Name: Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Scopri l'elettroforesi capillare per l'analisi delle isoforme di anticorpi monoclonali. Questo protocollo dettagliato migliora le competenze del personale nei laboratori di chimica analitica.

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Gli autori ringraziano Wiley per il permesso concesso di utilizzare i concetti della seguente pubblicazione per questo tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analisi di anticorpi monoclonali ricombinanti mediante elettroforesi della zona capillare. Elettroforesi. 2013. 34. 1133-1140. Diritti d'autore Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Questo lavoro è stato sostenuto da CONACyT, Messico, sovvenzione 230551.

1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione BGE. <ol><li> Preparare 100 ml di una soluzione costituita da 0,05% (m / v) di cellulosa idrossi propil metil (HPMC), 200 mM ε-ammino n-caproico (EACA) e 30 mM acetato di litio. NOTA: Come HPMC è un polimero viscoelastico, versare la polvere in un bicchiere di vetro, aggiungere 80 ml di acqua ed infine aggiungere la barra di agitazione. Continuare ad aggiungere i restanti reagenti come normalmente. Indossare occhiali di sicurezza durante la manipolazione di acetato di litio in quanto può causare irritazione agli occhi. </li><li> Regolare pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) di acido acetico. Lasciare che la soluzione si stabilizzi per 5 minuti e regolare, se necessario. </li><li> Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 100 ml in pallone tarato. </li><li> Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 7 giorni. </li></ol></li><li> Preparare lo standard interno. <ol><li> Preparare 1 mLdi una soluzione composta da 1% (m / v) di istamina. </li><li> Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno. </li></ol></li></ol> Preparazione 2. campione <ol><li> Preparare 180 microlitri di campione mAb diluito con tampone Tris (50 mM tris (idrossimetil) amminometano, pH 8,0) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di 1% (m / v) di istamina. </li><li> Mescolare e centrifugare a 1000 xg per 5 sec. </li><li> Posizionare un micro fiala all&#39;interno di una fiala universale. </li><li> Trasferire il campione nel micro fiala e tappare la fiala universale. Versare il campione verso l&#39;alto per non introdurre bolle. </li><li> Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno. </li><li> Posizionare la fiala universale (con micro flacone contenente la soluzione di esempio) nel vassoio di ingresso del campione. </li></ol> 3. Preparazione del sistema CE. <ol><li> Sistema CE di pulizia. NOTA: Comportamento °è operazione almeno una volta alla settimana per evitare perdite di corrente elettrica derivata da accumulo di polvere e detriti. Tuttavia, a seconda dell&#39;applicazione (per esempio, l&#39;uso di un BGE con maggiore viscosità o ad alta concentrazione salina, campioni con un aumento di viscosità) elettrodi e leve di apertura può richiedere di essere pulito più frequentemente per evitare la contaminazione incrociata e trascinamento del campione. <ol><li> Spegnere l&#39;interruttore di alimentazione dello strumento CE e aprire lo sportello anteriore. </li><li> Pulire la superficie della copertura del campione, campione tenendo sistema (campione e tampone vassoi), copertura della cartuccia, barra di bloccaggio, blocco dell&#39;interfaccia e gli elettrodi con un inumidito con acqua non tessuto wipe. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire e asciutto prima dell&#39;uso. </li><li> Lavare le leve di apertura a fondo con acqua. Pulire la superficie con un tessuto non tessuto pulire. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire ed asciugare prima dell&#39;installazione. </li><li> Pulire le due estremità del cavo in fibra ottica attentamente con un panno in microfibra inumidito con acqua. Ripetere la procedura con un panno inumidito etanolo. </li></ol></li><li> Cartuccia. <ol><li> Rimuovere un nuovo capillare neutra (50 micron di diametro interno) dalla confezione. </li><li> Nastro giù una estremità del capillare tubo protettivo al banco da lavoro. Srotolare, raddrizzare e tirare il capillare fuori il tubo. </li><li> Attaccare un pezzo di nastro o di carta al banco da lavoro e aggiungere contrassegni di misura come segue: lunghezza al rivelatore (30 cm), la finestra capillare (0,2 cm) e lunghezza all&#39;estremità di uscita (10 cm) (cioè, lunghezza 40,2 cm totale, 30.0 cm di lunghezza efficace). </li><li> Allineare la finestra capillare per il marchio di misura 0,2 centimetri nel documento di riferimento. Fissare il capillare con nastro e segnare l&#39;estremità del capillare 2 mm al di fuori delle marche di stazza. </li><li> Tagliare il cappuccio protettivo all&#39;estremità di entrata capillare (l&#39;estremità più lontana dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.