Name: Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri la fabbricazione di reti microfluidiche biomimetiche vascolari in idrogel PEGDA mediante degradazione laser guidata da immagini. Questo metodo avanzato consente di replicare l'architettura vascolare in vivo per applicazioni di ingegneria tissutale e modelli di malattia.

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Gli autori ringraziano il Dr. Jeff Caplan e il Sig. Michael Moore del Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center per il loro supporto con la microscopia confocale. L'accesso alle apparecchiature di microscopia è stato supportato dalle sovvenzioni per la strumentazione condivisa del National Institutes of Health (NIH) (S10 RR0272773 e S10 OD016361) e dal programma federale di sovvenzioni per la ricerca e lo sviluppo dello Stato del Delaware (16A00471). Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni dell'Institutional Development Award (IDeA) del NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), dell'American Cancer Society (14-251-07-IRG), della University of Delaware Research Foundation (14A00778), del Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013) e della NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Critiche nella ignorando le funzioni standard del software microscopio per consentire l&#39;utilizzo di maschere virtuali per la degradazione guidata dalle immagini, basata sul laser, la macro microscopio deve essere messa a punto e manipolato con cura. Come le interfacce software microscopio con la macro microscopio a volte può essere controintuitivo, e molti sforzi sono stati investiti nel determinare le impostazioni ottimali in entrambi i programmi per sviluppare questo metodo. Si consiglia una comprensione generale del laser-scanning di base uso microscopio confocale, in particolare con la &quot;Stage&quot; e le finestre &quot;FOCUS&quot; per la ricerca e il posizionamento del idrogel nelle direzioni x, y, z e dimensioni, prima di tentare la degradazione basato sul laser in modo corretto. Inoltre, la fabbricazione di un canale di ingresso è fondamentale per il protocollo; specie fluorescenti sospese dovranno essere in grado di immettere i sistemi microfluidici per l&#39;imaging di successo e caratterizzazione di rete. È importante notare che questo protocollo si applica a una determinata al laserscansione microscopio confocale configurato con uno specifico laser pulsato a femtosecondi, in esecuzione versioni specifiche del software del microscopio e il microscopio macro (vedi dettagli nella lista delle specifiche Materiali / Equipment). Abbiamo scoperto che le versioni più recenti del macro microscopio non hanno il controllo e la funzionalità necessarie necessarie per il controllo del laser guidata dalle immagini. Mentre altre piattaforme microscopio e sorgenti laser ad impulsi può essere utilizzato, questo protocollo si applica specificamente a questo sistema e dovrà modifica secondo la piattaforma, sorgente laser e software implementato. I principi alla base di tutto questo protocollo si applicano ancora, però. Un potenziale modifica di questo protocollo comporta la modifica della composizione idrogel. Qui, abbiamo utilizzato 5% in peso, 3,4 idrogel kDa PEGDA, ma il degrado basato su laser (per scopi di parte generazione di rete microfluidica) è stato implementato per degradare sia idrogel sintetici e naturali, tra cui PEGylated fibrinaOgen 21,22, proteine della seta idrogeli 23, e collagene 24. La regolazione della potenza del laser, velocità di scansione, spaziatura tra Z-fette, e il numero di ripetizioni sarà di aiuto nel determinare i parametri ottimali per fabbricare reti microfluidici in altre formulazioni idrogel. Una corrente di limitazione della tecnica è il volume complessivo di idrogel che può essere degradato in una quantità di tempo fattibile. Per creare vuoti aperti o caratteristiche microfluidica all&#39;interno del idrogel, il laser tempo di sosta deve essere pari o superiore a 8,96 ms / pixel (o di una velocità di scansione laser di 0,021 micron / ms) quando si utilizza una fluenza laser di 37,7 nJ / micron 2. Con queste impostazioni, ci vogliono 1,4 h di degradare vasi all&#39;interno di un volume 0,014 millimetri 3 (come si vede in figura 1). Utilizzando un tempo di sosta laser di 4.48 ms / pixel o inferiore, l&#39;energia erogata non è sufficiente per la piena degradazione della formulazione idrogel usato qui. L&#39;implementazione di un idrogel diversocomposizione potrebbe superare questa limitazione. L&#39;uso di gel fotolabili che