Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare un microscopio confocale dotato di un laser a impulsi a femtosecondi per generare reti microfluidiche biomimetiche tridimensionali di derivazione vascolare incorporate in idrogel di polietilenglicole diacrilato utilizzando la degradazione basata su laser guidata da immagini. Un vantaggio significativo di questa tecnica è la capacità di generare reti microfluidiche biomimetiche tridimensionali che ricapitolano accuratamente la densità, la tortuosità, l'intervallo dimensionale e l'architettura complessiva della vascolarizzazione in vivo nei costrutti sintetici. Questo approccio di fabbricazione microfluidica migliorerà la nostra capacità di generare più costrutti in vivo come costrutti di ingegneria tissutale, modelli di malattie biomimetiche e dispositivi ad altissima densità su chip.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché la corretta configurazione e implementazione del software del microscopio non è intuitiva, ma è fondamentale per formare le reti microfluidiche desiderate. Molti dei passaggi preparatori sono trattati nel protocollo di testo, tra cui la generazione delle maschere virtuali, la configurazione del microscopio e il caricamento delle maschere virtuali sul software del microscopio. Per fotopolimerizzare l'idrogel PEGDA, attaccare prima un anello di biadesivo a una capsula di Petri da 60 millimetri che ha un foro di 20 millimetri tagliato sul fondo.

Quindi, in una cappa aspirante, aggiungere un millilitro di HBS con TEOA a una provetta da centrifuga ambrata da due millilitri ricoperta di alluminio. Quindi, aggiungere 10 microlitri di sale disodico di eosina Y millimolare al tubo. Ora, pipettare un piccolo volume di NVP in un becher di vetro utilizzando una pipetta di vetro.

Da questo volume, prendi 3,5 microlitri di NVP e trasferiscili nella miscela. Quindi, aggiungere 10 milligrammi di PEGDA da 3,4 kilodalton a un secondo tubo coperto di alluminio. Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di miscela per ottenere una soluzione di prepolimero PEGDA al 5% in peso in volume.

Ora, agitare la soluzione di prepolimero fino a quando il PEGDA non è completamente disciolto. Quindi, pipettare 60 microlitri su uno stampo PDMS senza introdurre bolle. Ora, centrare un vetrino coprioggetti acrilato da 40 millimetri numero 1,5 sulla soluzione sui distanziatori PDMS.

Quindi posizionare il gruppo sotto una sorgente di luce bianca calibrata per erogare 95 milliwatt. Polimerizza il polimero per tre minuti. Quindi, far scorrere l'acqua distillata tra lo stampo e il vetrino coprioggetti per separare l'idrogel dal PDMS e risciacquare l'idrogel.

Quindi, asciugare accuratamente i bordi del vetrino coprioggetti senza assorbire l'acqua dall'idrogel. A questo punto, far aderire il vetrino coprioggetti alla capsula di Petri preparata. Un po' di pressione aiuta.

Quindi, immergere l'idrogel in acqua distillata. Configurare il microscopio confocale a scansione laser come descritto nel protocollo di testo e iniziare con la configurazione di visualizzazione dell'idrogel. Quindi, montare l'idrogel e la capsula di Petri sull'inserto del tavolino e posizionarlo sul tavolino.

Quindi, riempire la capsula di Petri con almeno cinque millilitri di acqua distillata e abbassare l'obiettivo di immersione in acqua appena sopra l'idrogel senza entrare in contatto con esso. Ora, fai clic su live per attivare la linea laser dell'argon. Quindi, concentrati sull'idrogel fino a quando il segnale Y dell'eosina non può essere visto sul lato superiore dell'idrogel.

Per aiutare a trovare l'idrogel, prova ad aumentare temporaneamente la percentuale di potenza o la dimensione del foro stenopeico. Segnare le posizioni della parte superiore e inferiore dell'idrogel e del fondo del pozzo. Quindi usa il joystick per muoverti trasversalmente e trovare i bordi del pozzo.

Nella finestra di messa a fuoco, abbassa il piano di messa a fuoco di 150 micron all'interno dell'idrogel utilizzando la freccia giù accanto alla casella della posizione Z. Il passo successivo è fondamentale. Azzerare le posizioni X e Y nella finestra dello stage, quindi eliminare tutte le altre posizioni contrassegnate e contrassegnare solo la posizione azzerata.

Ora, per iniziare il processo di formazione di un canale di ingresso, prima scatta un'immagine e poi usa il pulsante del rettangolo nella finestra delle regioni delinea la regione che sarà l'ingresso alla rete vascolare. Quindi passare alla configurazione della formazione del canale. I dettagli sono forniti nel protocollo di testo.

