Name: Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Scopri un metodo non chirurgico per generare tumori vescicali ortotopici non invasivi nel muscolo in topi C57BL/6J femmine. Questa tecnica consente il monitoraggio semplice per valutare terapie endovescicali.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) assegnata al professor Kesavan Esuvaranathan.

<ol><li>Gunther, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Braz+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).</li>
<li>Chan, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+orthotopic+bladder+tumor+implantation+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model.</a> J Urol. 182, 2926-2931 (2009).</li>
<li>Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+bladder+cancer+model+for+gene+delivery+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).</li>
<li>Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+oligonucleotide+therapy+cures+subcutaneous+and+orthotopic+tumors+and+evokes+protective+immunity+in+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer.</a> J Immunother. 28, 20-27 (2005).</li>
<li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+Microenvironment+Modification+during+Progression+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer.</a> Clin Dev Immunol. , 865684(2011).</li>
<li>Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+for+detecting+and+treatment+monitoring+of+orthotopic+murine+bladder+tumor+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants.</a> J Urol. 145, 1297-1301 (1991).</li>
<li>Kikuchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitative+analysis+of+early+stage+orthotopic+murine+bladder+tumor+using+in+vivo+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging.</a> J Urol. 170, 1375-1378 (2003).</li>
<li>Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+cancer%3A+improving+real-time+monitoring+and+staging+of+bladder+cancer+with+multimodal+mesoporous+silica+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles.</a> Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).</li>
<li>Tanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+bladder+cancer+in+an+orthotopic+murine+model+with+green+fluorescence+protein+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology.</a> J Urol. 170, 975-978 (2003).</li>
<li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo%3A+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic%2C+orthotopic%2C+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101, 120-124 (2008).</li>
<li>Newton, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-interleukin-10R1+monoclonal+antibody+in+combination+with+bacillus+Calmette--Guerin+is+protective+against+bladder+cancer+metastasis+in+a+murine+orthotopic+tumour+model+and+demonstrates+systemic+specific+anti-tumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity.</a> Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).</li>
<li>Patel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transabdominal+micro-ultrasound+imaging+of+bladder+cancer+in+a+mouse+model%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study.</a> Urology. 75, 799-804 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter.</a> Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).</li>
<li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li>
<li>Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+reporter+green+fluorescent+protein+under+simulated+tumor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions.</a> Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).</li>
<li>Biot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+BCG-specific+T+cells+improve+intravesical+immunotherapy+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer.</a> Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+near-infrared+cell+tracker+reagent+for+multiscopic+in+vivo+imaging+and+quantification+of+leukocyte+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses.</a> PLoS One. 2, 1075(2007).</li>
<li>Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+cells+in+peripheral+blood+in+relation+to+urinary+bladder+cancer+malignancy+indicators+before+and+after+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+Ultrasound+Imaging+of+Mouse+Cervical+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes.</a> J Vis Exp. , e52718(2015).</li>