<ol><li> Immergere l&#39;estremità capillare in una fiala universale ricoperto riempita con acqua al fine di evitare danni permanenti al rivestimento interno capillare. Ripetere questa procedura ogni volta che l&#39;estremità capillare è esposto al ambiente per più di 1 min. </li></ol></li><li> Inserire l&#39;estremità di ingresso capillare sul lato di uscita della cartuccia. </li><li> Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando la finestra capillare è centrato alla finestra cartuccia. </li><li> Inserire la spina di apertura (100 micron x 200 micron) nella finestra cartuccia. NOTA: Verificare che la luce bianca passa attraverso la finestra quando esposti ad una sorgente di luce bianca. Se la luce che passa attraverso ha un aspetto brunastro, regolare come necessario. </li><li> Inserire il capillare nel tubo del liquido di raffreddamento preformato per una lunghezza totale capillare di 40,2 cm (con dado tubi pre-installato, puntale e O-ring ad entrambe le estremità in questo ordine). </li><li> Spingere il capillare attraverso il coolantubazione t necessaria fino a quando il capillare appare all&#39;altro lato del tubo. </li><li> Inserire l&#39;estremità del tubo refrigerante nel lato di uscita della cartuccia e serrare il dado tubo. </li><li> Inserire l&#39;estremità di ingresso capillare nel lato di ingresso della cartuccia. </li><li> Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando il capillare appare al lato ingresso della cartuccia. </li><li> Inserire l&#39;estremità del tubo del refrigerante nel lato di entrata della cartuccia e serrare il dado tubo. </li><li> Tagliare il cappuccio protettivo sulla estremità di uscita capillare (l&#39;estremità più vicina dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione. </li><li> Inserire le clip di tenuta-fermo sulle estremità dei capillari e premere per scattare in posizione. Effettuare il controllo visivo termina la capillare. Se non lo sono nemmeno, ripetere la procedura. </li><li> Posizionare il modello capillare lunghezza sul bordo del banco di lavoro. </li><li> Posizionare la cartuccia rivolta verso il basso against il modello capillare di lunghezza e allineare l&#39;estremità del capillare con le linee di riferimento sul modello. Se i segni di misura capillare (vedi 3.2.4) non si allineano con le linee di riferimento, regolare come necessario. </li><li> Mantenere il capillare contro il modello capillare di lunghezza e tagliare entrambe le estremità del capillare utilizzando il bordo a filo della scissione pietre 2 mm al di sotto delle linee di riferimento del modello. </li><li> Controllare visivamente il capillare si conclude con una lente di ingrandimento. Se estremità capillari non sono uniformi, lustrare utilizzando il volto morbido della pietra scissione. </li><li> Inserire l&#39;O-ring di apertura nel foro del tappo apertura utilizzando lo strumento di inserimento O-ring. </li><li> Installare fiale universali ricoperti pieni d&#39;acqua nel bossolo e la cartuccia posto in caso immediatamente con le estremità dei capillari inserite in fiale. Per la conservazione a breve e lungo termine, tenere a 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione dei vassoi tampone. <ol><li> Riempire e mettere univers innevateAl fiale in ingresso del buffer e vassoi di uscita (figura 1). le posizioni delle fiale si ripetono in corsie 2, 3, 4 e 5 secondo con il numero di campioni da analizzare, ponendo una corsia per ogni sei iniezioni di campione. NOTA: evitare di bagnare i tappi dei flaconi al fine di evitare la dispersione di corrente. