratto per Flow-indotta ipertensione arteriosa polmonare

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Gli obiettivi generali di queste procedure sono la creazione di un modello per l'ipertensione arteriosa polmonare indotta dal flusso nei ratti e l'analisi dei suoi principali endpoint emodinamici e istologici mediante cateterismo cardiaco destro e morfometria vascolare. Presentiamo la creazione di un modello di ratto per l'ipertensione polmonare associata al flusso che è caratterizzato da un nuovo rimodellamento vascolare di tipo intimale simile all'ipertensione arteriosa polmonare umana, e che è indotto da un fattore scatenante clinicamente ben riconosciuto, vale a dire l'aumento del flusso sanguigno polmonare. Queste caratteristiche miglioreranno la traduzione dei risultati di questo modello nella malattia umana.Mostriamo anche metodi standardizzati per la valutazione emodinamica e la caratterizzazione dell'istopatologia utilizzando la morfometria quantitativa. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla scoperta e alla valutazione di nuove strategie di trattamento e consentono la valutazione degli effetti specifici sull'emodinamica polmonare e sulla morfologia vascolare. A dimostrare le procedure saranno Annemieke Smit-Van Oosten e Michel Weij, microchirurghi di questo laboratorio.Prima di iniziare l'intervento chirurgico, strofinare la pelle di un ratto anestetizzato con cloruro esadene per la disinfezione e iniettare buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia post-operatoria. Successivamente, usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana lungo l'addome, iniziando un centimetro sotto il diaframma, estendendosi fino a poco sopra i genitali. Trasferire l'intestino su una garza sterile bagnata con soluzione fisiologica allo 0,9% sul lato sinistro dell'animale e coprire l'organo con altra garza sterile bagnata.Utilizzare nuovi tamponi per separare le membrane che attaccano l'aorta addominale e la vena cava inferiore ai tessuti circostanti. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza per schegge per rimuovere il grasso aortico perivascolare appena sopra la biforcazione sul lato destro dell'aorta dove verrà inserito l'ago. Quindi, separare l'aorta e la vena cava da due millimetri al di sopra del sito, il sito di inserimento dell'ago, per creare spazio per un morsetto beamer.Ora posiziona una sutura 5-O sciolta attorno all'aorta e posiziona un morsetto Kocher sulla sutura per creare tensione sulla legatura superiore all'incisione. Posiziona il morsetto del beamer appena sopra la sutura e usa un nuovo scambio per comprimere la vena cava il più distalmente possibile per ostruire il flusso. Quindi, piega un ago calibro 18 a un angolo di 45 gradi con lo smusso rivolto verso l'esterno e, tenendo l'ago a 90 gradi rispetto all'animale, inserisci la punta dell'ago nell'aorta appena sopra la biforcazione con lo smusso rivolto a sinistra.Sezionare le membrane che racchiudono l'aorta e la vena cava quanto basta per creare una buona visibilità dell'area di inserimento dello shunt, poiché una dissezione eccessiva causerà la perdita dello shunt. Manipolare la punta dell'ago verso sinistra e inserire l'ago nella vena cava fino a quando non può essere osservato all'interno del vaso. Per prevenire la trombosi, utilizzare un nuovo batuffolo di cotone per spingere il sangue rimanente fuori dall'aorta attraverso il sito di inserimento e utilizzare una garza sterile per asciugare l'area intorno allo shunt.Rimuovere l'ago e applicare immediatamente una goccia di colla per tessuti sul sito di puntura. Quindi rimuovere la pinza dall'aorta e rilasciare manualmente la legatura sul promixale dell'aorta allo shunt. La vena cava distale allo shunt dovrebbe diventare rosso vivo e creare turbolenza nel sito dello shunt.Dopo aver verificato lo shunt, riportare l'intestino nella cavità addominale e utilizzare suture 4-0 riassorbibili per chiudere gli strati muscolari e cutanei. Quindi ventilare l'animale con ossigeno al 100% per il recupero dell'anestesia. Per il cateterismo cardiaco destro, disinfettare il collo con cloruro esadene e utilizzare una lama di bisturi numero 10 per praticare un'incisione di 1,5 centimetri nel lato ventrale destro del collo dalla clavicola destra all'osso mandibolare.Sotto il microscopio da dissezione, usa le forbici per stendere il tessuto, quindi usa una pinzetta per separare delicatamente il tessuto fino a quando non appare la vena giugulare. Sezionare le membrane attorno alla vena giugulare usando una pinza per schegge. Quindi posizionare una sutura 5-O sciolta attorno al vaso e fissare la legatura alla maschera di ventilazione per aumentare la tensione sulla vena.A valle del sito di inserimento, posizionare una legatura libera attorno al vaso. Quindi, usa i manici delle pinze per piegare leggermente la punta di un ago calibro 20 con lo smusso rivolto verso l'interno e introdurre la punta dell'ago nella vena. Posizionare rapidamente una cannula contenente un catetere all'interno del vaso e rimuovere l'ago, chiudendo la legatura a valle attorno alla cannula per fissare la cannula in posizione.Ora conduci la cannula e il catetere nella vena giugulare, manovrando la cannula sotto la clavicola per entrare nell'atrio destro. Puntare la punta della cannula verso il cuore per entrare nel ventricolo destro. Sul monitor da posto letto dovrebbe apparire una curva di pressione del ventricolo destro.Quando la curva di pressione del ventricolo destro è costante, registrare quella della pressione sistolica e diastolica del ventricolo destro e manipolare la punta della cannula verso sinistra e verso l'alto. Far avanzare il catetere all'interno della cannula, quindi far avanzare il catetere nell'arteria polmonare principale. Quando la curva della pressione dell'arteria polmonare è costante, registrare quella della pressione sistolica, diastolica e media dell'arteria polmonare.Quindi far avanzare il catetere all'interno della cannula fino a quando la sfera sulla punta del catetere non si incunea in un'arteria polmonare. Il calo della curva di pressione deve essere osservato sul monitor da posto letto. Quando la curva di pressione del cuneo è costante, registrare le pressioni sistoliche, diastoliche e medie del cuneo.Quindi tirare lentamente indietro il catetere e, guidati dalle curve sul monitor da posto letto, registrare i rispettivi valori di pressione PA e RV. Quando il catetere raggiunge il ventricolo destro, tirare leggermente indietro la cannula e il catetere e misurare la pressione atriale destra media. In questo esperimento rappresentativo, 28 giorni dopo la somministrazione di MCT e un aumento del flusso sanguigno polmonare, si osserva un aumento medio della pressione sistolica del ventricolo destro, dell'arteria polmonare sistolica e dell'arteria polmonare media.Il rapporto di peso ventricolare destro/ventricolare sinistro e settale aumenta significativamente dal giorno 14 dopo il trattamento fino allo stadio di insufficienza ventricolare destra, indicando ipertrofia del ventricolo destro. Anche il rapporto umido/secco del fegato è significativamente aumentato nella fase di insufficienza ventricolare destra, indicando edema del fegato e insufficienza ventricolare destra congestizia. La muscolarizzazione dei vasi interacinari aumenta progressivamente durante la progressione dell'ipertensione arteriosa polmonare, con quasi la metà dei vasi che presentano media muscolare totale entro il giorno 14 dopo il trattamento in quasi tutte le arteriole muscoloizzate allo stadio terminale della malattia.Inoltre, le lesioni neo-intimali sono state osservate per la prima volta al giorno 21 con circa il 65% di tutte le arteriole che presentano uno strato neo-intimale entro la fine della progressione della malattia. Ciò si traduce in un'occlusione vascolare progressiva con fino al 60% del lume occluso nella fase terminale della malattia. Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere completate in 20 minuti per tecnica.Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ecocardiografia o il loop del volume di pressione per rispondere a ulteriori domande sulla funzione ventricolare destra. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'ipertensione arteriosa polmonare per esplorare gli effetti dell'aumento del flusso sanguigno sulla vascolarizzazione polmonare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un modello per l'ipertensione arteriosa polmonare indotta dal flusso nei ratti e di come analizzarne i principali endpoint emodinamici e istologici.

