Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come
21 ottobre 2017
Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.
Il seguente protocollo ha lo scopo di mostrare l'isolamento di un astrocita primario dal cervello di cuccioli di ratto per eseguire la privazione di ossigeno e glucosio o OGD. Esposizione di astrociti purificati, ad ambienti privi di ossigeno glucosio è un modulo che ci permette di testare la reazione ad alcune delle condizioni riscontrate negli ictus ischemici. I cambiamenti metodici, dopo l'esposizione all'ossigeno, la privazione di glucosio possono essere osservati e misurati utilizzando marcatori astrocitari selettivi come la GFAP.
In sintesi, queste cellule isolate esposte a condizioni di tipo ischemico possono essere utilizzate per testare nuove parti attivate in condizioni di ipossia e altri farmaci che proteggono dall'ictus ischemico. In questa parte del protocollo gli astrociti saranno isolati da cortecce di ratto cucciolo. Lo scopo di questa procedura è quello di ottenere una coltura primaria di cellule astrocitiche per eseguire esperimenti di privazione di ossigeno e glucosio.
I materiali per questa procedura sono i seguenti, Autoclavare tutti i materiali prima di utilizzarli in questa procedura. Ed esporre la cappa ad almeno 20 minuti di luci UV prima di iniziare il protocollo. Per iniziare questa procedura, pipettare da tre a cinque millilitri di terreno DME completo in ciascuna piastra.
Sarà diviso come segue, uno per ogni cervello di topo, due per tutte le cortecce e tre saranno per tutte le cortecce senza le meningi. Decapitare un cucciolo dopo averlo disinfettato con etanolo al 70%. Praticare un'incisione partendo dalla parte posteriore della testa verso il naso.
Rimuovere il cranio con una pinza curva e raschiare delicatamente il cervelletto esponendo le cortecce. Rimuovere il cervello esposto con un paio di pinzette e posizionare il cervello nella prima capsula di Petri con il terreno. Ripeti questi passaggi per tutti gli altri cuccioli.
Separare gli emisferi cerebrali dividendoli delicatamente lungo la fessura della linea mediana con l'estremità affilata della pinza per micro dissezione. Sbuccia le cortecce rimuovendo la sostanza bianca e l'ippocampo usando le pinzette con un movimento di pizzicamento, lasciandole indietro. Trasferisci le cortecce di buccia nella capsula di Petri etichettata con il numero due.
Ripetere la procedura per tutti i cervelli combinando tutte le cortecce sezionate nella capsula di Petri. Agitare delicatamente il piatto per distribuire equamente il terreno tra tutte le cortecce. Utilizzare il microscopio da dissezione per identificare le meningi che rivestono le cortecce sbucciate.
Le meningi sono uno strato trasparente molto sottile che può essere identificato ricercando i piccoli capillari rossi che circondano il tessuto. Ispezionare attentamente e rimuovere le meningi che rivestono le cortecce e staccarle delicatamente dai singoli lobi corticali usando una pinzetta sottile su entrambi i lati di ciascuna corteccia. Metti le cortecce pulite in una nuova capsula di Petri etichettata con la numero tre.
Per la dissociazione dei tessuti con il metodo dello stomaco o del frullatore, versare le cortecce pulite e sbucciate e il terreno dalla capsula di Petri in una busta per frullatore sterile. E aggiungi abbastanza terreno per portare il volume totale della borsa a cinque millilitri. Posizionare il sacchetto nello stomacher 80 lasciando circa due centimetri del sacchetto visibili sopra lo sportello chiuso.
La dissociazione cellulare in questo strumento viene eseguita dopo 2,5 minuti ad alta velocità. In alternativa, la dissociazione tissutale può essere effettuata chiudendo la sacca sterile e picchiettando delicatamente il tessuto con un becher nel cappuccio fino a quando le particelle di tessuto non sono diventate una sospensione fine. Assicurati di utilizzare un panno tra il sacchetto e il bicchiere per evitare attriti e rotture del sacchetto.
Versare la sospensione cellulare al centro del manicotto con una maglia numero 60. Versare le celle filtrate al centro di una maglia numero 100 permettendole di filtrare per gravità. Versare la sospensione cellulare filtrata in una provetta conica da 15 millilitri.
