Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare gli effetti dei nutrienti supplementari in un modello murino di colite indotta da destrano solfato di sodio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia intestinale sullo sviluppo della scienza clinica durante la direzione dell'esperimento del modello di colite. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è a basso costo, non richiede attrezzature sofisticate e fornisce una chiara analisi della morfologia dell'intero colon.

Questo metodo può essere utilizzato per valutare lo stress ossidativo nel colon come conseguenza di un eccessivo reclutamento di neutrofili. Per la somministrazione di integratori alimentari mediante gavagage, trattenere prima manualmente il mouse per la collottola, posizionando la coda tra il terzo dito e la base del pollice. Successivamente, tenendo il mouse in posizione eretta, inserire l'ago della sonda nella parte sinistra della bocca dell'animale e seguire attentamente il palato per individuare l'esofago.

Se non si incontra resistenza, far avanzare l'ago verso lo stomaco. Erogare lentamente l'intero volume dell'integratore, seguito da un'attenta rimozione della siringa e misurare il peso corporeo dell'animale. Assegnare un punteggio da zero a quattro in base alla percentuale di perdita di peso, quindi raccogliere un campione di feci fresche e utilizzare gli applicatori forniti per applicare un sottile striscio di campione su un vetrino da un kit per il test del sangue occulto fecale al guaiaco.

Chiudere il coperchio sulla parte anteriore del kit e aprire la finestra posteriore per applicare due gocce della soluzione di sviluppo sul retro della posizione del campione. Leggi i risultati dopo 30 secondi, assegnando un punteggio da zero a quattro a seconda della potenza del segnale. Quindi osservare un secondo campione di feci fresche per valutare la consistenza delle feci, assegnando un punteggio da zero a quattro a seconda dei casi.

Per determinare la permeabilità epiteliale intestinale in vivo, posizionare un animale anestetizzato in posizione supina e praticare un'incisione sulla linea mediana per esporre l'intestino. Localizzare il cieco e praticare una piccola incisione nel segmento prossimale degli ascendenti del colon. Quindi inserire un ago da alimentazione calibro 22 e fissare l'ago con una comune legatura a filo di seta.

Sciacquare accuratamente un abbondante volume di PBS attraverso l'ago per sciacquare tutte le feci dal colon, seguito dall'installazione della soluzione blu di Evans fino a quando il colorante non raggiunge l'ano. Dopo 15 minuti, sciacquare il tubo con un volume in eccesso di PBS fino a quando il dilavamento perianale non è chiaro. Quindi asportare il colon e sciacquare il tessuto con altro PBS, seguito da un millilitro di N-acetilcisteina da sei millimolari per eliminare qualsiasi colorante che si attacca al muco del colon.

Ora taglia il colon longitudinalmente e risciacqua il tessuto ancora una volta con PBS e N-acetilcisteina, quindi registra il peso e la lunghezza del colon e posiziona il tessuto in due millilitri di N, N-dimetilformammide a temperatura ambiente con una leggera agitazione per estrarre il colorante rimanente, misurando le concentrazioni di colorante spettrofotometricamente a 610 nanometri la mattina seguente. Dopo sette giorni di destrano solfato di sodio, o colite indotta da DSS, sezionare l'intero colon e registrarne la lunghezza. Per gli swiss rolls, aprire il colon longitudinalmente, rimuovere con cura qualsiasi materia fecale e utilizzare un bastoncino di legno sottile e rotondo o una pinza a punta fine per arrotolare il tessuto con la mucosa rivolta verso l'interno.

Quindi posizionare con cura il tessuto all'interno di una cassetta di inclusione, seguita da una fissazione con cinque millilitri di formaldeide al 10% a temperatura ambiente. È fondamentale arrotolare strettamente il colon senza piegarlo per evitare problemi durante il sezionamento dei tessuti, che potrebbero causare un danno clinico ai tessuti e una falsa interpretazione come danno associato alla colite. Dopo 48 ore, lavare il campione con acqua di rubinetto per 18 ore, seguito dalla disidratazione con una serie di etanolo.

Dopo l'ultima immersione assoluta di etanolo, trattare il tessuto con quattro incubazioni di un'ora in xilene. Dopo l'ultima immersione nello xilene, immergere il campione in 50 millilitri di paraffina liquida per un'incubazione di 17 ore e una di tre ore. Al termine dell'incubazione di tre ore, immergere il campione in uno stampo di plastica quadrato da 22 millimetri cubi in 8-10 millilitri di paraffina liquida fresca per 24 ore.

Quando la paraffina si è solidificata, utilizzare un microtomo per acquisire sezioni di tessuto spesse cinque micron, quindi immergere brevemente le sezioni trasversali in un bagno d'acqua da un litro contenente lo 0,3% di gelatina e montare immediatamente i campioni su vetrini trattati con polilisina per la colorazione H&E. Per l'analisi dello stress ossidativo, creare prima una barriera attorno al tessuto utilizzando una penna idrofobica. Successivamente, incubare sezioni criogeniche di tessuto da otto micron in cinque micromolari DHE disciolti in acqua per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio.

L'incubazione è seguita da tre lavaggi di 15 minuti in PBS con leggera agitazione a temperatura ambiente. Asciugare i campioni all'aria e aggiungere una goccia di terreno di montaggio per proteggere la fluorescenza. Quindi osservare la fluorescenza dell'etidio ossidato su un microscopio confocale a scansione laser con un ingrandimento di 40x.

Il trattamento con DSS porta a un indice di attività della malattia in continuo aumento come previsto, raggiungendo un punteggio massimo il settimo giorno dopo l'induzione. L'integrazione di dieta antinfiammatoria ritarda l'insorgenza precoce della colite, mentre gli effetti protettivi sono solo marginali in momenti successivi. L'intervento dietetico può anche prevenire l'aumento della permeabilità epiteliale intestinale indotto dal DSS, nonché l'accorciamento della lunghezza del colon.

colorazione con ematossilina ed eosina dei tessuti del colon distale inclusi in paraffina rivela che i campioni di controllo dimostrano una morfologia normale, mentre gli animali trattati con DSS mostrano i segni tipici della colite. Da notare che il trattamento parallelo con l'integrazione dietetica allevia chiaramente i cambiamenti morfologici indotti dalla colite con una morfologia complessiva simile a quella del gruppo di controllo. La colorazione in immunofluorescenza del tessuto del colon distale indica anche che le molecole della giunzione inaderente sono internalizzate durante la colite indotta da DSS e che la co-localizzazione di queste proteine è in parte persa ai contatti delle cellule epiteliali della cripta.

È importante sottolineare che questa internalizzazione si riduce quando i topi trattati con DSS ricevono l'integratore dietetico antinfiammatorio e antiossidante. Inoltre, il robusto reclutamento di neutrofili nel colon in risposta alla colite indotta da DSS è contrastato dall'integrazione della dieta, con conseguente miglioramento concomitante dello stress ossidativo indotto dai neutrofili e una leggera riduzione della produzione di citochine infiammatorie. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come le misurazioni della camera di trasudamento per analizzare la resistenza elettrica della barriera epiteliale nel colon.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulla colite e all'esplorazione del meccanismo molecolare della patogenesi della colite ulcerosa in un modello murino riproducibile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare lo sviluppo della colite e gli effetti benefici degli integratori alimentari sulle funzioni della barriera epiteliale intestinale. Non dimenticare che lavorare con animali vivi richiede l'adesione a elevati standard etici per evitare sofferenze inutili.