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Questo articolo fornisce un protocollo per la valutazione ecocardiografica delle dimensioni del ventricolo destro e l'ipertensione polmonare nei topi. Le applicazioni includono la determinazione del fenotipo e la valutazione seriale transgenici e modelli murini tossina-indotta di cardiomiopatia e la malattia vascolare polmonare.

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L'insufficienza cardiaca destra (RHF) è caratterizzata da dilatazione cardiaca destra e ipertrofia, che porta a disfunzione ventricolare e atriale. Le condizioni cardiopolmonari associate all'RHF sono accompagnate da un aumento del rischio di aritmie cardiache. Questo articolo descrive un modello standardizzato di RHF indotta da bande arteriose polmonari associata a un aumento dell'aritmogenesi ventricolare e atriale.

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Il protocollo fornisce un'introduzione dettagliata all'esperienza dell'utilizzo del metodo di cateterismo cardiaco destro per rilevare la pressione dell'arteria polmonare nei ratti, il che aiuterà a ottenere dati accurati in modo più efficiente e a migliorare il tasso di successo dell'esperimento. Questo metodo migliora anche la riproducibilità degli esperimenti tra diversi laboratori.

Misurazione della pressione dell'arteria polmonare nei ratti tramite cateterismo cardiaco destro

Scopri come creare un modello di ipertensione arteriosa polmonare indotta da flusso nel ratto, utilizzando chirurgia shunt, cateterizzazione cardiaca destra e morfometria vascolare. Questo metodo standardizzato facilita la ricerca traslazionale.

Chirurgia Shunt, Destra cuore cateterizzazione, e Vascolare Morfometria in un modello di ratto per Flow-indotta ipertensione arteriosa polmonare (Video) | JoVE Journal

Chirurgia Shunt, Destra cuore cateterizzazione, e Vascolare Morfometria in un modello di ratto per Flow-indotta ipertensione arteriosa polmonare

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