Una volta lì, in una finestra dello stack Z, fai clic sui pulsanti centrali in alto e sopra l'offset per centrare lo stack Z nella posizione corrente. Quindi, a seconda di quanto deve essere grande l'ingresso, impostare il numero di fette con un intervallo di uno. Ora, controlla che la velocità sia impostata su tre e che la percentuale di potenza sia impostata su 100.

Quindi procedi con il salvataggio della configurazione e fai clic sul pulsante Avvia esperimento. Per visualizzare l'idrogel durante la degradazione del canale, aumentare il master del guadagno nella finestra dei canali se la regione nel campo visivo è nera o diminuire il master del guadagno se la regione è bianca. Dopo la degradazione, assicurarsi che l'ingresso sia stato formato tornando alla configurazione di visualizzazione dell'idrogel e facendo clic su live.

Innanzitutto, nella finestra delle regioni, carica qualsiasi file ovl dallo stack Z di maschere virtuali e fai clic sul pulsante freccia per vedere le ROI nel campo visivo. Quindi, fare clic in tempo reale per eseguire la scansione della configurazione di visualizzazione dell'idrogel e utilizzare il joystick o la finestra del tavolino per posizionare l'idrogel in modo che l'ingresso si colleghi alla posizione corretta all'interno della rete vascolare. Quindi, abbassare il piano di messa a fuoco alla prima posizione nella macro del microscopio, che è in basso di 50 micron rispetto alla precedente posizione Z centrata utilizzando la dimensione del passo nella finestra di messa a fuoco e facendo clic sulla freccia giù.

Anche in questo caso, è fondamentale azzerare nuovamente le posizioni X e Y, eliminare tutte le altre posizioni contrassegnate e contrassegnare solo questa posizione come nuovo punto zero. Assicurarsi di salvare questa nuova configurazione. A questo punto, nella configurazione della formazione del canale, selezionare solo le serie temporali e le finestre di sbiancamento.

Quindi, apri la macro e seleziona la scheda di salvataggio. Seleziona la ricetta creata in precedenza e fai clic su Applica. Assicurati di non fare clic su Memorizza, altrimenti la ricetta verrà sovrascritta.

Dopo aver verificato le impostazioni, salvare nuovamente la configurazione della formazione del canale e quindi fare clic su Aggiorna nella macro del microscopio. Fare clic su no per sovrascrivere l'elenco delle posizioni correnti, quindi fare clic su Avvia nella macro del microscopio per iniziare la ricetta. Al termine del processo di degradazione, utilizzare la configurazione di visualizzazione dell'idrogel a una potenza laser inferiore per consentire la visualizzazione del destrano marcato con FITC, che ha un segnale più luminoso rispetto al segnale Y dell'eosina nativa dell'idrogel.

Prima di introdurre il destrano marcato in modo fluorescente, aspirare un po' d'acqua dal pozzo nell'idrogel. Quindi pipettare in 10 microlitri di destrano filtrato marcato con FITC. La procedura descritta è stata utilizzata per convertire un grande volume di immagini microvascolari in una serie di maschere virtuali per la formazione di reti microfluidiche guidate da immagini.

La rete microfluidica risultante è stata confrontata con la vascolarizzazione in vivo da cui derivava. La degradazione dell'idrogel basata su laser guidata da immagini ha permesso la fabbricazione di reti microfluidiche biomimetiche 3D che ricapitolano le dimensioni, la tortuosità e l'architettura complessa della vascolarizzazione in vivo. Le teste di pressione e le pompe a siringa sono state utilizzate per avviare il flusso di fluidi in queste reti microfluidiche incorporate.

Sono state osservate perle di destrano da 70 kilodalton marcate in fluorescenza e di polistirene da 10 micron che si muovevano da sinistra a destra mediante un flusso indotto da una testa di pressione. In alternativa, il flusso azionato dalla pompa a siringa è stato avviato fotopolimerizzando un idrogel all'interno di un dispositivo microfluidico secondario. Utilizzando lo stesso protocollo qui descritto, è stata quindi implementata la degradazione basata su laser per fabbricare una rete di derivazione vascolare 2D in un idrogel alloggiato per il flusso guidato dalla pompa a siringa e la profusione di 65 kilodalton di destrano.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di un laser a impulsi a femtosecondi per generare reti microfluidiche biomimetiche utilizzando la degradazione dell'idrogel basata su laser guidata da immagini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i parametri del laser, tra cui la potenza, la lunghezza d'onda e la velocità di scansione, devono essere regolati e ottimizzati in base alla formulazione dell'idrogel da degradare.

Grazie e buona fortuna per i tuoi esperimenti.