Al centro fuge la sospensione della cella a 200 volte G in un centro fuge preferibilmente con una fresatrice a benna oscillante per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e gettarlo in un bicchiere. Aggiungi nuovi media completi alla tavolozza delle celle.
Utilizzando una pipetta sierologica, risospendere e dissociare la tavolozza di cellule in un massimo di cinque millilitri di terreno. Aggiungere la quantità desiderata di sospensione cellulare su un pallone e completare con il terreno. Aggiungere la tavolozza risospesa nel pallone con il mezzo.
Distribuire uniformemente le cellule in tutto il pallone e metterle in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Ricordati di cambiare i media ogni tre giorni. La seguente metodologia ha lo scopo di privare le cellule di ossigeno e glucosio in un ambiente controllato.
Lo scopo di questo modello è studiare la risposta degli astrociti in una condizione di ictus di tipo ischemico. I materiali utilizzati per questa procedura sono, Spurgare il mezzo privo di glucosio inserendo una pipetta sierologica collegata al sistema del gas. Far bollire la soluzione con la miscela di gas per 10 minuti a un flusso di 10-15 litri al minuto.
Al termine dei 10 minuti, regolare il pH del terreno OGD a 7,4. Filtrare il mezzo privo di glucosio spurgato utilizzando il sistema di filtraggio a tubo da 50 millilitri. È importante preparare sempre un terreno OGD fresco per ogni esperimento.
Ciò garantirà che il fluido venga spurgato dall'ossigeno. Rimuovere i terreni astrocitari e lavare con PBS cellulare due volte per rimuovere il glucosio dalle cellule. Aggiungere il terreno OGD ai pozzetti.
Posizionare la capsula a più pozzetti con il coperchio aperto all'interno della camera di ipossia. Collegare la miscela di gas alla valvola di ingresso e lasciare aperta la valvola di uscita. Lavare la camera con la miscela di gas a 10-15 litri al minuto, per cinque-sette minuti.
Arrestare il flusso di gas e chiudere prima la fascetta sulla valvola di uscita. Quindi, chiudere la fascetta sul tubo della valvola di ingresso del gas. Posizionare la camera ipossica nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato in OGD.
Al termine del tempo di incubazione, aspirare il terreno OGD e aggiungere con cura DMEM completo alle cellule per la condizione normossica. Riportare le cellule nell'incubatore di coltura per zero 24 e 48 ore in condizioni normossiche. Questo protocollo descrive l'isolamento di astrociti da cortecce di ratto neonatale.
Dopo aver convalidato la purezza delle colture primarie, sono stati eseguiti esperimenti OGD. In questo modello di tipo ischemico, la privazione di glucosio e ossigeno ha indotto un cambiamento più fologico che è stato monitorato dall'immunofluorescenza utilizzando marcatori astrocitici come GFAP o marcatori di proliferazione come PCNA. Uno dei vantaggi di questo modello è che ci permette di studiare una risposta specifica del tipo cellulare.
Anche se il limite di questa tecnica è la mancanza di interazione cellula-cellula a causa dell'isolamento degli astrociti. Uno dei modi possibili per superare questa limitazione è quello di esporre gli astrociti a terreni condizionanti di altri tipi di cellule o a una co-coltura. In sintesi, il metodo di privazione di ossigeno e glucosio in un sistema cellulare isolato, ci consente di testare direttamente gli effetti di diverse molecole neurali protettive o neurotossiche.
Inoltre, è un valido strumento per studiare la biologia degli astrociti. Infine, questo modello pone una solida base per lo studio di farmaci in via di sviluppo in condizioni sperimentali utilizzando modelli in vivo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento di astrociti primari dai cervelli di ratti neonati allo scopo di studiarne la risposta alla privazione di ossigeno e glucosio (OGD), una condizione che simula l'ictus ischemico. La metodologia consente ai ricercatori di osservare le variazioni nella reattività e nella proliferazione degli astrociti in condizioni di OGD.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sull'ictus
Sfondo
- L'ictus ischemico comporta complesse risposte cellulari.
- Gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nel danno cerebrale e nel recupero.
- Lo studio degli astrociti in condizioni di deprivazione di ossigeno e glucosio può rivelare informazioni importanti.
- Marker selettivi come GFAP vengono utilizzati per valutare le modifiche negli astrociti.
Scopo dello studio
- Isolare astrociti primari per l'analisi sperimentale.
- Studiare il comportamento degli astrociti in condizioni simili all'ischemia.
- Testare potenziali farmaci protettivi contro l'ictus ischemico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di astrociti primari dai cortici di ratto neonato.
- Esposizione degli astrociti alla privazione di ossigeno e glucosio.
- Misurazione della reattività degli astrociti mediante marcatori GFAP.
- Valutazione delle risposte cellulari a condizioni ipossiche.
Risultati principali
- Gli astrociti isolati mostrano cambiamenti misurabili in condizioni di OGD.
- I marcatori GFAP indicano l'attivazione degli astrociti.
- È possibile identificare i percorsi potenziali attivati in risposta all'ipossia.
- I risultati potrebbero fornire indicazioni per strategie terapeutiche nell'ictus ischemico.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'isolamento degli astrociti.
- Comprendere le risposte degli astrociti può contribuire alla ricerca sull'ictus.
- Studi futuri potranno esplorare l'efficacia dei farmaci nella protezione degli astrociti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La reattività e la proliferazione degli astrociti in condizioni simili all'ischemia sono fondamentali per comprendere i meccanismi cellulari che determinano il danno cerebrale e il processo di riparazione dopo un ictus. Questo modello in vitro di deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) permette un'analisi precisa delle risposte specifiche degli astrociti, sostenendo la previsione affidabile della validazione precoce di bersagli neuroprotettivi. L'approccio fornisce indicazioni per il progresso mirato dei candidati neuroterapeutici, isolando i percorsi mediati dagli astrociti e gli effetti dei fattori solubili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica isolando le risposte degli astrociti allo stress ischemico.
- Supporta la validazione funzionale delle target mediante l'analisi quantificabile dei marcatori GFAP e PCNA.
- Facilita l'analisi dei percorsi molecolari per lo screening di composti neuroprotettivi o neurotossici.
- Fornisce un sistema controllato per la valutazione basata su ipotesi della biologia degli astrociti.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce modelli in vitro validati e riproducibili per lo screening di composti in condizioni di OGD.
- Standardizza letture quantitative della reattività e proliferazione degli astrociti per lo sviluppo di saggi.
- Consente la raccolta di mezzi condizionati da astrociti per saggi neuronali successivi.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma in programmi di neuroinfiammazione e neuroprotezione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro ai meccanismi ischemici rilevanti per la malattia osservati in vivo.
- Permette l'esplorazione traslazionale di biomarcatori mediante l'analisi di fattori solubili derivanti da colture di astrociti.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di strategie neuroprotettive.
- Fornisce una riduzione del rischio predittiva per la selezione di candidati prima degli studi sugli animali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di astrocita basato sull'OGD si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando studi meccanicistici iniziali con la ricerca traslazionale nell'ambito dell'ictus e della neuroprotezione.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in sistemi di astrociti isolati.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili per la valutazione di composti in condizioni di stress simile all'ischemia.
- Analisi: Permette la misurazione di GFAP, PCNA e fattori solubili per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le risposte degli astrociti in vitro agli esiti funzionali e ai biomarcatori in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per i flussi di R&S su neuroinfiammazione e neuroprotezione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta di neuroterapie.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità degli saggi pertinenti all'ischemia.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce del rischio biologico.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di candidati neuroprotettivi adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule primarie e nella modellizzazione in vitro dell'ipossia.
- Richiede l'accesso a camere ipossiche, sistemi di controllo dei gas e analisi di immunofluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei parametri di esposizione alla deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) e della quantificazione dei marcatori.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie o regioni cerebrali in base alle esigenze del portafoglio.
- È limitato dall'assenza di interazioni tra cellula e cellula; potrebbero essere necessari approcci di co-coltura o di condizionamento del mezzo per una maggiore rilevanza traslazionale.