contengono componenti sensibili alla luce 34-36 o idrogel che hanno grandi multiphoton sezioni 21-24 sono buone opzioni che permetta l&#39;utilizzo di meno energia e si tradurrebbe in precoce decadimento. Per quanto riguarda le limitazioni dimensionali, caratteristiche sono state fabbricate fino a 1,5 mm di profondità in idrogel 7. Il ottenibile profondità è una funzione della distanza di lavoro dell&#39;obiettivo e può essere aumentata utilizzando obiettivi a distanza di lavoro ultra-lunghi ottimizzati per imaging in vivo. Il più piccolo canale misurata 7 creata usando un 20X (NA1.0) obiettivo ad immersione acqua aveva una larghezza di 3,3 micron e profondità di 8,9 micron, che è alla pari con le dimensioni più piccole canali generati in Figura 1. Mentre altri laboratori hanno utilizzato inferiori obiettivi NA 21,23,24, ci aspettiamo che le reti microfluidica con caratteristiche più piccoli possono essere generati utilizzando altaobiettivi er NA a scapito di una distanza di lavoro ridotta. Infine, tuttavia, la risoluzione della tecnica è una funzione della funzione di diffusione di punto del fascio laser focalizzato, le proprietà di scansione laser, la quantità di energia erogata dal laser, e le proprietà di assorbimento del laser del materiale degradati. Inoltre, le proprietà laser (velocità, fluenza, la spaziatura tra le maschere virtuali, ed il numero di ripetizioni) devono essere ottimizzate in base alle proprietà idrogel (densità di reticolazione, macromero / peso molecolare del monomero, percento in peso ed il tipo di idrogel: proteina a base sintetica vs. ), in quanto questi intrinsecamente alterare le interazioni con il laser e quindi la soluzione finale del processo. Mentre l&#39;energia erogata è influenzata anche dall&#39;obiettivo utilizzato, l&#39;ottimizzazione aggiuntivo è necessario quando si passa tra gli obiettivi. Per quanto riguarda i costi, è necessario accedere ad un microscopio con un laser pulsato, e mentre molti objec diversitive possono essere usati, quelli con un alto NA e distanza di lavoro (per imaging in vivo) può essere costoso. Al di là del protocollo dettagliato qui, reti microfluidica generati con questa tecnica possono essere funzionalizzati con peptidi cellula-adesivo post-channel fabbricazione di indurre l&#39;adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7. Inoltre, l&#39;incorporazione di sequenze peptidiche cellule degradabile nel materiale sfuso 9 prima incanalare degrado potrebbe consentire lo studio della migrazione cellulare in e attraverso l&#39;idrogel. Per fluidizzazione continua della rete microfluidica all&#39;interno dell&#39;idrogel, idrogel possono essere photopolymerized in dispositivi o contenitori fluidici più grandi, come dimostrato nelle figure 2 e 3 7. La generazione di reti vascolari via vascolare o angiogenico autoassemblaggio 8-12 fornisce un approccio diretto per indurre vascularization durante un volume relativamente grande idrogel. Sebbene questo approccio si traduce in reti fluidici perfusable, è difficile controllare direttamente le dimensioni, tortuosità, densità e architettura di rete complessiva. A causa di questa limitazione, il profilo di flusso e velocità di taglio nella vascolatura possono variare tra esperimenti. In alternativa, le tecniche di microfabbricazione 13-16 consentono il controllo diretto sulle architetture di rete, ma sono spesso limitate dalla loro incapacità di generare piccoli, canali capillari dimensioni o la realizzazione di reti dense che imitano in architettura vivo vascolare. Mentre la tecnica di degrado idrogel basato su laser qui delineato è stato recentemente riproposto per la generazione di microfluidica, supera contemporaneamente sia il controllo architettonico e limitazioni di dimensione basata su metodi di microfabbricazione esistenti, consentendo la creazione di reti di microfluidica biomimetici 3D che ricapitolano la densità, tortuosità, gamma di dimensioni, e nel complesso architecture di vascolarizzazione in vivo. Inoltre, più reti fluidici possono essere generati in una singola idrogel, permettendo lo studio dei trasporti inter-rete 7. Per le applicazioni di ingegneria tissutale che si sforzano di replicare più da vicino in processi di trasporto in vivo in vitro, le reti microfluidica idrogel-embedded altamente risolti qui descritte sono adatte. Prevediamo che questo protocollo sarà utile per lo sviluppo di costrutti di tessuto che più accuratamente imitare il trasporto in vivo per l&#39;utilizzo come dispositivi di screening di stupefacenti e in modelli di malattia in vitro.

