Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi
3 febbraio 2017
attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di attivare fisiologicamente l'autofagia nei topi mediante corsa forzata o volontaria, e quindi misurare i livelli di autofagia in tessuti specifici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'autofagia, in particolare, su come l'autofagia e l'azione contribuiscano agli effetti benefici mediati dall'esercizio aerobico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'esercizio fisico è un'oscillazione aerobica veloce tra l'autofagia in vivo utilizzando i topi.
Per questo esperimento, iniziare con topi neri C57 di 8-12 settimane, che ospitano un gene trans per rilevare l'autofagia indotta dall'esercizio in vivo, noto come GFP-LC3. Per i dettagli sull'uso dei tapis roulant per topi, vedere la seguente pubblicazione JoVE. Impostare lo stimolo elettrico del tapis roulant a bassa intensità.
Nelle prime due sessioni, acclimatare i topi a un tapis roulant aperto in salita di dieci gradi. Il primo giorno, esercita i topi per cinque minuti con il tapis roulant che corre a otto metri al minuto. Il secondo giorno, fai correre i topi per dieci minuti, inizialmente a otto metri al minuto, e dopo cinque minuti, aumenta la velocità a dieci metri al minuto.
Il terzo giorno, fai correre i topi per 90 minuti interi. Avvia il tapis roulant a dieci metri al minuto e incoraggia i topi a correre usando spinte delicate per evitare ripetuti urti ai piedi. È fondamentale osservare e manipolare i topi in modo che non ricevano troppe scosse elettriche durante i 90 minuti di corsa.
Durante la corsa, usa le dita per incoraggiare i topi a rimanere sul tapis roulant. Dopo 40 minuti, 6aumentare la velocità di un metro al minuto. Dopo 50 minuti, aumentare nuovamente la velocità di un metro al minuto.
Dopo 60 minuti, aumentare la velocità di un altro metro al minuto. Dopo 70 minuti, inizia ad aumentare la velocità ogni cinque minuti in modo che gli ultimi cinque minuti dei 90 minuti di corsa siano 17 metri al minuto. Dopo la fine della prova, sopprimere immediatamente i topi per la raccolta dei tessuti, se lo si desidera.
Per questo test, ospita i topi singolarmente. Utilizzare la stessa varietà descritta in precedenza. Prepara un volante per mouse da 11,4 centimetri di diametro con un contachilometri per bici collegato.
Ogni rotazione dovrebbe misurare 358 millimetri di corsa. Sposta il mouse nella gabbia contenente la rotellina e lascia che il mouse la usi liberamente per due settimane. Ogni 24 ore, registrare la distanza percorsa dal mouse dal contachilometri.
Dopo le due settimane, prelevare i tessuti per l'analisi secondo necessità. Per misurare il flusso autofagico, trattare i topi con l'inibitore dell'autofagia, la clorochina, per tre giorni. Sciogliere la clorochina in PBS a cinque milligrammi per millilitro e iniettarla nei topi per via intraperitoneale alla dose di 50 microgrammi per grammo.
Somministrare ai topi un'iniezione al giorno per tre giorni consecutivi e prelevare i tessuti tre ore dopo l'ultima iniezione. Per i topi allenati sul tapis roulant, inizia la corsa di 90 minuti 90 minuti dopo l'iniezione il terzo giorno in modo che la corsa termini tre ore dopo l'iniezione. Quindi sopprimere i topi e raccogliere immediatamente i loro tessuti.
Preparati a immergere un animale entro 90 minuti dall'esercizio preparando il fissativo. Caricare una siringa da 30 millilitri con 15-20 millilitri di paraformaldeide al quattro percento appena prodotta e collegare la siringa con un ago catetere calibro 20. Collegare la pompa-siringa carica e impostarla a 90 millilitri all'ora di flusso continuo.
Con l'animale su un piano di lavoro pulito, in posizione supina, aprire la cavità toracica attraverso il diaframma per esporre il cuore. Ora, inserisci l'ago del catetere nel ventricolo destro. Successivamente, fai una piccola incisione sul fegato per drenare il sangue e avviare la pompa.
Iniettare il fissativo fino a quando il polmone e il fegato non diventano completamente pallidi. Di solito sono sufficienti 15 millilitri di fissativo. Dopo la profusione, rimuovere l'ago e raccogliere i tessuti di interesse.
Per raccogliere il muscolo scheletrico, sezionare il vasto laterale. Tirare brevemente la pelle della gamba all'indietro per esporre i muscoli e localizzare il quadricipite femorale. Quindi, seziona il vasto laterale, che è il muscolo esterno attaccato alla parte superiore dell'osso femorale.
