Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi
3 febbraio 2017
attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.
L'obiettivo generale di questo esperimento è attivare fisiologicamente l'autofagia nei topi mediante corsa forzata o volontaria, e successivamente misurare i livelli di autofagia in tessuti specifici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sull'autofagia, in particolare su come l'autofagia e la sua attivazione contribuiscano agli effetti benefici mediati dall'esercizio aerobico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'esercizio fisico rappresenta un modo rapido per indurre fluttuazioni aerobiche dell'autofagia in vivo utilizzando topi.
Per questo esperimento, iniziare con topi C57 black six di età compresa tra otto e dodici settimane, portatori di un transgene per rilevare l'autofagia indotta dall'esercizio in vivo, noto come GFP-LC3. Per maggiori dettagli sull'uso dei tapis roulant per topi, consultare la seguente pubblicazione di JoVE. Impostare lo stimolo elettrico del tapis roulant su intensità bassa.
Nei primi due allenamenti, abituare i topi a un tapis roulant aperto inclinato di dieci gradi. Nel primo giorno, far esercitare i topi per cinque minuti con il tapis roulant che si muove a otto metri al minuto. Nel secondo giorno, far correre i topi per dieci minuti, inizialmente a otto metri al minuto, e dopo cinque minuti, aumentare la velocità a dieci metri al minuto.
Nel terzo giorno, far correre i topi per un intero periodo di 90 minuti. Avviare il tapis roulant a dieci metri al minuto e incoraggiare i topi a correre con leggeri stimoli manuali per evitare ripetuti shock elettrici. È fondamentale osservare e guidare i topi in modo che non ricevano troppi shock elettrici durante la corsa di 90 minuti.
Durante tutta la corsa, usa le dita per incoraggiare i topi a rimanere sul tapis roulant. Dopo 40 minuti, aumenta la velocità di un metro al minuto. Dopo 50 minuti, aumenta nuovamente la velocità di un metro al minuto.
Dopo 60 minuti, aumentare la velocità di un altro metro al minuto. Dopo 70 minuti, iniziare ad aumentare la velocità ogni cinque minuti, in modo che gli ultimi cinque minuti della corsa di 90 minuti siano di 17 metri al minuto. Al termine della prova, se necessario, eutanasizzare immediatamente i topi per la raccolta dei tessuti.
Per questo test, alloggiare i topi singolarmente. Utilizzare la stessa linea precedentemente descritta. Preparare una ruota per topi del diametro di 11,4 centimetri con un contachilometri da bicicletta collegato.
Ogni rotazione deve misurare 358 millimetri di percorrenza. Posizionare il mouse nella gabbia contenente la ruota e lasciare che lo usi liberamente per due settimane. Ogni 24 ore, registrare la distanza percorsa dal mouse riportata dall'odometro.
Dopo due settimane, raccogliere i tessuti per l'analisi secondo necessità. Per misurare il flusso autofagico, trattare i topi con l'inibitore dell'autofagia, cloroquina, per tre giorni. Sciogliere la cloroquina in PBS a cinque milligrammi per millilitro e iniettarla nei topi per via intraperitoneale alla dose di 50 microgrammi per grammo.
Somministrare ai topi un'iniezione al giorno per tre giorni consecutivi e raccogliere i tessuti tre ore dopo l'ultima iniezione. Per i topi sottoposti a esercizio sul tapis roulant, iniziare la corsa di 90 minuti 90 minuti dopo l'iniezione del terzo giorno, in modo che la corsa termini tre ore dopo l'iniezione. Successivamente, eutanasizzare i topi e raccogliere immediatamente i loro tessuti.
Preparare la perfusione di un animale entro 90 minuti dall'esercizio preparando il fissativo. Caricare una siringa da 30 millilitri con 15-20 millilitri di paraformaldeide al quattro percento appena preparata e collegare la siringa a un ago catetere da 20 gauge. Fissare la siringa al pompa per siringa e impostarla su un flusso continuo di 90 millilitri all'ora.
Con l'animale posizionato supino su una superficie di lavoro pulita, aprire la cavità toracica attraverso il diaframma per esporre il cuore. Inserire quindi l'ago del catetere nel ventricolo destro. Successivamente, praticare una piccola incisione nel fegato per drenare il sangue e avviare la pompa.
Iniettare il fissativo finché polmone e fegato non diventano completamente pallidi. Di solito, sono sufficienti 15 millilitri di fissativo. Dopo la perfusione, rimuovere l'ago e raccogliere i tessuti di interesse.