<li>Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonographic+evaluation+of+orthotopic+bladder+tumors+in+mice+treated+with+TNP-470%2C+an+angiogenic+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+radiology%22%5BJournal%5D)">Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor.</a> Academic radiology. 8, 121-127 (2001).</li>
<li>Folin, O., Morris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+determination+of+creatinine+and+creatine+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22JBC%22%5BJournal%5D)">On the determination of creatinine and creatine in urine.</a> JBC. 17, 469-473 (1914).</li>
<li>Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+assay+based+on+colloidal+gold+conjugates+with+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin.</a> Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).</li>
<li>Shi, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+enhancement+strategy+applied+in+ECL+biosensor+based+on+closed+bipolar+electrodes+for+the+detection+of+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA.</a> Talanta. 154, 169-174 (2016).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemiluminescent+immunosensing+of+prostate-specific+antigen+based+on+silver+nanoparticles-doped+Pb+%28II%29+metal-organic+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework.</a> Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).</li>
<li>Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+electrochemical+immunosensor+for+PSA+biomarker+detection+in+prostate+cancer+cells+using+gold+nanoparticles%2FPAMAM+dendrimer+loaded+with+enzyme+linked+aptamer+as+integrated+triple+signal+amplification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy.</a> Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+comparison+of+orthologous+gene+expression+in+human+bladder+cancer+and+carcinogen-induced+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models.</a> Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Novel+Bladder+Cancer+Xenograft+Model+in+Humanized+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche nel protocollo sono 1) mantenere correttamente la tumorigenicità della linea cellulare; 2) garantire la secrezione di PSA misurabile prima dell&#39;impianto delle cellule tumorali nei topi; 3) generare una cella singola sospensione per l&#39;impianto in modo da ridurre la variazione della dimensione del tumore; e 4) instillare cellule a bassa velocità per evitare vescico-ureterale reflusso, con conseguente impianto di cellule tumorali nel rene. Dopo passaggio prolungata ...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di generare tumori della vescica murino ortotopiche e di monitorare i tumori impiantati con la massima precisione possibile, in modo che i topi senza l&#39;impianto del tumore non è pensato per essere trattato ad analisi end-point. In generale, il metodo mostrato ridurrà la necessità di un gran numero di topi per analisi sperimentale e garantire una maggiore precisione nel determinare risultati terapeutici. Lo sviluppo di un modello ortotopico per il cancro è importante, in quanto le cellule tumorali impiantare sottocute non ricapitolano l&#39;ambiente della malattia clinica o consentire lo sviluppo di strategie terapeutiche. L&#39;architettura della vescica permette l&#39;instillazione di terapie del cancro della vescica direttamente nella vescica con effetti sistemici minimi. Così, i modelli animali che ricapitolano questo ambiente, come un modello ortotopico, sono importanti per valutare nuove terapie. Le conclusioni tratte da qualsiasi set-up sperimentale sono dependent sulle limitazioni del modello. Numerose tecniche sono state sviluppate per la produzione di tumori della vescica ortotopico nei topi. Questi si affidano danneggiare lo strato glicosaminoglicano della vescica, consentendo cellule tumorali da impiantare. Le tecniche utilizzate comprendono elettrocauterizzazione, che si traduce in un unico punto di danno nella parete della vescica, con conseguente sviluppo del tumore in un sito nella vescica 1,2. Tuttavia, il tasso di successo di impianto tumore, utilizzando elettrocauterizzazione è operatore-dipendente variabili da 10 - 90%, e comprende il pericolo che la parete della vescica viene perforato, portando a sviluppare tumori nella cavità peritoneale. Cauterizzazione chimica viene eseguita utilizzando nitrato d&#39;argento, che danneggia la parete della vescica 3. Analogamente, l&#39;acido