Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

Oggigiorno, la tecnica di elettroforesi capillare costituisce uno degli approcci più risolutivi e sensibili per l'analisi di biomolecole come gli anticorpi monoclonali. Tuttavia, l'implementazione con successo di questa tecnica dipende dalla conoscenza e dalle competenze dell'analista nelle fasi critiche di preparazione del campione e del sistema. Questo tutorial ha lo scopo di illustrare come condurre un'analisi efficace, fornendo una spiegazione veramente dettagliata della preparazione delle soluzioni e dei campioni, della preparazione del sistema di elettroforesi capillare, dell'allestimento del metodo strumentale e dell'analisi e elaborazione dei dati.

Nel complesso, questo protocollo può essere utilizzato per lo sviluppo e il miglioramento delle competenze del personale coinvolto nella preparazione dei laboratori di chimica analitica. Pesare la quantità di HPMC necessaria per ottenere una concentrazione finale dello 0,05 percento in 100 millilitri. Poiché l'HPMC è un polimero elastico di base, come primo passo versare il polimero in un becher di vetro e aggiungere lentamente 80 millilitri di acqua per disgregare la polvere.

Quindi, risciacquare il vassoio di bagnatura con acqua per rimuovere le tracce di polvere. Aggiungere i reagenti rimanenti come di consueto e mescolare la soluzione. Regolare il valore di pH a 4,8 con acido acetico al 50 percento.

Lasciare stabilizzare la soluzione per cinque minuti. Successivamente, regolare il pH se necessario. Aggiungere acqua per portare a volume finale di 100 millilitri.

Filtrare la soluzione BG preparata attraverso una membrana neutrofila e versarla in un flacone di vetro. Infine, etichettare adeguatamente il flacone di vetro e conservarlo sotto refrigerazione. Per preparare il campione, come primo passo aggiungere 162 microlitri di soluzione tampone traccia in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi aggiungere 18 microlitri di un campione di map preparato in precedenza alla concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Come terzo passaggio, aggiungere 20 microlitri di una soluzione di istamina al uno percento precedentemente preparata per ottenere un volume finale del campione di 200 microlitri. Passaggio successivo: preparare un campione per cinque secondi.

E centrifugare per cinque secondi. Aspirare il volume totale del campione. E dispensare verso l'alto in una microprovetta per evitare di introdurre bolle d'aria.

Infine, chiudere il flacone e conservarlo sotto refrigerazione. Spegnere lo strumento CE premendo l'interruttore di alimentazione e aprire la porta anteriore.

Posizionare una nuova salvietta mobile sotto il blocco dell'interfaccia. Risciacquare gli elettrodi attraverso il blocco dell'interfaccia con acqua utilizzando un flacone con cannello. Lasciare che l'acqua goccioli attraverso i fori e asciugare accuratamente il blocco dell'interfaccia.

Rimuovere con attenzione l'eccesso di acqua dagli elettrodi utilizzando lo straccio. Avere cura di non toccare gli elettrodi durante questa procedura. Rimuovere lo straccio dal sistema di fissaggio del campione.

Pulire la superficie dei vassoi del campione con una nuova salvietta leggermente inumidita con acqua. E la superficie dei vassoi del buffer. Far scorrere i vassoi del buffer verso l'alto, sollevare il sistema di contenimento dei campioni e pulire la loro superficie utilizzando la salvietta.

Riposizionare i vassoi del tampone. Successivamente, pulire accuratamente il blocco dell'interfaccia. Pulire la barra di serraggio e l'alloggiamento della lampada UV.

Alla fine, assicurarsi di provare il sistema prima dell'uso. Risciacquare le leve di apertura con acqua utilizzando un flacone lavavetro. Pulire accuratamente la loro superficie con un panno nuovo e non abrasivo per rimuovere polvere e sali accumulati.

Infine, assicurarsi di provarli prima dell'installazione. Pulire le due estremità del cavo in fibra ottica con un panno in microfibra leggermente inumidito e verificare il passaggio della luce tra le estremità. Rimuovere una nuova capillare neutra dal suo imballaggio.

Prendere ora un'estremità del tubo protettivo del capillare e portarla sul banco di lavoro. Svolgere e raddrizzare il tubo di plastica, quindi estrarre con attenzione il capillare dal tubo. Attaccare un pezzo di carta al banco di lavoro con i seguenti segni di misurazione.

Allineare la finestra del capillare al punto zero dei segni di misurazione in centimetri come segue: successivamente, fissare le estremità del capillare al banco di lavoro con del nastro. Segnare le estremità del capillare a due millimetri all'esterno dei segni di misurazione. Tagliare il cappuccio protettivo all'estremità del capillare più lontana dalla finestra.

E immergere l'estremità del capillare in una provetta CE riempita d'acqua per evitare danni permanenti al rivestimento interno del capillare. Rimuovere il capillare dalla provetta e inserire questa estremità nel lato di uscita della cartuccia con attenzione. Una volta che il capillare è apparso sull'altro lato, tirare quanto necessario affinché la finestra del capillare risulti centrata rispetto alla finestra della cartuccia come segue.

Successivamente, capovolgere la cartuccia e inserire il tappo dell'apertura nella finestra della cartuccia, premendo fino a quando non scatta in posizione. Prestare attenzione a non rompere la finestra capillare durante questa procedura. Verificare che la luce passi attraverso la finestra quando esposta a una sorgente luminosa ampia.