Per raccogliere il muscolo scheletrico, dissezionare il vasto laterale. Tirare brevemente all'indietro la pelle della gamba per esporre i muscoli e localizzare il quadricipite femorale. Successivamente, dissezionare il vasto laterale, che è il muscolo esterno attaccato alla porzione superiore dell'osso femorale.
Per una fissazione e disidratazione ulteriori, collocare i tessuti raccolti in paraformaldeide al quattro percento per 24 ore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire i tessuti in PBS con saccarosio al 15 percento e lasciarli in ammollo a quattro gradi Celsius per tutta la notte o fino a quando non si saranno depositati nella soluzione. Successivamente, trasferire i tessuti in PBS con saccarosio al 30 percento a quattro gradi Celsius per tutta la notte o per un periodo più lungo.
Mantenere i tessuti al buio il più possibile durante questi bagni. Successivamente, posizionare i tessuti in un mezzo di inclusione come OCT e tagliarli in pezzi più piccoli, se necessario. Quindi, lasciarli acclimatare per alcuni minuti in una piccola piastra di Petri.
Successivamente, trasferirli in stampi criogenici con abbastanza OCT da coprire completamente. Negli stampi, orientare le superfici da tagliare verso il basso ed evitare la formazione di bolle d'aria. Quindi, congelare i campioni in un contenitore isolante riempito con ghiaccio secco fino a quando l'OCT diventa bianco.
Ora, avvolgere i singoli campioni in fogli di alluminio etichettati, sigillarli in un sacchetto di plastica e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'elaborazione. Utilizzando GFP marcato LC3 come sistema di reporter, è stata osservata l'induzione dell'autofagia nei topi sottoposti all'esercizio come descritto. Dopo la stimolazione dell'autofagia, LC3 si è traslocato dal citosol all'autofagosoma formando strutture puntiformi.
I topi sottoposti a esercizio fisico presentavano molte più puncta GFP-LC3 sia nel muscolo scheletrico che nella corteccia cerebrale rispetto ai topi in condizione di riposo. Un'analisi mediante immunoblotting con un anticorpo anti-LC3 ha mostrato che l'esercizio fisico induceva significativamente la formazione di LC3-II coniugata a lipidi, suggerendo un aumento della conversione di LC3-I citosolica in LC3-II. Successivamente, è stata misurata la degradazione del recettore del carico autofagico p62.
Novanta minuti di attività sul tapis roulant hanno causato una maggiore degradazione della p62 nel muscolo scheletrico rispetto alla condizione di riposo. Questo effetto è stato ripristinato da un'iniezione di cloroquina prima dell'esercizio. Poiché la cloroquina è un inibitore della degradazione lisosomiale, questi dati indicano che il fenomeno osservato è dovuto a un aumento del flusso autofagico piuttosto che a un blocco nella degradazione degli autofagosomi.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha avuto precursori nel campo dell'autofagia per esplorare gli effetti del meccanismo dell'esercizio sulla degradazione del metabolismo e sui comportamenti animali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare i topi mentre corrono. A seguito di questa procedura, vengono i metodi come la microscopia elettronica.
La microscopia animale può essere eseguita per rispondere ad altre domande, come l'esercizio in percorsi selettivi di autofagia, ad esempio la mitofagia e la lipofagia.
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Panoramica
Questo studio analizza l'attivazione dell'autofagia mediante esercizio aerobico nei topi. Misurando i livelli di autofagia in tessuti specifici, la ricerca mira a chiarire i benefici fisiologici dell'esercizio fisico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- L'autofagia è un processo cellulare che contribuisce alla degradazione e al riciclo dei componenti cellulari.
- È noto che l'esercizio fisico induce l'autofagia in vivo.
- Comprendere la relazione tra esercizio fisico e autofagia può fornire informazioni utili sulla prevenzione delle malattie.
- Questo studio utilizza topi C57 black six portatori di un transgene per rilevare l'autofagia indotta dall'esercizio.
Scopo dello studio
- Attivare l'autofagia nei topi mediante corsa forzata o volontaria.
- Misurare i livelli di autofagia in tessuti specifici dopo l'esercizio fisico.
- Esplorare il contributo dell'autofagia ai benefici dell'esercizio aerobico.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di topi C57 black six di età compresa tra otto e dodici settimane.
- Utilizzo di un tapis roulant per l'esercizio con stimolo elettrico a bassa intensità.
- Misurazione dei livelli di autofagia mediante transgene GFP-LC3.
- Confronto dei livelli di autofagia prima e dopo l'esercizio.
Risultati principali
- L'attivazione dell'autofagia è stata indotta con successo dall'esercizio aerobico.