è stato usato per danneggiare la parete della vescica 4. Tripsina è stato utilizzato anche per danneggiare la vescica e 5. Questi metodi possono provocare lo sviluppo di più di un tumore nella vescica.Inoltre, vi è il rischio di gravi danni alla vescica se le sostanze chimiche vengono lasciati a contatto con la parete della vescica per troppo tempo. Il metodo sviluppato da Ninalga et al. utilizza il poli-L-lisina carica positiva (PLL) 6 molecole per rivestire la parete della vescica; Questo permette alle cellule tumorali carica negativa ad attaccarsi al livello glicosaminoglicano della vescica. Questo metodo comporta generalmente più di un tumore sviluppare nella vescica, ma tumorale impianto è a 80 - 100% 4,7. Tecnicamente, è anche la procedura più semplice da eseguire. Per garantire che i tumori che si sviluppano sono abbastanza anche in dimensioni, è importante che le cellule tumorali non vengono raggruppati in grandi ciuffi prima dell&#39;impianto. Per valutare l&#39;efficacia terapeutica, è meglio effettuare questo studio su topi con tumori abbastanza di dimensioni simili. Così, un buon sistema di rilevamento che possono quantificare le dimensioni del tumore subito dopo l&#39;impianto è importante. Diverse strategie sono apen usato per valutare i tumori. Questi includono la risonanza magnetica (MRI) 8-10, fluorescenza 11, bioluminescenza 12,13, ultrasuoni 14, e il dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) 15,16. Mentre MRI e ultrasuoni non richiedono modifiche delle cellule tumorali, vi è la necessità di attrezzature e contrasto sensibili agenti per MRI. I saggi fluorescence-, luminescence-, e basati su ELISA richiedono modifiche delle cellule tumorali per esprimere proteine ​​marker che possono essere rilevati da questi metodi. Per luminescenza, un substrato è necessaria per la rilevazione dell&#39;attività di luciferasi; vi è quindi un passo aggiunto e aumento dei costi. Sia luminescenza e fluorescenza richiedono attrezzature specializzate. Per produrre fluorescenza, proteina fluorescente verde (GFP) ciclizzazione, che viene catalizzata da ossigeno molecolare, è necessaria. Così, l&#39;espressione della GFP può essere variabile all&#39;interno di una massa tumorale seconda accesso ad ossigeno, rendendo questo un indicatore piuttosto affidabile <sup&gt; 17. La modifica della linea di cellule murine cancro alla vescica MB49 a secernere prostatico umano Specific Antigen (PSA) 15,16 come marker surrogato è un&#39;altra strategia. Questi marcatori forniscono anche un mezzo alternativo di conferma presenza del tumore al termine dell&#39;esperimento, rendendoli alternativa alla immunoistochimica. Questo studio riporta il metodo PLL di impianto del tumore ortotopico e presenta un confronto tra sistemi di rilevamento del tumore, cioè ELISA, la fluorescenza, e imaging ad ultrasuoni.

<table><tbody><tr><td>Cellule MB49-PSA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ref (Wu QH, 2004)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media</td><td>Biowest</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS) South American</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS) Sud America, Premium</td><td>Biowest</td><td>S181B</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Biowest</td><td>X0550</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>libero PSA (umano) Kit ELISA Abnova</td><td></td><td>KA0209</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente per l'estrazione dell'RNA&nbsp;</td><td>Kit</td> di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità <td>Ambion 15596026</td><td></td></tr><tr><td>con inibitore della RNasi</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay &ndash; Mouse Actb</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>Mm00607939_s1</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay &ndash; Human KLK3</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>Hs00426859_g1</td></tr><tr><td>C57BL / 6J topi femmina</td><td>In Vivos</td><td></td><td>4 - 6 settimane vecchio</td></tr><tr><td>Anestesia (75 mg / kg ketamina e 1 mg / kg medetomidina)</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Farmaco di inversione (1 mg/kg Atipamezolo)</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Punzone per orecchio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72893-01</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico