Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno
December 28th, 2016
Qui, presentiamo protocolli di coltura cellulare umana per analizzare i fattori di inizio della traduzione che legano il cappuccio 5' dell'mRNA durante le condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del tappo m7GTP legato all'agarosio ed è adatto per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del cappuccio a sette metil-guanosina collegato all'agarosio per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo della sintesi proteica, come l'identificazione di nuovi fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap dipendente.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono conservate in una workstation per ipossia fino al punto di lisi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché le cellule tumorali all'interno di un tumore sono esposte a livelli molto bassi di ossigeno e il controllo traslazionale svolge un ruolo chiave nella progressione del tumore. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto una recente pubblicazione dei colleghi di Corona che riportava che l'ossigenazione dei tessuti è in realtà più vicina a quella che chiamiamo ipossia piuttosto che alla normalità in cui le cellule vengono abitualmente coltivate.
Iniziare questa procedura con la coltura cellulare come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, alimentare piastre coltivate da 150 millimetri contenenti 15 millilitri di terreno completo per ottenere una densità cellulare da 2500 a 5000 cellule per centimetro quadrato. Utilizzare due piastre da 150 millimetri per ogni saggio di legatura del tappo.
Posizionare i piatti di coltura con semi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e un'atmosfera di anidride carbonica del cinque percento. Dopo che le cellule sono state incubate per almeno 24 ore, posizionare le cellule in una postazione di lavoro per ipossia per il tempo desiderato. Quindi, impostare la workstation sulla fisiossia appropriata.
Preriscaldare una soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e la tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aliquotare 980 microlitri di tampone di lisi in una provetta da centrifuga da 1,5 microlitri per ogni saggio di legame del tappo in corso. 10 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi 100X e 10 microlitri di idrocloruro di fluoruro 4-benzensulfonilico ai 980 microlitri di tampone di lisi su ghiaccio.
Gettare i supporti da ogni piatto da 150 millimetri in un contenitore per rifiuti all'interno della workstation per ipossia. Quindi, lavare le celle con tre o quattro millilitri di un X PBS caldo e scartare il liquido. Aggiungere un millilitro di tripsina EDTA calda allo 05% a ciascun piatto e lasciare riposare i piatti per due minuti o fino a quando le cellule non aderiscono più al piatto.
Utilizzando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ripetere l'operazione se necessario in modo che ogni piastra di cellule venga trasferita in una provetta per microcentrifuga separata da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 6000 volte g per 90 secondi per pellettare le cellule.
Dopo la centrifugazione, aspirare la tripsina utilizzando una pipetta senza disturbare il pellet. Lavare le cellule con un X PBS caldo pipettando delicatamente 200 microlitri di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Quindi aspirare il PBS senza disturbare il pellet.
Quindi, pipettare 500 microlitri dalla soluzione tampone di lisi preparata da un millilitro sul primo pellet cellulare. Risospendere completamente il pellet pipettandolo su e giù. Combinare le celle ri-sospese con il pellet della seconda cella e risospendere il secondo pellet pipettandolo su e giù.
Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e ri-sospesi per ogni campione. Successivamente, combina il lisato con i restanti 500 microlitri di tampone di lisi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 litri. Rimuovere i campioni dalla postazione di lavoro per l'ipossia.
Liare le cellule con una leggera agitazione ruotando i campioni a quattro gradi Celsisus per 1,5-2 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule lisate a 1200 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e gettare il pellet.
Riservare una parte del surnatante da utilizzare come controllo dell'input del lisato a cellule intere per l'analisi del western blot. Per prepararsi al test di legatura del tappo, utilizzare le forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta dell'impasto delle perle. Per ogni trasferimento del campione, 50 microlitri di liquame bianco di controllo delle perle di agarosio e 50 microlitri di liquame di perle di agarosio C10 m7GTP per separare le provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi, pellettare le perle centrifugando l'impasto a 500 volte g per 30 secondi. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le perle in 500 microlitri di TBS. Dopo aver ripetuto questi passaggi, pellettare le perline a 500 volte g per 30 secondi e rimuovere il surnatante.
Quindi, trasferire il surnatante contenente il lisato nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio vuote. Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con leggera agitazione. Dopo 10 minuti, pellettare le perle di agarosio vuote centrifugando a 500 volte g per 30 secondi.
Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato che non si lega alle perle nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio C10 m7GTP. Lavare le perle di agarosio vuote risospendendole in 500 microlitri di tampone di lisi, pellettando le perle centrifugando a 500 g di tempo per 30 secondi e scartando il surnatante. Ripetere l'operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi.
Risospendere le perle di agarosio vuote in un tampone per campioni X SDS-PAGE. E fai bollire le perline per 90 secondi a 95 gradi Celsius. Conservare il campione a 20 gradi Celsius per future analisi Western Blot per osservare il tempo in cui la proteina di interesse si lega in modo non specifico alla perlina.
Incubare il lisato con le perle di agarosio M7GTP legate al C10 con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsuis per catturare le proteine che legano il cappuccio. Dopo l'agitazione, pellettare le perle legate all'agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le perle di agarosio C10 m7GTP come prima.
Risospendere le perle in 600 microlitri di tampone di lisi e aggiungere GTP a una concentrazione finale di un millimolare. Incubare le perle di agarosio C10 m7GTP più un millimolare di GTP con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Questo dissocierà le proteine che interagiscono in modo non specifico con m7GTP.
Pellettare le perle di agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 200 microlitri di quattro tamponi per campioni X SDS-PAGE. Dopo aver lavato le perle come prima, sospenderle nuovamente in un tampone per campioni X SDS-PAGE e far bollire a 95 gradi Celsius per 90 secondi.
Qui sono mostrati western blot rappresentativi di una tipica purificazione di affinità m7GTP di due principali proteine leganti il cappuccio in risposta alle fluttuazioni di ossigeno nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale renale umano primario. I lisati cellulari sono stati esposti all'otto percento, al cinque percento, al tre percento o all'uno percento di ossigeno per 24 ore. Le corsie includono il 10% dell'intero lisato cellulare come input, un GTP lavato per misurare la specificità per m7GTP e le proteine legate alle perle di m7GTP dopo il lavaggio GTP.
I dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati dall'immagine J ed espressi come unità di densità relativa rispetto al 10% di input dell'intero lisato cellulare. I risultati indicano che le cellule umane coltivate sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine leganti il cappuccio per reclutare mRNA distinti per la traduzione. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere le cellule nella workstation di ipossia fino al punto di lisi, poiché l'ossigeno può alterare rapidamente le proprietà biochimiche di questi fattori di inizio della traduzione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il frazionamento dei polisomi, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine che legano il tappo si associano alla traduzione attiva in condizioni di basso ossigeno.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per analizzare i fattori di inizio della traduzione che si legano al cap 5' dell'mRNA in condizioni di basso ossigeno. Utilizzando un analogo del cap m7 GTP legato all'agarosa, questa tecnica mira a identificare nuovi fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione dipendente dal cap.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Sintesi proteica
Sfondo
- Le proteine leganti il cap svolgono un ruolo cruciale nell'inizio della traduzione.
- Le cellule nei tumori spesso sperimentano condizioni ipossiche.
- Comprendere la traduzione a basso ossigeno può informare la terapia del cancro.
- Studi recenti suggeriscono che l'ossigenazione dei tessuti è spesso più vicina all'ipossia che alla normossia.
Obiettivo dello studio
- Catturare le proteine leganti il cap in condizioni di basso ossigeno.
- Investigare l'interazione dei fattori leganti il cap e i loro partner.
- Identificare nuovi fattori che regolano la traduzione in condizioni ipossiche.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di un analogo del cap m7 GTP legato all'agarosa.
- Coltura cellulare mantenuta in una stazione di lavoro ipossica fino alla lisi.
- Analisi delle interazioni proteiche sotto livelli controllati di ossigeno.
- Applicazione del metodo per studiare il controllo traduzionale nelle cellule tumorali.
Risultati principali
- Cattura con successo di proteine leganti il cap in condizioni ipossiche.
- Identificazione di nuovi fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione.
- Approfondimenti sul ruolo del controllo traduzionale nella progressione tumorale.
- Validazione dell'efficacia del metodo nello studio della sintesi proteica.
Conclusiioni
- Questo metodo fornisce un nuovo approccio allo studio dei fattori di inizio della traduzione.
- I risultati possono avere implicazioni per la comprensione della biologia del cancro.
- Ulteriori ricerche potrebbero migliorare le strategie terapeutiche mirate ai tumori ipossici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