- Tessuti specifici hanno mostrato livelli variabili di autofagia dopo l'esercizio.
- I risultati supportano l'ipotesi secondo cui l'esercizio potenzia l'autofagia.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei benefici fisiologici dell'esercizio.
Conclusioni
- L'esercizio aerobico è un metodo efficace per attivare l'autofagia in vivo.
- Comprendere il ruolo dell'autofagia può contribuire a strategie di prevenzione delle malattie.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i meccanismi alla base di questi effetti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo studio dimostra un metodo fisiologico per attivare l'autofagia in vivo mediante esercizio aerobico nei topi, fornendo un approccio non farmacologico per modulare un percorso chiave di degradazione cellulare. La possibilità di quantificare il flusso autofagico attraverso i marcatori LC3 e p62 consente una riduzione del rischio meccanicistica delle interazioni legate all'esercizio in modelli preclinici. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi per le malattie in cui la modulazione dell'autofagia è clinicamente rilevante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'autofagia come bersaglio terapeutico mediante induzione fisiologica anziché agenti farmacologici.
- Valore operativo: Utilizza un sistema reporter GFP-LC3 per visualizzare la formazione di autofagosomi in tessuti specifici come il muscolo scheletrico e la corteccia cerebrale.
- Valore predittivo: Misura la conversione della LC3 lipidata in LC3-II e la degradazione della p62 per valutare il flusso autofagico, fornendo indicazioni sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Stabilisce protocolli standardizzati per l'esercizio su tapis roulant e la corsa volontaria su ruota allo scopo di indurre l'autofagia in multipli organi.
- Output quantitativo: Utilizza il Western blot e la microscopia per misurare i livelli di LC3-II e la degradazione di p62 come indicatori affidabili dell'attività autofagica.
- Riproducibilità: Include il trattamento con cloroquina per distinguere un aumento del flusso autofagico da una degradazione compromessa, migliorando la specificità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega l'esercizio aerobico all'upregolazione dell'autofagia nel fegato, nel cuore, nel cervello e nel muscolo — tessuti rilevanti per le malattie metaboliche, neurodegenerative e cardiovascolari.
- Continuità traslazionale: Supporta la valutazione preclinica di interventi sullo stile di vita fornendo un indicatore biomolecolare quantificabile (LC3-II/p62) per l'attivazione del percorso.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce se i benefici osservati derivino da un aumento del flusso autofagico piuttosto che da un blocco della degradazione, riducendo interpretazioni false positive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio alla validazione preclinica, in particolare per i percorsi che coinvolgono l'omeostasi cellulare e la risposta allo stress.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo dell'autofagia nei benefici mediati dall'esercizio fisico, consentendo un'attivazione controllata e induttibile in vivo.
- Screening: Prepara sistemi biologici validati (ad esempio tessuti di topi sottoposti a esercizio) per successivi screening di composti o screening genetici mirati a regolatori dell'autofagia.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (conversione di LC3-II, degradazione di p62) che permettono confronti tra diverse condizioni e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte della ricerca di base alla continuità preclinica, associando l'autofagia indotta dall'esercizio a modelli di malattia specifici per tessuto.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la modulazione dell'autofagia in diversi ambiti di malattia, mediante protocolli standardizzati di esercizio e rilevamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla regolazione dell'autofagia, riducendo l'ambiguità negli studi di validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Offre procedure standardizzate e riproducibili per indurre e misurare l'autofagia in vivo utilizzando attrezzature facilmente accessibili (tapis roulant, ruote per correre).
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una valutazione preclinica di strategie che modulano l'autofagia con rilevanza fisiologica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei programmi mirati all'autofagia attraverso dati preclinici predittivi e basati su meccanismi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli animali, nella fisiologia dell'esercizio e nei tempi di prelievo dei tessuti per evitare stress o lesioni confondenti.
- È dipendente da strumentazioni quali tapis roulant calibrati, ruote per correre dotate di contachilometri e sistemi di perfusione per la fissazione dei tessuti.
- Necessita di standardizzazione tra laboratori per durata, intensità dell'esercizio e dosaggio della cloroquina, al fine di garantire misurazioni comparabili del flusso autofagico.
- Le considerazioni relative all'adattamento includono la variabilità tissutale nella risposta autofagica e la necessità di un prelievo tempestivo dopo l'esercizio o il trattamento con inibitori.
- I limiti pratici comprendono la variabilità interindividuale nella distanza percorsa durante la corsa volontaria e la difficoltà tecnica di mantenere un'intensità costante dell'esercizio senza ricorrere a stimoli elettrici eccessivi.