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Figura 1: Posizione e livello di riempimento di fiale universali nei vassoi di entrata e uscita del buffer. Riempire i livelli: 1/1 = 1400 ml, 3/4 = 1300 ml e 1/2 = 1000 ml. Abbreviazioni: W = acqua, HCl = 0,1 M di acido cloridrico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Sistema CE componenti di assemblaggio. <ol><li> Installare il rivelatore UV. </li><li> Installare le leve di aperturapremendo fino al blocco di interfaccia. </li><li> Installare il cavo in fibra ottica. Inserire l&#39;estremità corrispondente alla barra di bloccaggio e, tenendo entrambe le estremità, ruotare in senso orario. Collegare l&#39;altra estremità al rivelatore UV. NOTA: Maneggiare il cavo in fibra ottica con cura durante questa procedura poiché flessione potrebbe causare la sua frattura. </li><li> Collocare il campione e vassoi di buffer nel sistema di campionamento detenzione e scattano in posizione. </li><li> Posizionare la cartuccia capillare nel blocco di interfaccia e, mentre premendo la barra di serraggio a entrambe le estremità, serrare le manopole. </li></ol></li></ol> 4. Metodi Instrument Set-up <ol><li> Creare il condizionamento, esecuzione e metodi strumentali arresto secondo i seguenti parametri e Tabella 1: Tensione, max: 30,0 kV; Corrente, max: 300.0 μA; Temperatura di cartuccia: 20.0 ° C; temperatura di conservazione del campione: 10,0 ° C; rivelatore UV condizioni iniziali: Lunghezza d&#39;onda: 214 nm; Velocità dati: 4 Hz; Filtro: Normal; Larghezza di picco (punti): 16-25; Segnale di assorbanza: Direct. NOTA: tasso di acquisizione dei dati può essere aumentata fino a 25 Hz per migliorare la copertura di zone di separazione strette. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Condizionata programma orario metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td> fiala outlet </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td> &lt;td&gt; Acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 10.0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Indipendente - Tensione </td><td> 15,0 KV </td><td> 10.0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polarità normale </td><td> Separato </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2758 mbar </td><td> 10.0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Inoltrare </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> punte di risciacquo </td></tr><tr><td colspan="8"> L&#39;esecuzione del programma di tempo metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td&gt; fiala di uscita </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Iniettare - Pressione </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Override, Forward </td><td> iniezione del campione </td></tr><tr><td> - </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc vial 6 </td><td> LAVAGGIO </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Indipendente - Tensione </td><td> 15,0 KV </td><td> 30.0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polarità normale, In / Out inc vial 6 </td><td> Separazione del campione </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> Autozero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> smettere di dati </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Avanti, In / Out inc vial 6 </td><td> acqua </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc vial 6 </td><td> punte di risciacquo </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Fine </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Fine </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown programma orario metodo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valore </td><td> Durata </td><td> fiala di ingresso </td><td> fiala outlet </td><td> sommario </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Inoltrare </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Risciacquare - Pressione </td><td> 2068 mbar </td><td> 6.0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Inoltrare </td><td> acqua </td></tr><tr><td> - </td><td> Lamp - Spento </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Aspetta </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> punte di risciacquo </td></tr></tbody></table> Tabella 1: condizionamento, esecuzione e programmi orari di spegnimento. 5. acquisizione ed elaborazione dati <ol><li> Programmare il campionario. <ol><li> Programmare il capillare per condizionare utilizzando il metodo dello strumento condizionata. Quando si utilizza il capillare per la prima volta, il programma quattro ripetizioni; altrimenti programmare solo due ripetizioni del metodo di condizionamento. </li><li> Programmare i campioni da analizzare con il metodo dello strumento in esecuzione. </li><li> Programmare il capillare per la memorizzazione utilizzando il metodo dello strumento di arresto e ripetere la procedura indicata nella sezione 3.2.22. </li></ol></li><li> Simula. </li><li> Esportare i elettroferogrammi. </li><li> Calcolare il tempo di migrazione ed il contenuto percentuale di base, un principaleisoforme acidi nd utilizzando l&#39;integrazione linea dislivello del profilo dell&#39;elettroferogramma. </li></ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