Il sistema vascolare, composto sia linfatico e cardiovasculature, forme reti ad alta densità che sono essenziali per il trasporto di nutrienti e ossigeno e per la rimozione dei rifiuti metabolici. Di conseguenza, le cellule residenti nei tessuti vascolarizzati sono mai più di 50-100 micron di distanza da un recipiente 1. La capacità di riprodurre in vivo dell&#39;architettura vascolare in vitro è fondamentale per modellare accuratamente in vivo processi di trasporto utilizzando costrutti ingegnerizzati. Con una recente un&#39;unità di sviluppare dispositivi organo-on-a-chip 2 per droga high-throughput di screening 3,4 e modellazione malattia 5,6, metodi per creare reti di microfluidica che ricapitolano in vivo -come trasporto in idrogel sintetici o naturali sono di disegno notevole interesse. Per migliorare la biomimicry di microtissues utilizzati in questi dispositivi, abbiamo sviluppato un metodo degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che utilizza tridimenspile l immagine (3D) di vascolarizzazione nativa come modelli per la generazione di reti microfluidica vascolari-derivati incorporati in PEGDA idrogel 7. Questo protocollo descrive l&#39;uso di un microscopio confocale a scansione laser disponibile in commercio equipaggiato con un laser pulsato a femtosecondi per fabbricare vascolari derivate, reti microfluidici biomimetiche in idrogel PEGDA tramite degradazione guidata dalle immagini, basato su laser. Gli attuali approcci per fluidificare idrogel includono l&#39;induzione di vascolare 8-10 o 10-12 tecniche delle cellule endoteliali di auto-assemblaggio e di microfabbricazione angiogeniche di creare canali pre-definiti per endotelializzazione 13-16. Mentre le reti autoassemblati ricapitolano la densità e complessa architettura di microcircolo, spesso sono più permeabili reti in vivo 11,17,18, che può essere problematica nel trasporto modellazione per applicazioni di screening di stupefacenti. reti di auto-assemblati costituiti da physiologcamente rilevanti, vasi capillari di dimensioni, ma possono essere difficili da integrare con il flusso del fluido di massa a causa di limitazioni nella generazione di grandi vasi arteriole dimensioni. Poiché non vi è alcun controllo diretto sul gruppo di queste reti, l&#39;architettura finale può variare da campione a campione, rendendo difficile ripetutamente produrre reti con le stesse proprietà di flusso e trasporto dei fluidi. Per generare 3D, reti microfluidica idrogel-embedded a geometria ripetibile e architettura ben definito, sono state sviluppate una serie di tecniche di microfabbricazione, compreso il montaggio modulare 13, la stampa 3D di materiali sacrificali 16, montaggio e scrittura diretta 14, e la stampa omnidirezionale 15. L&#39;applicazione di questi metodi, architettura microfluidica, e quindi fluidi proprietà di scorrimento e di trasporto, può essere ripetutamente fabbricato in molti costrutti. Una limitazione importante di questi approcci, tuttavia, è l&#39;incapacità di creare microFreti luidic con caratteristiche capillari di dimensioni, da 4 a 10 micron 19. La maggior parte delle tecniche di microfabbricazione sono spesso limitati alle funzioni da 150 a 650 micron di diametro 13,16. Alcune tecniche esistenti sono in grado di generare reti gerarchiche con canali in una vasta gamma di diametri, 10 e 300 micron per il montaggio-scrittura diretta 14, e da 18 a 600 _M per la stampa omnidirezionale 15, ma sono limitati nella loro capacità di generare reti dense o per produrre più reti microfluidica in prossimità all&#39;interno di un unico costrutto 7. Per superare alcune di queste limitazioni, abbiamo sviluppato una tecnica degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che permette la fabbricazione ripetibile di biomimetica, reti microfluidica gerarchiche che ricapitolano l&#39;architettura del microcircolo in vivo. Per fare ciò, un 790 nm, 140 femtosecondi (fs) laser pulsato operante a 80 MHz è i raster scansionatan desiderata posizioni 3D all&#39;interno di un idrogel, come definito da immagini di vascolarizzazione in vivo. Noi ipotizziamo che il processo di degradazione opera attraverso la ripartizione indotta da laser ottica di acqua, la formazione di plasma risultante, la successiva rapida espansione termoelastica di acqua, e la degradazione locale del idrogel come l&#39;acqua si espande 20. Questo meccanismo varia leggermente dalla degradazione basato su laser di idrogel a base di proteine 21-24. Diversamente PEGDA, che ha una bassa sezione multiphoton, proteine hanno spesso una grande multiphoton sezione e sono quindi degradati attraverso un multiphoton assorbimento indotta rottura chimica 23. Per generare reti microfluidica guidate da immagini, l&#39;otturatore laser è controllato da maschere virtuali immagine derivato, che consistono di un mosaico di regioni di interesse 9 che definiscono l&#39;architettura microfluidica. Usando questo approccio, abbiamo dimostrato la capacità di fabbricare microfluidi biomimetico vascolare-derivati ​​3Dreti ic, che ricapitolano l&#39;architettura densa e tortuoso vascolare in vivo, per controllare localmente la porosità degli idrogel alterando la quantità di energia erogata durante la degradazione. Siamo stati anche in grado di generare due reti microfluidica indipendenti che si intrecciano nelle immediate vicinanze (15 micron), ma non si collegano direttamente 7. Abbiamo inoltre dimostrato la capacità di endothelialize microcanali laser degradata attraverso posta degrado funzionalizzazione con l&#39;integrina leganti sequenza peptidica, arginina-glicina-acido aspartico-Serina (RGDS), per favorire l&#39;adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7. Con questo protocollo, la generazione di reti complesse microfluidica in idrogel PEGDA è reso possibile tramite la degradazione guidata dalle immagini, laser-based utilizzando un microscopio disponibile in commercio accessibile su molti campus universitari. Poiché il processo di degradazione è guidato da, maschere virtuali digitali, questa fabricatecnica zione è suscettibile per la progettazione creativa di reti microfluidica, consentendone l&#39;uso in un&#39;ampia varietà di applicazioni. Prevediamo che il metodo descritto qui sarà più vantaggiosa nella progettazione di dispositivi organismi e umane-on-a-chip biomimetici in grado di replicare i processi di trasporto biologici importanti nella modellazione del trasporto di droga 2. Questa tecnica di fabbricazione può anche essere di interesse per la generazione di modelli di malattia in vitro, comprendenti metastasi del cancro 5,6 e modelli barriera ematoencefalica 25. Come degrado idrogel basato su laser è stato precedentemente utilizzato per creare tracce per la guida di escrescenza neuronale 21-23, l&#39;estensione guidata dalle immagini di questa tecnica potrebbe rivelarsi utile nelle strategie di ingegneria tessutale avanzate per posizionare le celle a disposizioni spaziali 3D definiti dall&#39;utente.