Name: Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri l'analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo m7GTP per identificare fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap-dipendente.

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Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio di Scienze Naturali e Ingegneria del Canada e dal Ministero della Ricerca e dell'Innovazione dell'Ontario.

1. Preparativi per colture cellulari <ol><li> Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane. NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l&#39;1% P / S. </li><li> Preparare 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS): 140 mm NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mm KH 2 PO 4. Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave per 40 minuti a 121 ° C. </li></ol> 2. Apertura di Cell Coltura <ol><li> Con attenzione aspirare il medium da un piatto confluenti 80-90% senza disturbare tegli cellule. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico 0,05% (EDTA) in ogni piatto cultura e delicatamente in modo uniforme di roccia per rivestire le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 4000 xg per 90 sec. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di DMEM completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare quanti apirogene e polistirolo 100 millimetri cella cultura piatti sono necessari per raggiungere una densità di semina iniziale di circa 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> terreno completo Pre-caldo coltura cellulare made in passi 1.2 o 1.3 in un bagno d&#39;acqua C 37 ° C per 30-45 minuti. </li><li> Decontaminare la bottiglia medio e fiala cella con il 70% di etanolo. Da questo punto in avanti tuttile operazioni devono essere eseguite in modo asettico. </li><li> Aliquotare 6 ml di DMEM completo in altrettante piatti di coltura cellulare 100 mm richiesti per utilizzare l&#39;intero volume di cellule congelate nella densità di semina di cui al punto 2.6. </li><li> Trasferire il volume di sospensione cellulare calcolata al punto 2.6 a ciascuno dei piatti 100 coltura mm. Oscillare ciascuna piastra manualmente per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra. </li><li> Posizionare la testa di serie 100 millimetri piatto di coltura cellulare in incubatore a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima che i passi successivi. </li></ol> 3. Trapianto <ol><li> Mostra ogni piatto di coltura cellulare al microscopio per determinare la percentuale di confluenza cellule (cellule% coprono l&#39;area del piatto). le cellule per l&#39;incubatore e pre-caldo terreno completo e PBS 1x Return. Procedere al passaggio successivo, se le cellule sono 80-100% confluenti. </li><li> aspirare accuratamente la media trascorsa senza disturbare ilcellule in ogni piatto cultura. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA in ogni piatto cultura e agitare delicatamente per rivestire in modo uniforme le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Durante questa incubazione, un&#39;aliquota di 10 ml di terreno completo in altrettanti piatti della cultura sono necessari per ottenere la densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> Quando le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere rapidamente 3 ml di inibitore della tripsina 1x definito e miscelare delicatamente il piatto per 1 min per garantire che tutte le tripsina-EDTA è stato neutralizzato. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una sterile 15 ml provetta e mettere da parte. Aggiungere 3 ml di PBS 1X per il piatto per raccogliere tutte le cellule rimanenti e il trasferimento che per lo stesso 15 ml provetta. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 150 xgper 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mezzo completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 150 mm piastre di coltura contenente 15 ml di terreno completo per ottenere una densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. Utilizzare due di 150 mm per ogni test cap-binding. NOTA: diffusione di ossigeno alle cellule tramite mezzo liquido dipende dal volume di 36. Si raccomanda di mantenere il volume dei mezzi coerenti tra esperimenti se le cellule aderenti o cellule in sospensione sono utilizzati. I supporti possono essere pre-condizionati (incubate nella postazione di lavoro per 24 ore, come discusso in discussione) per evitare questi variabilità in diffusione. </li><li> Porre le capsule testa di serie-cultura nel termostato a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima di procedere alle fasi successive. </li></ol> 4. L&#39;esposizione Physioxic <ol><li> Visualizza le cellule sotto il microscopio. per besrisultati t, in modo che le cellule sono 70-80% confluenti per una esposizione di 24 ore, il 50-60% confluenti per un&#39;esposizione 48 ore, e il 40-50% confluenti per un&#39;esposizione 72 ore. </li><li> Posizionare le cellule in una workstation ipossia per il tempo desiderato (24, 48, o 72 ore a seconda dell&#39;esperimento). </li><li> Impostare la workstation per la physioxia appropriata. NOTA: Ad esempio, un&#39;impostazione 3% O 2 sarebbe accompagnata da 5% di CO 2 e il 92% N 2. NOTA: Se le fluttuazioni di ossigeno all&#39;interno di una gamma dinamica si desiderano su una linea temporale specifico, il programma il programma nello strumento o regolare manualmente le impostazioni di ossigeno agli intervalli desiderati. </li><li> Impostare l&#39;umidità al 60%. L&#39;atmosfera workstation è molto secca comunque, e dei media sarà notevolmente evapora durante lunghi esperimenti (&gt; 48 ore). Mantenere una riserva media in un pallone di coltura di cellule all&#39;interno della stazione di lavoro (in modo che il supporto viene equilibrato con l&#39;ambiente workstation) per ricostituire i mezzi di comunicazione nel DIS coltura cellularelui è. NOTA: Ogni soluzione che interagirà con le cellule prima di lisi (come PBS e tripsina-EDTA) deve essere pre-condizionato per 24 ore prima dell&#39;uso nella workstation ipossia in modo che l&#39;ossigeno disciolto equilibra con l&#39;ossigeno atmosferico 36. </li><li> Mantenere le cellule all&#39;interno della stazione di lavoro fino lisi. </li></ol> 5. Buffer Preparazione per il saggio Cap-binding <ol><li> Preparare 1x Tris-Buffered Saline (TBS). <ol><li> In 800 ml di dH 2 O, sciogliere 8,76 g di NaCl e 6,05 g Tris Base. </li><li> Portare la soluzione ad un pH finale di 7,4 usando 1 M HCl. </li><li> Portare il volume finale di 1 L con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparare tampone di lisi non denaturazione. Preparare Lysis Buffer il giorno del test tappo vincolante. Fare tampone di lisi in più per lavare le perline agarosio vuote e la γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked (passi 7.9 e 7.13). <ol><li> In 7 ml di dH 2 O, aggiungere 160 ml 5 M NaCl, 160 microlitri 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 microlitri 200 mM NaF, 40 microlitri 1 M MgCl 2 e 40 microlitri 1 mM sodio orthovanadate. </li><li> Aggiungere 40 ml di Igepal alla soluzione 7 ml. Tagliare la punta della pipetta per aiutare recuperare Igepal in quanto è estremamente viscoso. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, o vortice, la soluzione 7 ml finché tutti i Igepal è stato dissolto. </li><li> Aumentare il volume finale della soluzione a 8 ml e tenere in ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare 4x dodecil solfato di sodio (SDS) -page Sample Buffer. <ol><li> In un becher, unire 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml di glicerolo, e 8 ml ditiotreitolo (DTT). </li><li> Aggiungere 3,2 g di SDS e 0,16 g di blu di bromofenolo. Lasciare in polvere per sciogliere completamente mescolando con un bastoncino magnetico. </li><li> Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. cellulare Lysis <ol><li> Preparare non denaturazione-tampone di lisi e tenere in ghiaccio il giorno di The cap-binding assay. </li><li> Pre-calda 1x PBS e tripsina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. </li><li> Aliquota 980 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni test cap-binding in corso di esecuzione. </li><li> Aggiungere 10 ml di 4- (2-amminoetil) benzensolfonile fluoruro cloridrato e 10 ml di 100x cocktail di inibitori delle proteasi ai 980 ml di tampone di lisi. Tenere in ghiaccio. </li><li> Eliminare il supporto da ogni piatto 150 millimetri in un contenitore di rifiuti all&#39;interno della stazione di lavoro ipossia. </li><li> Lavare le cellule con 3-4 ml di caldo 1x PBS e scartare tutto il liquido. </li><li> Aggiungere 1 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto e lasciate riposare per 2 minuti o fino a quando le cellule non sono rispettate piastra. </li><li> Usando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere se necessario in modo che ciascuna piastra di cellule viene trasferito in un 1,5 ml provetta separata. </li><li> Centrifugare le provette da 1,5 ml microcentrifuga a 6.000 g per 90 sec to agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare il tripsina con una pipetta senza disturbare il pellet. Se il pellet è disturbato, ri-centrifugare la provetta da 1,5 ml a 6.000 g per 90 sec. </li><li> Lavare le cellule con caldo PBS 1x pipettando gentilmente 200 ml di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Re-centrifuga se il pellet è disturbato. </li><li> Aspirare il PBS senza disturbare il pellet. </li><li> Pipettare 500 microlitri dalle 1 ml preparati soluzione tampone di lisi sul primo pellet cellulare. Risospendere il pellet interamente pipettando su e giù. </li><li> Combinare le cellule risospese con il secondo pellet di cellule e risospendere il secondo pellet pipettando su e giù. Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e risospese per ogni campione. </li><li> Combinare il lisato con i restanti 500 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Rimuovere campioni dalla workstation ipossia. NOTA: Dopo aver aggiunto tampone di lisi, unall fasi successive devono essere eseguite in aria ambiente come workstation ipossia è impostato a 37 ° C e le seguenti operazioni devono essere eseguite a freddo (4 ° C o su ghiaccio). </li><li> Lisare le cellule utilizzando blanda agitazione ruotando i campioni a 4 ° C per 1,5-2 ore. </li><li> Centrifugare le cellule lisate a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Trasferire il lisato in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet. </li><li> Prenotare una porzione (5-10%) del surnatante da utilizzare nel suo complesso controllo di input lisato cellulare per future analisi western blot. </li></ol> 7. Assay Cap-binding <ol><li> Per ogni campione, trasferire 50 ml di vuoto agarosio liquami controllo tallone e 50 ml di liquame tallone γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-linked per separare 1,5 ml microprovette. Utilizzare forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta della poltiglia tallone. </li><li> Agglomerare le perline by centrifugazione della poltiglia a 500 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante con attenzione e risospendere le sfere in 500 ml di TBS. </li><li> Ripetere i punti 7.2 e 7.3. Agglomerare le perline a 500 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante. </li><li> Trasferire il surnatante contenente il lisato dal punto 6.19 al tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le perline agarosio vuote. NOTA: Le perle di agarosio bianco agiscono come una fase di pre-compensazione per rimuovere le proteine ​​dal lisato che interagiscono in modo non specifico con il tallone. </li><li> Incubare per 10 minuti a 4 ° C con agitazione. </li><li> Pellet le perline agarosio vuote per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il lisato alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked. </li><li> Lavare le perline agarosio vuote da risospendere le sfere in 500 ml di tampone di lisi, pellet le perline per centrifugazione a 500 xg per 30 secondi, e scartando la Supernatant. Ripetere questa operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi. </li><li> Risospendere le sfere agarosio vuote nel tampone campione 1x SDS-PAGE, e far bollire le perline per 90 secondi a 95 ° C. Conservare a -20 ° C per una futura analisi western blot per osservare se la proteina di interesse si lega in modo non specifico per il tallone. </li><li> Incubare il lisato con le perline γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-collegate con agitazione per 1 ora a 4 ° C per catturare le proteine di legame della cap. </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 600 microlitri di tampone di lisi. </li><li> Aggiungere GTP ad una concentrazione finale di 1 mM. </li><li> Incubare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked + 1 mM GTP con agitazione per 1 ora a 4 ° C. Nota: Questosarà dissociarsi proteine che interagiscono in modo non specifico con m 7 GTP (vale a dire, di interagire anche con GTP non metilato). </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ml di 4x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo). Conservare il campione di controllo GTP a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. Lavare le perline ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 1x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) e ebollizione a 95 ° C per 90 sec. Conservare il m frazione 7 GTP-bound a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l&#39;identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L&#39;affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 &#39;può essere misurata con la forza della loro associazione di m 7 GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine ​​post-lisi, ma e...

Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell&#39;espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare 1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 &#39;tappo di mRNA 2 . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l&#39;assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del ribosoma 3. In condizioni fisiologiche normali, la stragrande maggioranza degli mRNA vengono tradotti attraverso un meccanismo di cap-dipendente, ma sotto i periodi di stress cellulare circa il 10% di mRNA umani contiene 5 &#39;UTR che potrebbero consentire di traduzione cap-indipendente rito di iniziazione 1,4. traduzione Cap-dipendente è stata storicamente sinonimounità organizzative con eIF4F, tuttavia, le variazioni specifiche di stress di eIF4F sono diventati un argomento di tendenza 5-8. Vari stress cellulari causano attività eIF4E da reprimere attraverso la mammalian target of complesso rapamicina 1 (mTORC1). Questa chinasi diventa compromessa sotto stress, che provoca l&#39;aumento di attività di uno dei suoi obiettivi, la proteina 4E-binding (4E-BP). Non fosforilata 4E-BP si lega ad eIF4E e blocca la sua capacità di interagire con eIF4G causando la repressione della traduzione cap-dipendente 9,10. È interessante notare che, un omologo di eIF4E chiamato eIF4E2 (o 4EHP) ha un&#39;affinità molto più basso per 4E-BP 11, forse permettendogli di eludere la repressione dello stress-mediata. Infatti, inizialmente caratterizzato come un repressore della traduzione a causa della sua mancanza di interazione con eIF4G 12, eIF4E2 avvia la traduzione di centinaia di mRNA che contengono RNA elementi di risposta all&#39;ipossia nella loro 3 &#39;UTR durante lo stress ipossico 6,13. Questo mi attivaziones raggiunto attraverso le interazioni con eIF4G3, RNA-binding protein 4 motivo, e il fattore inducibile dall&#39;ipossia (HIF) 2α a costituire un complesso eIF4F ipossica, o eIF4F H 6,13. Come un repressore in condizioni normali, eIF4E2 si lega con GIGYF2 e ZNF598 14. Questi complessi sono stati, in parte, identificati attraverso Agarose-linked m 7 resine GTP affinità. Questo metodo classico 15 è standard nel campo della traduzione ed è i saggi migliore e più tecnica comunemente usata per isolare complessi cap-binding in pull down e in vitro di legame 16-19. Come le macchine di traduzione cap-dipendente sta emergendo come flessibile ed adattabile con le parti tra loro cambiare 6-8,13, questo metodo è un potente strumento per individuare rapidamente nuove proteine di legame della cap coinvolti nella risposta allo stress. Inoltre, le variazioni di eIF4F potrebbe avere vaste implicazioni come diversi sistemi modello eucarioti sembrano utilizzare un omologo eIF4E2 per le risposte di stress talicome A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, e C. elegans 23. L&#39;evidenza suggerisce che le variazioni di eIF4F non possono essere strettamente limitato a condizioni di stress, ma essere coinvolti nella fisiologia normale 24. La fornitura di ossigeno ai tessuti (alle estremità capillari) o all&#39;interno dei tessuti (misurata tramite microelettrodi) varia dal 2-6% nel cervello 25, 3-12% nei polmoni 26, 3.5-6% nell&#39;intestino 27, 4% in il fegato 28, 7-12% nel rene 29, 4% nel muscolo 30, e 6-7% nel midollo osseo 31. Le cellule e mitocondri contengono meno del 1,3% di ossigeno 32. Questi valori sono molto più vicini a ipossia che l&#39;aria ambiente in cui le cellule sono normalmente coltivate. Questo suggerisce che ciò che è stato precedentemente pensato come processi cellulari specifici per ipossia possono essere rilevanti in un ambiente fisiologico. È interessante notare che, eIF4F e eIF4F H </sup&gt; partecipare attivamente al inizio della traduzione di piscine distinte o classi di mRNA in diverse linee cellulari umane differenti esposti all&#39;ossigeno fisiologica o &quot;physioxia&quot; 24. Low ossigeno spinge anche il corretto sviluppo del feto 33 e le cellule hanno generalmente più alti tassi di proliferazione, durata della vita più lunga, meno danni al DNA e meno risposte allo stress generale in physioxia 34. Pertanto, eIF4F H è probabilmente un fattore chiave per l&#39;espressione dei geni selezionati in condizioni fisiologiche. Qui, forniamo un protocollo per le cellule di coltura in condizioni di ossigeno fisiologiche fissi o in un intervallo di fluttuazione dinamica che rischia più rappresentativa di microambienti tissutali. Un vantaggio di questo metodo è che le cellule sono lisate nella workstation ipossia. E spesso non è chiaro come la transizione dalla coltura cellulare ipossica a lisi cellulare avviene in altri protocolli. Le cellule vengono spesso rimossi prima da un piccolo incubatore ipossia esserefore lisi, ma questa esposizione all&#39;ossigeno potrebbe influenzare percorsi biochimici come risposta cellulare a ossigeno è rapida (uno o due min) 35. Alcune proteine di legame della cap richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m 7, quindi alcuni interattori capitalizzazione possono perdere nel processo di purificazione. Agarosio-linked per analoghi cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Esplorare l&#39;attività e la composizione di eIF4F H e altre varianti del eIF4F attraverso il metodo descritto qui farà luce sui complessi macchinari di espressione genica che le cellule utilizzano in condizioni fisiologiche o risposte allo stress.