Inserire il capillare nel tubo refrigerante preformato con il tubo preinstallato non feral e la guarnizione ad anello. Spingere il capillare attraverso il tubo fino a quando il capillare appare dall'altro lato. Successivamente, inserire l'estremità del tubo sul lato dell'uscita della cartuccia e serrare i dadi del tubo.

Inserire l'estremità di ingresso del capillare nel lato di ingresso della cartuccia. Una volta che il capillare è apparso sull'altro lato, tirare secondo necessità. Successivamente, inserire l'estremità del tubo nel lato di ingresso della cartuccia e serrare i raccordi del tubo.

Tagliare il cappuccio protettivo all'estremità capillare più vicina alla finestra. Installare le clip di ritenzione della cella sulle estremità capillari, premendo fino a quando scattano in posizione come segue. Tagliare le estremità capillari al di sotto delle linee di riferimento sulle piastre capillari allungate.

Assicurarsi di ispezionare le estremità dei capillari con una lente di ingrandimento. Se le estremità dei capillari non sono lisce, levigarle utilizzando la pietra per incisione. Inserire la guarnizione ad anello nell'apposito foro blu dell'apertura.

E inserirla con attenzione utilizzando l'apposito strumento per l'inserimento della guarnizione ad o-ring. Infine, installare le provette CE riempite di acqua nel contenitore del cartuccia e posizionare immediatamente il cartuccia nel contenitore, inserendo le estremità dei capillari nelle provette, quindi conservare sotto refrigerazione. Regolare il volume della pipetta.

Aggiungere il volume corretto di acqua nell'ingresso del buffer alle coordinate della piastra A1, B1 e F6. E aggiungere all'uscita del buffer alle coordinate della piastra A1, B1, C1, E6 e F6. Aggiungere HCl 0,1 normale alla piastra dell'ingresso del buffer alle coordinate C1 ed E6. E aggiungere BGE alla piastra dell'ingresso del buffer alle coordinate D1 ed E6. E all'uscita del buffer alla coordinata della piastra D1. Infine, chiudere con il tappo tutti i vial di CE nelle piastre dell'ingresso e dell'uscita del buffer. Durante la procedura, evitare di bagnare i tappi dei vial per prevenire la fuoriuscita di carbonio. Aprire la porta anteriore dello strumento di CE.

Prima di tutto, installare il rilevatore UV e fissarlo ruotando la vite in senso orario. Sollevare la porta interna e installare le leve di apertura premendole verso l'alto nel blocco di interfaccia. Inserire il cavo in fibra ottica nel bloccaggio e ruotare in senso orario.

Collegare l'altra estremità al rivelatore. Manipolare il cavo in fibra ottica con cura, poiché la flessione potrebbe causarne la rottura. Inserire il vassoio del campione nel sistema di alloggiamento del campione e fissarlo in posizione.

Seguendo la stessa procedura, posizionare i vassoi del tampone nel sistema di mantenimento del campione. Sollevare la barra di serraggio e inserire la cartuccia capillare nel blocco di interfaccia. Premere la barra di serraggio su entrambe le estremità e stringere le manopole ruotando in senso orario.

Chiudere la porta interna e la porta anteriore. Infine, accendere lo strumento CE premendo l'interruttore di alimentazione. Creare il metodo dello strumento di condizionamento.

Configurare i parametri nella sezione delle condizioni iniziali, inclusi tensione, cartuccia, temperatura di conservazione del campione e impostazioni del trigger. Selezionare duemilaquattordici come lunghezza d'onda di acquisizione. Dichiarare le azioni da eseguire dallo strumento configurando i parametri nelle celle programmate temporali.

Includere le impostazioni specifiche per ciascun passaggio di risciacquo, iniezione e separazione. Eseguire questa procedura per creare i metodi di condizionamento, di esecuzione e di spegnimento dello strumento. Il passaggio successivo consiste nel creare una nuova sequenza.

Programmare il capillare per il condizionamento utilizzando il metodo di condizionamento. Se il capillare viene utilizzato per la prima volta, programmare quattro ripetizioni. In caso contrario, programmare due ripetizioni.

Quindi programmare i campioni da analizzare utilizzando il metodo di esecuzione. Infine, programmare la capillare per lo stoccaggio utilizzando il metodo di spegnimento. L'analisi mediante elettroforesi capillare viene completata entro 30 minuti.

Il primo risultato corrisponde allo standard interno di istamina come misura delle prestazioni del sistema adeque. A questo segue la separazione delle forme distinte di base, principale e acida del monoclonale anthiberi ebaluadith. L'intera corsa di separazione viene eseguita a corrente costante di circa 30 microampere.

Dopo aver eseguito l'esperimento, esportare i dati grezzi dal software grab e importarli tramite il software empower per l'elaborazione. La percentuale di ciascuna forma di ghiaccio si ottiene mediante integrazione verticale con linea verticale del profilo elettroferogramma. Di seguito viene presentata una guida dettagliata passo dopo passo per condurre l'analisi delle attività monoclonali generate mediante elettroforesi capillare cellulare.

Oltre a diverse raccomandazioni per mitigare eventuali problemi, il protocollo qui presentato offre il vantaggio di poter essere facilmente personalizzato per l'analisi di altre proteine, considerando semplici modifiche ai parametri di conducibilità e pH.