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>denominato "software di programmazione" nel protocollo; fare riferimento alla fonte 9 per i dettagli sull'algoritmo</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>versione 1.51a</td><td>denominato "software di elaborazione delle immagini" nel protocollo</td></tr><tr><td>LSM 780 Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td>denominato "microscopio confocale a scansione laser" nel protocollo; per idrogel basato su laser </td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>release versione 6.0</td><td>denominata "software per microscopio" nel protocollo; per l'uso su Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>denominato "macro per microscopio" nel protocollo; per l'uso su Zeiss LSM-780 (in combinazione con Zen)</td></tr><tr><td>Obiettivo W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>per l'uso su Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>denominato "laser pulsato ad alta potenza" nel protocollo</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>infiammabile; irritante per la pelle e gli occhi; lavorare con in una cappa aspirante</td></tr><tr><td>Sodio idrossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Tazze di filtrazione sottovuoto con 0,2 & micro; m PES Membrana</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>sintetizzato internamente</td><td></td><td>fare riferimento alla fonte 33 per i metodi di sintesi; conservare sotto argon</td></tr><tr><td>Eosina Y sale disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinil-2-pirrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>conservare sotto argon; cancerogeno; lavorare con in una cappa aspirante</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo 3M, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>supporto FLX000620</td><td>per la movimentazione di nastro biadesivo</td></tr><tr><td>Modello SC Plotter (taglierina adesiva)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>utilizzato per tagliare l'adesivo a forma di anello per collegare i vetrini coprioggetti alle piastre di Petri</td></tr><tr><td>Piastra Petri da 60 mm con foro da 20 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore ad alta intensità (sorgente di luce bianca)</td>Misuratore di potenza <td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>rileva la potenza a 524 nm quando si utilizza una sorgente di luce bianca</td></tr><tr><td>Rilevatore a bacchetta a profilo sottile</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>per l'uso con il misuratore di potenza</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>utilizzato per realizzare stampi PDMS; fare riferimento alla fonte 7 per i metodi</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>sintetizzato internamente</td><td></td><td>fare riferimento alla fonte 7 per i metodi</td></tr><tr><td>Dextran, Fluoresceina, 2.000.000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>può utilizzare dextrans con tag alternativi; 2.000 kDa non si diffonde facilmente in una siringa da 1 ml di idrogel PEGDA al 5% da 3,4 kDa</td></tr><tr><td>, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a siringa Acrodisc, 0,2 &; micro; m Membrana Supor, Pall a basso legame proteico</td><td></td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide VI0.4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>dispositivi microfluidici che possono essere utilizzati per alloggiare idrogel</td></tr></tbody></table>

immagine-guidate, fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Questo protocollo dettagliato descrive l&#39;attuazione guidata dalle immagini, degradazione idrogel laser per la realizzazione di reti microfluidica vascolari derivate incorporati in idrogel PEGDA. Qui, descriviamo la creazione di maschere virtuali che permettono di controllo laser guidata dalle immagini; la fotopolimerizzazione di un idrogel PEGDA micromolded, adatto per microfluidica realizzazione della rete e il flusso di testa-driven pressione; l&#39;installazione e l&#39;uso di una scansione laser microscopio confocale disponibile in commercio in coppia con un femtosecondi impulsi laser Ti: S per indurre la degradazione idrogel; e l&#39;imaging reti microfluidica fabbricati usando specie fluorescenti e microscopia confocale. Gran parte del protocollo è focalizzata sulla corretta configurazione e implementazione del software microscopio e il microscopio macro, in quanto questi rappresentano passi decisivi nel mezzo di un microscopio commerciale a fini di fabbricazione microfluidici che contengono una serie di complicazioni. La componente guidata dalle immagini di questa technique consente l&#39;implementazione di pile di immagini 3D o modelli 3D generati dall&#39;utente, consentendo in tal modo per la progettazione microfluidica creativo e per la realizzazione di complessi sistemi microfluidici qualsiasi configurazione. Con un impatto previsto in ingegneria dei tessuti, i metodi descritti in questo protocollo potrebbe aiutare nella realizzazione di avanzati costrutti biomimetici microtessuto per i dispositivi di organismi e umane-on-a-chip. Imitando la complessa architettura, tortuosità, la dimensione e la densità dei vasi in vivo, i processi essenziali di trasporto biologici possono essere replicati in questi costrutti, portando a più accurata modellazione in vitro di farmacocinetica di droga e la malattia.

