Un Cell Carcinoma Singenico modello murino di renale metastatico per quantitativo e longitudinale Valutazione della preclinici Terapie

Attuazione di un modello ortotopico di carcinoma renale nei topi immunocompetenti offre al ricercatore un sistema clinicamente rilevante definito dalla presenza di un tumore e metastasi polmonari primarie renali nello stesso animale. Questo sistema può essere utilizzato per testare preclinica una varietà di trattamenti in vivo.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire tumori renali ortotopici murini attraverso l'impianto intrarenale di cellule tumorali per lo studio della crescita e delle metastasi tumorali e l'efficacia delle terapie antitumorali. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo dell'oncologia urologica, come l'efficacia di una nuova terapia in un modello preclinico di cancro del rene. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'impianto intrarenale del tumore stabilisce un tumore renale primario che metastatizza il polmone primario imitando la patogenesi clinica del carcinoma a cellule renali

Per preparare le cellule tumorali Renca staccare prima la coltura cellulare con tripsina allo 0,25% e HBSS dopo aver risciacquato con PBS. Neutralizza la reazione dopo cinque minuti con Complete RPMI Medium. Trasferire le celle in una provetta conica per la centrifugazione e risospendere il pellet in HBSS fresco.

Dopo il conteggio, regolare il volume a una concentrazione di due volte dieci per sei cellule per millilitro nell'HBSS e aspirare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 18. Quindi, posizionare un telo chirurgico sterile su un termoforo e confermare il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi. Rimuovere i peli dal fianco sinistro del topo e applicare un unguento veterinario sugli occhi.

Quindi tamponare il sito di impianto con antisettico allo iodio povidone al 5% e utilizzare un bisturi sterile per praticare un'incisione singola da uno a un centimetro e mezzo sul fianco sinistro, facendo attenzione a non penetrare nel peritoneo. Usando le forbici, separare il derma dal peritoneo, tamponando il sito di incisione con una garza di cotone sterile per rimuovere il sangue. Quindi afferrare la testa con la mano sinistra e sostenere il fianco con la mano destra per individuare la milza attraverso il peritoneo.

Usando un dito della mano destra, palpare il mouse da sotto. Il rene dovrebbe diventare visibile. Mantenendo una presa salda sull'animale per fornire tensione attraverso il peritoneo e il rene, chiedi a un assistente di erogare lentamente 0,1 millilitri di cellule Renca attraverso il peritoneo intatto al centro del rene.

Tenere l'ago in posizione per cinque-10 secondi per ridurre il riflusso delle cellule. Quindi, chiudere l'incisione con un sottile strato di adesivo tissutale cianoacrilato. Al punto finale sperimentale, usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana, iniziando dalla metà dell'addome attraverso la gabbia toracica, il collo e le ghiandole salivari.

Usando forbici e pinze, rimuovere con cura le costole senza compromettere il tessuto polmonare e rimuovere il tessuto connettivo per esporre la trachea. Riempire una siringa da tre millilitri dotata di ago calibro 18 con inchiostro di china al 10% e PBS. Quindi usa una pinza per infilare con cura una sutura di seta sotto la trachea e poi fai un nodo sciolto.

Successivamente, inserire con cautela l'ago nella trachea e gonfiare lentamente i polmoni con uno o un millilitro e mezzo di soluzione di inchiostro di china. Tirare il nodo stretto attorno alla trachea per inibire il riflusso dell'inchiostro, quindi rimuovere l'ago e tagliare via con cura il tessuto connettivo per rimuovere i polmoni gonfiati. Fissare i polmoni in una provetta conica da 15 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione di Fekete in una cappa chimica a temperatura ambiente.

Dopo 24-48 ore, rimuovere i polmoni intatti e decolorati e separare con cura i lobi in una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri. Quindi contare il numero di noduli tumorali bianchi al microscopio da dissezione. Un impianto intrarenale di cellule Renca di topo di successo provoca lo sviluppo di tumori nel rene e metastasi ai polmoni con animali portatori di tumore che dimostrano un robusto carico tumorale misurato dall'aumento del peso dei reni impiantati nel tumore.

Come osservato, i tumori Renca possono essere identificati mediante colorazione immunoistochimica per la citocheratina otto e 18. L'impianto di una linea cellulare Renca che esprime luciferasi consente il monitoraggio del carico tumorale nel rene e delle metastasi al polmone mediante imaging bioluminescente, come ulteriormente confermato dall'inflazione polmonare india. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di cinque minuti per mouse se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di identificare chiaramente il rene attraverso il peritoneo per garantire un accurato impianto intrarenale del tumore. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i test preclinici sui farmaci, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio in che misura il nuovo farmaco influisce sulla crescita o sulle metastasi dei tumori intrarenali? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'impianto intrarenale di cellule tumorali per stabilire tumori renali ortotopici nel topo.

Non dimenticare che lavorare con animali vivi e strumenti chirurgici può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come seguire le linee guida istituzionali sulla manipolazione degli animali e mantenere un'area chirurgica e gli strumenti sterili.