Per un'ulteriore fissazione e disidratazione, posizionare i tessuti raccolti in paraformaldeide al quattro percento per 24 ore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire i tessuti al 15% di saccarosio PBS e lasciarli in ammollo a quattro gradi Celsius durante la notte o fino a quando non si sono depositati nella soluzione. Quindi, trasferire i tessuti al 30% di saccarosio PBS a quattro gradi Celsius per una notte o più a lungo.
Mantieni i tessuti al buio il più possibile durante questi bagni. Quindi, posizionare i fazzoletti in un mezzo di inclusione come l'OCT e, se necessario, tagliarli in pezzi più piccoli. Quindi, lasciali acclimatare per qualche minuto in una piccola capsula di Petri.
Successivamente, trasferiscili in criostampi con abbastanza OCT da coprire. Negli stampi orientare le superfici di sezionamento verso il basso ed evitare la formazione di bolle. Quindi, congelare i campioni in un refrigeratore di schiuma coperto riempito di ghiaccio secco fino a quando l'OCT non diventa bianco.
Ora, avvolgere i singoli campioni in fogli etichettati, sigillarli in un sacchetto di plastica e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non possono essere elaborati. Utilizzando LC3 marcato con GFP come sistema reporter, l'induzione dell'autofagia è stata osservata nei topi esercitati come descritto. Dopo la stimolazione dell'autofagia, LC3 si è traslocata dal citosol all'autofagosoma in strutture punteggiate.
I topi esercitati avevano molti più punti GFP-LC3 sia nel muscolo scheletrico che nella corteccia cerebrale rispetto ai topi in condizioni di riposo. L'analisi del western blot con un anticorpo LC3 ha mostrato che l'esercizio fisico induce significativamente la generazione di LC3-II coniugativa lipidica, suggerendo che vi è un aumento della conversione di LC3-I citosolica in LC3-II. Successivamente, è stata misurata la degradazione del recettore autofagico del carico, p62.
90 minuti di attività sul tapis roulant hanno causato una maggiore degradazione di p62 nel muscolo scheletrico rispetto alla condizione di riposo. Questo effetto è stato salvato da un'iniezione di clorochina prima dell'esercizio. Poiché la clorochina è un inibitore della degradazione lisosomiale, questi dati indicano che i fenomeni osservati sono dovuti a un elevato flusso autofogagico piuttosto che a un blocco della degradazione dell'autofagosoma.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha avuto precursori nel campo dell'autofagia per esplorare gli effetti sul meccanismo dell'esercizio nella degradazione del metabolismo e dei comportamenti animali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare i topi mentre sono in funzione. Seguendo questa procedura, sono i metodi come la microscopia elettrica.
La microscopia animale può essere eseguita per rispondere a domande aggiuntive come l'esercizio in percorsi di autofagia selezionati, come la mitofagia e la lipofagia.
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Panoramica
Questo studio analizza l'attivazione dell'autofagia mediante esercizio aerobico nei topi. Misurando i livelli di autofagia in tessuti specifici, la ricerca mira a chiarire i benefici fisiologici dell'esercizio fisico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- L'autofagia è un processo cellulare che contribuisce alla degradazione e al riciclo dei componenti cellulari.
- È noto che l'esercizio fisico induce l'autofagia in vivo.
- Comprendere la relazione tra esercizio fisico e autofagia può fornire informazioni utili sulla prevenzione delle malattie.
- Questo studio utilizza topi C57 black six portatori di un transgene per rilevare l'autofagia indotta dall'esercizio.
Scopo dello studio
- Attivare l'autofagia nei topi mediante corsa forzata o volontaria.
- Misurare i livelli di autofagia in tessuti specifici dopo l'esercizio fisico.
- Esplorare il contributo dell'autofagia ai benefici dell'esercizio aerobico.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di topi C57 black six di età compresa tra otto e dodici settimane.
- Utilizzo di un tapis roulant per l'esercizio con stimolo elettrico a bassa intensità.
- Misurazione dei livelli di autofagia mediante transgene GFP-LC3.
- Confronto dei livelli di autofagia prima e dopo l'esercizio.
Risultati principali
- L'attivazione dell'autofagia è stata indotta con successo dall'esercizio aerobico.
- Tessuti specifici hanno mostrato livelli variabili di autofagia dopo l'esercizio.