Per dimostrare l&#39;attuazione di guidata dalle immagini, il degrado idrogel basata sul laser per generare una rete microfluidica 3D, vascolare-derivato, abbiamo utilizzato una pila di immagini 3D di vascolarizzazione cervello di topo che è stata acquisita tramite acuminate microscopia a scansione (KESM) 26, 27 . Una regione 3D selezionato della maggiore microvascolare set di dati è stata convertita in una serie di maschere virtuali per la formazione della rete microfluidica guidata dalle immagini, come descritto sopra. Dopo la fabbricazione, la rete microfluidica risultante è stato perfuso con una soluzione di FITC-marcato, 2.000 kDa destrano e ripreso tramite microscopia confocale. La pila del sistema vascolare in vivo che definisce l&#39;architettura di rete (Figura 1A e C) e la rete microfluidica fabbricato (Figura 1B e D) sono stati utilizzati per generare Z-proiezioni (Figura 1A e B) e rendering 3D (Figura 1C e D </strong&gt;). Il confronto delle immagini dimostra che, degrado idrogel basato su laser immagine guidata consente la realizzazione di reti microfluidici biomimetici 3D che ricapitolano le dimensioni, tortuosità e complessa architettura del sistema vascolare in vivo. La tecnica è suscettibile di fabbricazione di reti contenenti una vasta gamma di diametri; all&#39;interno della Figura 1, sono stati generati canali che vanno da 3.3 al 28,8 micron di diametro. Si noti che la struttura rettangolare grande in alto a sinistra della figura 1B e nell&#39;angolo sinistro di figura 1D è il canale di ingresso per introdurre flusso nella rete. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Figura 1: Microfluidic rete vascolare-Derived. Una serie di maschere virtuali, derivato da una serie di immagini di vascolarizzazione cervello di topo (A e C), sono stati usati per fabricate una rete microfluidica biomimetica 3D incorporato in un idrogel PEGDA (B e D) tramite degradazione guidata dalle immagini, basato su laser. La rete microfluidica è stato perfuso con destrano 2.000 kDa coniugati con fluoresceina e ripreso tramite microscopia confocale. Z-proiezioni (A e B) e rendering 3D (C e D) delle due reti dimostrano la capacità di generare reti microfluidica che ricapitolano la densità, l&#39;organizzazione e l&#39;architettura complessiva del sistema vascolare in vivo. La freccia (D) segna l&#39;ingresso rettangolare creata per introdurre il destrano. La barra della scala rappresenta il 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Abbiamo implementato due metodi, le teste di pressione e pompe siringa, per avviare il fluido Fa basso contenuto di queste reti microfluidica embedded. Ad esempio, un canale rettangolare 30 da 30 micron è stato fabbricato per collegare due pozzi in un idrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), con flusso di fluido azionato tramite una testa di pressione 7. Generata in ben sinistra, la testa di pressione indotto flusso attraverso il microcanali e nel pozzo sulla destra. Nella Figura 2A, un fronte iniziale di tetramethylrhodamine (TRITC) -labeled, 70 kDa destrano è stata osservata muove attraverso il canale usando la microscopia time-lapse. Successivamente, nella figura 2B, un diametro di 10 micron sfera polistirene fluorescente scorreva dal pozzo sinistra, attraverso il canale, al pozzo sulla destra. Con la durata del flusso controllato dal volume di fluido presente nel micromolded ben in ingresso, e la portata controllata dal gradiente idrostatico generato tra l&#39;ingresso e di uscita ben, flusso testa-driven pressione in idrogel micromolded fornisce un metodo semplice per il flusso inproduzione, senza la necessità di un involucro esterno o una pompa a siringa. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Figura 2: Pressione Portata Head-Driven in un Micromolded PEGDA idrogel. PEGDA stato micromolded per formare un idrogel contenente due pozzetti collegati da un microcanale incorporato. Una testa di pressione generata in sinistra e di avviare il flusso di TRITC marcato, 70 kDa destrano (A1-A3) e una sfera di polistirolo 10 micron (B1-B3) attraverso un 30 da 30 micron canale rettangolare da un pozzetto al altro. La barra della scala rappresenta il 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In alternativa, per generare flusso del fluido costante all&#39;interno di reti microfluidica, pompa-driven siringa fbasso può essere iniziata da fotopolimerizzanti l&#39;idrogel all&#39;interno di un dispositivo di microfluidica secondario con le porte di ingresso e uscita per la pompa a siringa interfacciamento. Nella Figura 3A, un dispositivo microfluidico prefabbricato commercialmente disponibile è mostrato con una fascia 1 mm di idrogel photopolymerized tutta la larghezza del dispositivo 7. degrado laser-based è stata implementata per fabbricare canali microfluidica e le reti in idrogel ospitate utilizzando lo stesso protocollo descritto qui per freestanding idrogel. Portata della pompa generata siringa può essere visto in Figura 3B, in cui un canale cilindrico del diametro di 20 micron è stato fabbricato in un idrogel alloggiata in un dispositivo microfluidico. In questo canale diametro di 20 micron, singole sfere di polistirene fluorescenti 2-micron sono facilmente risolti senza flusso di fluido (Figura 3B1), mentre quando viene applicato un 5 microlitri / s portata, le sfere si muovono attraverso il campo di vista, come evidenziato da striature (Figura 3B2 &lt;/ Strong&gt;). Questo stesso approccio è stato utilizzato per indurre flusso attraverso una rete vascolare derivato 2D per monitorare il flusso di TRITC marcato, 65 kDa destrano attraverso la rete e diffusione nel idrogel circostante (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Figura 3: Flusso pompa a siringa-Driven in PEGDA idrogel polimerizzato in alloggiamenti microfluidici. Un dispositivo disponibile in commercio prefabbricati microfluidica (A) con un microcanale 17 x 3,8 x 0,53 millimetri (x, y, z) ospita un photopolymerized 1 x 3,8 x 0,53 millimetri (x, y, z) PEGDA idrogel, indicato dal freccia nera. Un canale cilindrico del diametro di 20 micron è stato degradato attraverso l&#39;idrogel, e sfere di polistirene 2-micron sono stati pompata attraverso il dispositivo (B). Le sfere sono chiaramente risolti senza flusso di fluido (B1), ma appaiono come striature con una portata di 5 ml / s(B2). In un&#39;altra idrogel alloggiata, una rete 2D vascolare derivato è stato fabbricato e TRITC-etichettato, 65 kDa destrano è stata pompata attraverso la rete (C). Time-lapse microscopia è stato utilizzato per monitorare il destrano fluorescente come si riempie i canali e diffusa nelle idrogel circostanti. Frecce bianche in (B) e (C) indicano la direzione del flusso del fluido. La barra di calibrazione (C) indica l&#39;intensità del destrano fluorescente. Le barre di scala rappresentano 20 micron di (B1) e (B2) e 50 micron di (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo delinea l'implementazione della degradazione dell'idrogel basata su laser guidata da immagini per fabbricare reti microfluidiche biomimetiche di derivazione vascolare incorporate in idrogel di poli(etilenglicole) diacrilato (PEGDA). Questi sistemi microfluidici biomimetici possono essere utili per applicazioni di ingegneria tissutale, generazione di modelli di malattie in vitro e fabbricazione di dispositivi avanzati "on-a-chip".