Gli autori Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz e Emilio Medina-Rivero sono dipendenti di Probiomed S.A. de C.V., che sviluppa, produce e commercializza prodotti biosimilari. Tutti gli autori sono coinvolti nello sviluppo di prodotti biosimilari per Probiomed.

In questo tutorial, si evidenzia l&#39;importanza di pratiche corrette per lo svolgimento di analisi CZE di anticorpi monoclonali, al fine di aumentare la probabilità di avere successo. Tuttavia, quando CZE viene utilizzato su una base di routine, i problemi sorgono inevitabilmente 12. Per ottenere i migliori risultati, è importante seguire le note che sono stati inclusi in tutto il protocollo, in quanto vi aiuterà l&#39;analista a superare e risolvere i problemi passaggi difficil...

Gli anticorpi monoclonali (MAK, MAB) sono proteine bioterapeutici con crescente interesse a causa della loro capacità di agire contro diverse malattie croniche e degenerative 1. Come altre biomolecole, mAbs sono inclini a subire numerose modifiche fisico in tutte le fasi del ciclo di vita (cioè dal biosintesi al prodotto finale). Tali modifiche includono, ma non sono limitati a: deamidation, glicosilazione, ossidazione, ciclizzazione, isomerizzazione, aggregazione e taglio proteolitico 2. Quindi, sono necessarie tecniche analitiche in grado di risolvere isoforme intrinseche per monitorare mAbs eterogeneità e stabilità per stabilire specifiche di qualità. Elettroforesi capillare (CE) è una tecnologia di separazione ad elevate prestazioni realizzato OutInside di un tubo di silice fusa stretto (gamma micron) riempita con uno sfondo elettrolita (DTF). In seguito all&#39;applicazione di un campo elettrico (fino a 30.000 V), molecola caricas migrano verso l&#39;elettrodo con carica opposta (cioè la separazione elettro-driven). L&#39;uso di alte tensioni in CE permette analisi veloci e maggiore efficienza, che sono superiori a elettroforesi su gel classica. Zona di elettroforesi capillare (CZE) è una tecnica basata CE-abitualmente utilizzati nel settore biofarmaceutico per la valutazione della qualità del prodotto 3-9. A differenza di altri modi di CE (ad esempio, gel elettroforesi capillare, capillare focalizzazione isoelettrica) o metodi di cromatografia basati, CZE può essere condotta senza utilizzare denaturanti o interfacce fase solida, permettendo l&#39;analisi della eterogeneità dei mAbs vicino al loro stato nativo 10 . CZE separazione delle isoforme mAb verifica all&#39;interno di un capillare in silice fusa coperta con un polimero idrofilo (capillare neutro) e si basa sulla diversa mobilità elettroforetica, che è governato dalla carica, massa, dimensioni e forma (o volume idrodinamico) 11. frazioni mAb vengono rilevati quandosono mobilizzati e passano attraverso la finestra di rilevamento, che è rilevato da un rivelatore ultravioletto (UV) assorbanza a 214 nm 4. Il successo di questa tecnica analitica dipenderà la giusta attenzione ai dettagli, prima e durante l&#39;esperimento. Agire altrimenti aumenterà il costo e il tempo per condurre l&#39;analisi, in ultima analisi, che porta al fallimento costante e frustrazione. Qui vi presentiamo una guida passo-passo per condurre un&#39;analisi di successo di mAb eterogeneità CZE attraverso la spiegazione dettagliata della preparazione di soluzioni e campioni, la preparazione del sistema CE, i metodi dello strumento istituito, l&#39;acquisizione dei dati, e l&#39;elaborazione. Ai fini di questa esercitazione, un anti-fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante completamente umano (anti-TNF) mAb è usato come proteina modello; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;analisi di altre proteine ​​considerando brevi modifiche. UNdditionally, diverse raccomandazioni per mitigare sono proposti potenziali problemi. Il lettore è incoraggiato a seguire rigorosamente il protocollo proposto, come la probabilità di successo aumenteranno.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico di grado ACS</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Istamina dicloridrato</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr> <tr><td>(idrossipropil) metilcellulosa</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Acido 6-aminocaproico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50,0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Sistema di analisi farmaceutica</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Capillare neutro&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Fiale, Micro, 200 &Micro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Tappi universali per fiale</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Fiale universali</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cavo, ottica, UV/VIS</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>Modulo rivelatore UV/VIS</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Kit di montaggio cartuccia,</td><td>Beckman Coulter</td> vuoto<td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

elettroforesi capillare separazione di anticorpo monoclonale isoforme utilizzando un capillare neutral

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Le proteine bioterapeutiche, come gli anticorpi monoclonali (mAb), sono alternative fattibili per il trattamento delle malattie cronico-degenerative. L'attività biologica di queste proteine dipende dalle loro proprietà fisico-chimiche. L'uso di tecniche ad alte prestazioni come la cromatografia e l'elettroforesi capillare è stato descritto per l'analisi dell'eterogeneità fisico-chimica degli anticorpi monoclonali. Al giorno d'oggi, la tecnica dell'elettroforesi a zona capillare (CZE) costituisce uno dei saggi più risolutivi e sensibili per l'analisi di biomolecole. Inoltre, la separazione elettro-guidata in CZE è governata da ampie proprietà della materia e offre il vantaggio di analizzare le proteine vicino al loro stato nativo. Tuttavia, il successo dell'implementazione di questa tecnica per l'analisi di routine dipende dalle capacità dell'analista nelle fasi critiche durante la preparazione del campione e del sistema. Lo scopo di questo tutorial è quello di dettagliare i passaggi per avere successo nell'analisi CZE degli anticorpi monoclonali. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo sviluppo e il miglioramento delle competenze del personale coinvolto nei laboratori di chimica analitica delle proteine.