- I risultati supportano l'ipotesi secondo cui l'esercizio potenzia l'autofagia.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei benefici fisiologici dell'esercizio.
Conclusioni
- L'esercizio aerobico è un metodo efficace per attivare l'autofagia in vivo.
- Comprendere il ruolo dell'autofagia può contribuire a strategie di prevenzione delle malattie.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i meccanismi alla base di questi effetti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo studio dimostra un metodo fisiologico per attivare l'autofagia in vivo mediante esercizio aerobico nei topi, fornendo un approccio non farmacologico per modulare un percorso chiave di degradazione cellulare. La possibilità di quantificare il flusso autofagico attraverso i marcatori LC3 e p62 consente una riduzione del rischio meccanicistica delle interazioni legate all'esercizio in modelli preclinici. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi per le malattie in cui la modulazione dell'autofagia è clinicamente rilevante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'autofagia come bersaglio terapeutico mediante induzione fisiologica anziché agenti farmacologici.
- Valore operativo: Utilizza un sistema reporter GFP-LC3 per visualizzare la formazione di autofagosomi in tessuti specifici come il muscolo scheletrico e la corteccia cerebrale.
- Valore predittivo: Misura la conversione della LC3 lipidata in LC3-II e la degradazione della p62 per valutare il flusso autofagico, fornendo indicazioni sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Stabilisce protocolli standardizzati per l'esercizio su tapis roulant e la corsa volontaria su ruota allo scopo di indurre l'autofagia in multipli organi.
- Output quantitativo: Utilizza il Western blot e la microscopia per misurare i livelli di LC3-II e la degradazione di p62 come indicatori affidabili dell'attività autofagica.
- Riproducibilità: Include il trattamento con cloroquina per distinguere un aumento del flusso autofagico da una degradazione compromessa, migliorando la specificità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega l'esercizio aerobico all'upregolazione dell'autofagia nel fegato, nel cuore, nel cervello e nel muscolo — tessuti rilevanti per le malattie metaboliche, neurodegenerative e cardiovascolari.
- Continuità traslazionale: Supporta la valutazione preclinica di interventi sullo stile di vita fornendo un indicatore biomolecolare quantificabile (LC3-II/p62) per l'attivazione del percorso.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce se i benefici osservati derivino da un aumento del flusso autofagico piuttosto che da un blocco della degradazione, riducendo interpretazioni false positive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio alla validazione preclinica, in particolare per i percorsi che coinvolgono l'omeostasi cellulare e la risposta allo stress.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo dell'autofagia nei benefici mediati dall'esercizio fisico, consentendo un'attivazione controllata e induttibile in vivo.
- Screening: Prepara sistemi biologici validati (ad esempio tessuti di topi sottoposti a esercizio) per successivi screening di composti o screening genetici mirati a regolatori dell'autofagia.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (conversione di LC3-II, degradazione di p62) che permettono confronti tra diverse condizioni e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte della ricerca di base alla continuità preclinica, associando l'autofagia indotta dall'esercizio a modelli di malattia specifici per tessuto.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la modulazione dell'autofagia in diversi ambiti di malattia, mediante protocolli standardizzati di esercizio e rilevamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla regolazione dell'autofagia, riducendo l'ambiguità negli studi di validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Offre procedure standardizzate e riproducibili per indurre e misurare l'autofagia in vivo utilizzando attrezzature facilmente accessibili (tapis roulant, ruote per correre).
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una valutazione preclinica di strategie che modulano l'autofagia con rilevanza fisiologica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei programmi mirati all'autofagia attraverso dati preclinici predittivi e basati su meccanismi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli animali, nella fisiologia dell'esercizio e nei tempi di prelievo dei tessuti per evitare stress o lesioni confondenti.
- È dipendente da strumentazioni quali tapis roulant calibrati, ruote per correre dotate di contachilometri e sistemi di perfusione per la fissazione dei tessuti.
- Necessita di standardizzazione tra laboratori per durata, intensità dell'esercizio e dosaggio della cloroquina, al fine di garantire misurazioni comparabili del flusso autofagico.
- Le considerazioni relative all'adattamento includono la variabilità tissutale nella risposta autofagica e la necessità di un prelievo tempestivo dopo l'esercizio o il trattamento con inibitori.
- I limiti pratici comprendono la variabilità interindividuale nella distanza percorsa durante la corsa volontaria e la difficoltà tecnica di mantenere un'intensità costante dell'esercizio senza ricorrere a stimoli elettrici eccessivi.