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere come utilizzare un microscopio confocale dotato di un laser a impulsi femtosecondo per generare reti microfluidiche biomimetiche tridimensionali derivate dai vasi sanguigni, incorporate in idrogeli di diacrilato di polietilene glicole, mediante degradazione guidata da immagine basata su laser. Un vantaggio significativo di questa tecnica è la capacità di generare reti microfluidiche biomimetiche tridimensionali che riproducono con precisione la densità, la tortuosità, l'intervallo dimensionale e l'architettura complessiva della vascolarizzazione in vivo all'interno di costrutti sintetici. Questo approccio alla fabbricazione microfluidica migliorerà la nostra capacità di produrre costrutti ingegnerizzati di tessuti più simili all'in vivo, modelli biomimetici di malattie e dispositivi su chip ad altissima densità.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché l'impostazione corretta e l'utilizzo del software del microscopio non sono intuitivi, ma sono cruciali per formare le reti microfluidiche desiderate. Molti dei passaggi preparatori sono descritti nel protocollo testuale, inclusa la generazione delle maschere virtuali, la configurazione del microscopio e il caricamento delle maschere virtuali nel software del microscopio. Per fotopolimerizzare l'idrogel PEGDA, attaccare innanzitutto un anello di adesivo bifacciale a una piastra di Petri da 60 millimetri che presenta un foro da 20 millimetri ricavato sul fondo.Successivamente, in una cappa, aggiungere un millilitro di HBS con TEOA in un tubo centrifugo ambrato da due millilitri coperto con carta stagnola. Quindi, aggiungere 10 microlitri di sale disodico di Eosina Y 1 millimolare al tubo. Ora, prelevare con una pipetta una piccola quantità di NVP in un becher di vetro utilizzando una pipetta di vetro.Da questo volume, prelevare 3,5 microlitri di NVP e trasferirli nella miscela. Successivamente, aggiungere 10 milligrammi di PEGDA da 3,4 kilodalton in un secondo tubo rivestito di alluminio. Quindi, aggiungere 0,2 millilitri della miscela per ottenere una soluzione prepolimerica di PEGDA al 5% peso in volume.Ora, agitare energeticamente la soluzione prepolimerica fino a quando il PEGDA è completamente disciolto. Successivamente, pipettare 60 microlitri su uno stampo in PDMS senza introdurre bolle d'aria. A questo punto, posizionare al centro un coperchio in vetro acrilato da 40 millimetri numero 1.5 sopra la soluzione sugli spaziatori in PDMS.Quindi posizionare l'assemblaggio sotto una sorgente di luce bianca calibrata per fornire 95 milliwatt. Polimerizzare il polimero per tre minuti. Successivamente, far scorrere acqua distillata tra lo stampo e il coprioggetto per separare l'idrogel dal PDMS e risciacquare l'idrogel.Poi, asciugare delicatamente i bordi del vetrino senza aspirare acqua dall'idrogel. A questo punto, aderire il vetrino alla piastra di Petri preparata. Una leggera pressione è d'aiuto.Quindi, immergere l'idrogel in acqua distillata. Configurare il microscopio confocale a scansione laser come descritto nel protocollo testuale e avviare la configurazione per la visualizzazione dell'idrogel. Successivamente, adattare l'idrogel e la piastra di Petri all'inserto del portacampioni e posizionarlo sullo stesso.Successivamente, riempire la piastra di Petri con almeno cinque millilitri di acqua distillata e abbassare l'obiettivo a immersione in acqua fino a posizionarlo appena sopra l'idrogel senza toccarlo. Ora, fare clic su "live" per attivare la linea laser all'argon. Quindi, mettere a fuoco l'idrogel finché il segnale di Eosina Y non diventa visibile sulla superficie superiore dell'idrogel.Per facilitare l'individuazione dell'idrogel, provare a incrementare temporaneamente la percentuale di potenza o la dimensione del pinhole. Contrassegnare le posizioni della superficie superiore e inferiore dell'idrogel e del fondo della pozzetta. Quindi utilizzare il joystick per muoversi in senso trasversale e individuare i bordi della pozzetta.Nella finestra di messa a fuoco, abbassare il piano di fuoco di 150 micron all'interno dell'idrogel utilizzando la freccia verso il basso accanto alla casella della posizione Z. Il passaggio successivo è critico. Azzerare la posizione X e Y nella finestra dello stage, quindi eliminare tutte le altre posizioni contrassegnate e contrassegnare soltanto la posizione azzerata.Ora, per iniziare il processo di formazione di un canale di ingresso, acquisire prima un'immagine, quindi utilizzare il pulsante rettangolo nella finestra delle regioni per delimitare l'area che fungerà da ingresso per la rete vascolare. Successivamente, passare alla configurazione della formazione del canale. I dettagli sono forniti nel protocollo descrittivo.Una volta arrivati a questo punto, nella finestra dello stack Z, fare clic sui pulsanti centrali in alto e sopra l'offset per centrare lo stack Z nella posizione corrente. Successivamente, in base alle dimensioni necessarie dell'ingresso, impostare il numero di sezioni con un intervallo di uno. Verificare ora che la velocità sia impostata su tre e che la percentuale di potenza sia al 100%.Quindi procedere salvando la configurazione e fare clic sul pulsante avvia esperimento. Per visualizzare l'idrogel durante il degrado del canale, aumentare il guadagno principale nella finestra dei canali se la regione nel campo visivo è nera, oppure ridurre il guadagno principale se la regione è bianca. Al termine del degrado, verificare che sia stato formato l'ingresso tornando alla configurazione di visualizzazione dell'idrogel