La Figura 2 mostra il profilo corrente elettrica tipica di 200 mM EACA, 30 mM acetato di litio, pH 4.8 BGE con il campione anti-TNFa mAb diluito con tampone Tris (50 mM, pH 8,0). Come si può osservare, la corrente è stabile durante l&#39;analisi e può oscillare tra i valori di 30 a 35 μA. La Figura 3 mostra l&#39;elettroferogramma CZE di un campione in bianco dove il picco rilevato corrisponde allo standard interno istamina. Si prevede di istamina per av...

Qui, presentiamo un protocollo completo di elettroforesi della zona capillare per la valutazione dell'eterogeneità fisico-chimica intrinseca degli anticorpi monoclonali come attributo di qualità.

Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Oggigiorno, la tecnica di elettroforesi capillare costituisce uno degli approcci più risolutivi e sensibili per l'analisi di biomolecole come gli anticorpi monoclonali. Tuttavia, l'implementazione con successo di questa tecnica dipende dalla conoscenza e dalle competenze dell'analista nelle fasi critiche di preparazione del campione e del sistema. Questo tutorial ha lo scopo di illustrare come condurre un'analisi efficace, fornendo una spiegazione veramente dettagliata della preparazione delle soluzioni e dei campioni, della preparazione del sistema di elettroforesi capillare, dell'allestimento del metodo strumentale e dell'analisi e elaborazione dei dati.Nel complesso, questo protocollo può essere utilizzato per lo sviluppo e il miglioramento delle competenze del personale coinvolto nella preparazione dei laboratori di chimica analitica. Pesare la quantità di HPMC necessaria per ottenere una concentrazione finale dello 0,05 percento in 100 millilitri. Poiché l'HPMC è un polimero elastico di base, come primo passo versare il polimero in un becher di vetro e aggiungere lentamente 80 millilitri di acqua per disgregare la polvere.Quindi, risciacquare il vassoio di bagnatura con acqua

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Questo video descrive una tecnica di cromatografia di affinità per purificare gli anticorpi monoclonali 2F5 utilizzando i ligandi DsRed-2F5-Epitope o DFE. Gli anticorpi monoclonali 2F5 purificati sono farmaci essenziali in immunoterapia.

Cromatografia di affinità basata su DFE: una tecnica per la purificazione di anticorpi monoclonali 2F5 da un campione grezzo utilizzando condizioni di eluizione basate su elevata forza ionica

Questo video mostra una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante di coltura ottenuto da una coltura cellulare produttrice di anticorpi. Il processo prevede l'utilizzo di una matrice di perle di agarosio reticolate con proteina A coniugata, che immobilizza gli anticorpi nel surnatante sulle perle, consentendo un'efficace separazione dai contaminanti. Applicando un tampone di eluizione a basso pH, l'interazione proteina A-anticorpo viene allentata, facilitando la raccolta...

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

Questo video mostra un protocollo di immunodosaggio per elettroforesi capillare per rilevare un biomarcatore proteico associato alla sclerosi laterale amiotrofica (SLA) dalle piastrine del sangue umano. La conferma della presenza della proteina biomarcatrice della SLA si ottiene attraverso la separazione delle proteine piastriniche basata sulle dimensioni seguita dalla rilevazione chemiluminescente.

Un test immunologico per elettroforesi capillare per il rilevamento di biomarcatori proteici

Rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale che utilizza colonne piene di perline di agarosio A, gli adsorbenti a membrana A proteici possono accelerare significativamente l'isolamento su scala di laboratorio degli anticorpi e di altre proteine che esprimono frammenti Fc. Metodi di analisi e quantificazione appropriati possono accelerare ulteriormente l'elaborazione delle proteine, consentendo di completare l'isolamento / caratterizzazione in un giorno lavorativo, anziché oltre 20 ore...

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.

Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Un protocollo per profili metabolici di campioni biologici da elettroforesi capillare-spettrometria di massa con un design di interfaccia punta porosa guaina è presentato.

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Scopri l'elettroforesi capillare per l'analisi delle isoforme di anticorpi monoclonali. Questo protocollo dettagliato migliora le competenze del personale nei laboratori di chimica analitica.

Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

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