in soluzione di Hartmann o lattato di sodio composto</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Unguento lubrificante oculare sterile Duratears</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat pack - Scaldamani HotHands</td><td>Heatmax Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catetere Introcan Certo IV</td><td>B Braun</td><td>4251300</td><td>24 G x 3/4&Prime;</td></tr><tr><td>Aquagel Gelatina lubrificante</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina, 0,01%,</td> <td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, senza EDTA Inibitore della proteasi Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Quantichrom Kit di dosaggio della creatinina Quantichrom</td><td>BioAssay Systems</td><td>DICT-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colorante fluorescente - VivoTrack 680</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV12000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di transizione tissutale congelata RNAlater-ICE</td><td>Ambion</td><td>4427575</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzature e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 Sistema PCR in tempo reale</td><td>applicato Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 Software v2.3</td> Gabbia metabolica <td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecniplast&nbsp;</td><td>Scaffale di tipo verticale per 12 gabbie</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto I system&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS SpectrumCT in vivo sistema di imaging&nbsp;</td><td>Calibro Scienze della Vita&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software v3.1</td><td>Calibro Scienze della Vita&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging Vevo 2100&nbsp;</td><td>VisualSonics&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore detection system

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica in topi C57BL / 6J femmina utilizzando la linea cellulare di cancro alla vescica murino MB49, che è stato modificato a secernere prostatico umano specifico (PSA), e la procedura per la conferma di impianto del tumore. In breve, i topi vengono anestetizzati con farmaci iniettabili e sono fatti per porre in posizione di dorsale. L&#39;urina è liberata dalla vescica e 50 ml di poli-L-lisina (PLL) viene lentamente instillato ad una velocità di 10 microlitri / 20 s utilizzando un catetere 24 G IV. Si lascia in vescica per 20 min in tappatura catetere. Il catetere viene rimosso e PLL è lasciata libera entro una leggera pressione sulla vescica. Questa è seguita da instillazione della linea cellulare di cancro alla vescica murino (1 x 10 5 cellule / 50 mL) ad una velocità di 10 ml / 20 s. Il catetere viene tappo per evitare evacuazione prematura. Dopo 1 h, i topi sono fatti rivivere con un farmaco inversione, e la vescica è liberate. Il tasso di instillazione lento è importante,poiché riduce il reflusso vescico-ureterale, che può causare tumori a verificarsi nel tratto urinario superiore e nei reni. La linea cellulare dovrebbe essere ben risospeso per ridurre aggregazione di cellule, come questo può portare a dimensioni tumorali irregolari dopo l&#39;impianto. Questa tecnica induce tumori con elevata efficienza. La crescita del tumore è monitorato da urinario secrezione di PSA. monitoraggio marcatore PSA è più affidabile di ultrasuoni o la fluorescenza per la rilevazione della presenza di tumori nella vescica. I tumori nei topi generalmente raggiungono una dimensione massima che influisce negativamente la salute di circa 3 - 4 settimane, se non trattata. Monitorando la crescita tumorale, è possibile differenziare topi che sono stati curati da quelli che non sono stati impiantati con successo con tumori. Con solo l&#39;analisi end-point, quest&#39;ultimo può essere erroneamente assume che sono stati curati con la terapia.

secrezione di PSA da cellule MB49 è risultata variare con i mezzi di crescita. MB49-PSA viene coltivato in DMEM media, perché questo si traduce in un aumento della secrezione del PSA (Figura 1A). Per determinare la sensibilità del PSA ELISA e PCR in tempo reale, diverso numero di MB49-PSA-secernenti cellule sono state mescolate con cellule parentali MB49. PSA ELISA rileva un minimo di 1 x 10 5 cellule secernenti PSA / 1 x 10 6 cellule (Figur...

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.

Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

L'obiettivo generale di questo metodo non chirurgico è produrre in modo costante tumori ortotopici della vescica non invasivi del muscolo in modelli murini, facilmente monitorabili per la valutazione di terapie intravesicali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro della vescica, come la valutazione di nuove terapie intravesicali.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice impiantare tumori nei topi e monitorarne la crescita, il che permette di determinare con precisione le risposte alle terapie. Un giorno prima dell'impianto, quando le cellule sono confluenti all'80%, effettuare il passaggio delle cellule tumorali MB49 PSA in mezzo DMEM completo con un rapporto di suddivisione uno a due. Nel giorno della procedura, raccogliere e contare le cellule, assicurandosi che siano sufficientemente vitali.Mescolare un volume uguale di sospensione cellulare e Trypan Blue al 4% e contare le cellule vive colorate di blu utilizzando un emocitometro. Le cellule dovrebbero avere una vitalità di almeno l'80%. Successivamente, risospendere le cellule a due milioni per millilitro in un tubo da centrifuga da 15 millilitri e lavarle tre volte in DMEM.Successivamente, mantenerle fredde fino al momento dell'iniezione. Una volta che un topo femmina è stato anestetizzato, fornire idratazione mediante un'iniezione intraperitoneale di soluzione di Hartmann alla dose di 1 millilitro per 10 grammi di peso corporeo. Ripetere l'operazione ogni una o due ore durante l'anestesia.Successivamente, applicare un unguento oftalmico sterile su entrambi gli occhi, riapplicando secondo necessità. Poi, posizionare il topo in posizione supina su fazzoletti di carta sopra un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea. Successivamente, fissare le zampe posteriori con del nastro adesivo.Ora applicare una pressione delicata sulla regione addominale inferiore e raccogliere l'urina in un tubo da 1,5 millilitri per misurare il livello basale di PSA urinario. Successivamente, caricare una siringa da un millilitro con PLL sterile e collegare un catetere endovenoso da 24 gauge, rimuovendo prima l'ago guida. Applicare del lubrificante sulla punta del catetere.Quindi, inserire il catetere nell'uretra e, utilizzando pinze, guidarlo fino alla vescica. Fermarsi quando si avverte una resistenza. Successivamente, espellere lentamente 50 microlitri di PLL a un ritmo di 10 microlitri ogni 20 secondi per evitare il reflusso vescico-ureterale.Lasciare ora il catetere nella vescica per 20 minuti, utilizzando un tappo per prevenire il flusso in uscita. Dopo 20 minuti, rimuovere il catetere e svuotare la vescica di qualsiasi contenuto premendo delicatamente sull'addome inferiore. Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro, espellere qualsiasi residuo presente all'interno del catetere.Ora miscelare accuratamente le cellule MB49 PSA mediante pipettaggio e caricarle in una siringa da 1 mL. Applicare il catetere e lubrificarlo come in precedenza. Inserire il catetere nella vescica come in precedenza.E iniziare iniettando le cellule, con un'eiezione graduale di 10 microlitri ogni 20 secondi. Attendere quindi un'ora. Trascorsa un'ora, rimuovere il catetere e svuotare la vescica da qualsiasi contenuto.Quindi, rilasciare il mouse posizionandolo sul lato ventrale e rivitalizzarlo con un'iniezione di atipamezolo. Ora, monitorare il mouse fino a quando recupera la decubito sternale, quindi riporlo nella sua gabbia di provenienza. Si è scoperto che la secrezione di PSA da parte delle cellule MB49 varia in base al mezzo di coltura.Il mezzo DMEM viene utilizzato perché ha determinato la maggiore secrezione di PSA. Per determinare la sensibilità del saggio ELISA per il PSA, diversi numeri di cellule MB49 secernenti PSA sono stati mescolati con cellule MB49 parentali. Il saggio ha rilevato almeno 100.000 cellule secernenti PSA per ogni milione di cellule.Il metodo PLL di impianto tumorale determina lo sviluppo di tumori multipli nella vescica. Sia i campioni di urina raccolti durante la notte mediante gabbie metaboliche sia i campioni di urina spot possono essere utilizzati per misurare il PSA mediante ELISA. Per tutti gli studi sugli animali, il peso del topo è stato registrato come indicatore di stato di salute.Il PSA urinario viene monitorato su base settimanale come indicatore della crescita tumorale. A ciascun topo è stata applicata una terapia diversa, con conseguente sviluppo di tumori di dimensioni differenti. Due settimane dopo l'innesto, le vesciche sono state prelevate ed elaborate.Le dimensioni dei tumori variavano, e le misurazioni del PSA prevedevano questo andamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre tumori ortotopici della vescica nei topi e monitorarne la crescita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore per topo.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che le cellule siano ben miscelate prima dell'impianto e di effettuare l'impianto a un ritmo lento. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi citometrica in flusso dell'Uvm o il saggio ELISA, al fine di studiare l'attivazione immunitaria post-trattamento.

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