e facendo clic su live.Prima di tutto, nella finestra delle regioni, caricare qualsiasi file ovl dallo stack Z delle maschere virtuali e fare clic sul pulsante freccia per visualizzare le ROI nel campo visivo. Successivamente, fare clic su live per scansionare la configurazione di visualizzazione dell'idrogel e utilizzare il joystick o la finestra della piastra per posizionare l'idrogel in modo che l'ingresso si connetta alla posizione corretta all'interno della rete vascolare. Quindi, abbassare il piano di fuoco alla prima posizione nel macroscopio, ovvero 50 micron al di sotto della precedente posizione Z centrata, utilizzando l'incremento nella finestra del fuoco e cliccando sulla freccia verso il basso.Anche in questo caso, è fondamentale reimpostare a zero le posizioni X e Y, eliminare tutte le altre posizioni segnate e impostare solo questa posizione come nuovo punto zero. Assicurarsi di salvare questa nuova configurazione. Ora, nella configurazione della formazione del canale, selezionare esclusivamente le finestre della serie temporale e quelle di sbiancamento.Successivamente, aprire la macro e selezionare la scheda di salvataggio. Selezionare la ricetta precedentemente creata e fare clic su applica. Assicurarsi di non fare clic su salva, altrimenti la ricetta verrà sovrascritta.Dopo aver verificato le impostazioni, salvare nuovamente la configurazione della formazione del canale e quindi fare clic su aggiorna nel macroscopio del microscopio. Fare clic su no per non sovrascrivere l'elenco delle posizioni corrente, quindi fare clic su avvia nel macroscopio del microscopio per avviare la ricetta. Al termine del processo di degradazione, utilizzare la configurazione di visualizzazione dell'idrogel con una potenza laser inferiore per consentire la visualizzazione del dextrano marcato con FITC, che ha un segnale più intenso rispetto al segnale nativo di Eosina Y dell'idrogel.Prima di aggiungere il dextrano marcatto con fluorescenza, asportare con una micropipetta dell'acqua dal pozzetto nell'idrogel. Quindi aggiungere 10 microlitri di dextrano marcato con FITC filtrato. La procedura descritta è stata utilizzata per convertire un grande volume di immagini microvascolari in una serie di maschere virtuali per la formazione di una rete microfluidica guidata dall'immagine.La rete microfluidica risultante è stata confrontata con la vascolarizzazione in vivo da cui era stata ottenuta. La degradazione dell'idrogel guidata da immagine mediante laser ha permesso la fabbricazione di reti microfluidiche biomimetiche tridimensionali in grado di riprodurre le dimensioni, la tortuosità e l'architettura complessa della vascolarizzazione in vivo. Sia teste di pressione che pompe per siringhe sono state utilizzate per avviare il flusso di fluido in queste reti microfluidiche incorporate.Della destrana fluorescente da 70 kilodalton e microsfere di polistirene da 10 micron sono state osservate muoversi da sinistra a destra a causa di un flusso indotto da una differenza di pressione. In alternativa, un flusso generato da una pompa a siringa è stato avviato polimerizzando fotochimicamente un idrogel all'interno di un secondo dispositivo microfluidico. Utilizzando lo stesso protocollo qui descritto, è stata quindi applicata una degradazione laser per realizzare una rete bidimensionale derivata da vasi sanguigni all'interno di un idrogel alloggiato, al fine di permettere il flusso generato da siringa e la perfusione di destrana da 65 kilodalton.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di un laser a impulsi femtosecondi per generare reti microfluidiche biomimetiche mediante degradazione guidata da immagine dell'idrogel indotta dal laser. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i parametri del laser, inclusi potenza, lunghezza d'onda e velocità di scansione, devono essere regolati e ottimizzati in base alla formulazione dell'idrogel da degradare.Grazie e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Bioingegneria

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Presentiamo un metodo per la deposizione microfluidica di genipina e fibronectina modellate su substrati PDMS, consentendo una maggiore vitalità di tessuti densi di cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo di fabbricazione dei tessuti è combinato con la precedente tecnologia a film sottile muscolare vascolare per misurare la contrattilità vascolare nel corso del tempo rilevante per la malattia.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

I lembi ingegnerizzati richiedono una rete vascolare funzionale incorporata. In questo protocollo, presentiamo un metodo per fabbricare un lembo di tessuto stampato in 3D contenente una rete vascolare gerarchica e le sue anastomosi microchirurgiche dirette all'arteria femorale di ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un sistema organ-on-chip (OOC) progettato per imitare la pneumonectomia. Questo sistema studia la potenziale correlazione tra compromissione del glicocalice e complicanze dopo la pneumectomia.

Modellazione del glicocalice endoteliale post-pneumonectomia in un chip fluidico 3D - Un approccio alla fabbricazione di un sistema organo-on-chip basato su vasi

Scopri la fabbricazione di reti microfluidiche biomimetiche vascolari in idrogel PEGDA mediante degradazione laser guidata da immagini. Questo metodo avanzato consente di replicare l'architettura vascolare in vivo per applicazioni di ingegneria tissutale e modelli di malattia.

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

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