<table><tbody><tr><td>&gamma;-amminofenil-m7GTP agarosio C10 perline legate Jena</td><td>Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarosio m7GTP</td></tr><tr><td>Piatto di coltura</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm</td>Piatto di coltura da 150</tr><tr><td>mm</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>piatto di coltura da 15 cm</td></tr><tr><td>AEBSF Cloridrato</td><td>ACROS Organici</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Perle di agarosio</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Controllo delle perle di agarosio</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 1,5 ml</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Utilizzato per centrifugare piccoli volumi</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 ml</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Utilizzato nella coltura di cellule primarie</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina definito</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Terreno cellulare epiteliale (kit completo)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Include integratori di siero e fattore di crescita)</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE</td></tr><tr><td>100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 carcinoma colorettale</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Linea cellulare tumorale umana</td></tr><tr><td>Cellule epiteliali tubulari prossimali renali umane</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Terreni standard per colture cellulari umane</td></tr><tr><td>Soluzione di iclone penicillina-streptomicina</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Componente antibiotico di DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Stazione di lavoro per ipossia</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Componente detergente del tampone di lisi</td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (componente inibitore della fosfatasi del tampone di lisi)</td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino di grado premium</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (100x)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>58715</td><td>Componente del tampone di lisi</td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodio Ortovanadato</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Componente dei tamponi</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Tripsina utilizzata per staccare le cellule aderenti</td></tr></tbody></table>

analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Il controllo traduzionale è un punto focale della regolazione genica, specialmente durante i periodi di stress cellulare. La traduzione cap-dipendente attraverso il complesso eIF4F è di gran lunga la via più comune per avviare la sintesi proteica nelle cellule eucariotiche, ma stanno emergendo variazioni specifiche per lo stress di questo complesso. La purificazione delle proteine leganti il cappuccio con una resina di affinità composta da m7GTP legato all'agarosio (un analogo del cappuccio dell'mRNA 5') è uno strumento utile per identificare i fattori coinvolti nella regolazione dell'inizio della traduzione. L'ipossia (basso contenuto di ossigeno) è uno stress cellulare riscontrato durante lo sviluppo fetale e la progressione del tumore ed è fortemente dipendente dalla regolazione della traduzione. Inoltre, è stato recentemente riportato che gli organi adulti umani hanno un contenuto di ossigeno inferiore (fisiossia 1-9% di ossigeno) che è più vicino all'ipossia rispetto all'aria ambiente in cui le cellule vengono abitualmente coltivate. Con la caratterizzazione in corso di un complesso ipossico eIF4F (eIF4FH), c'è un crescente interesse nella comprensione dell'inizio della traduzione ossigeno-dipendente attraverso il cappuccio dell'mRNA 5'. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di coltura cellulare umana per analizzare le proteine che legano il tappo che sono regolate dalla disponibilità di ossigeno. Questo protocollo sottolinea che la coltura cellulare e la lisi devono essere eseguite in una workstation per ipossia per eliminare l'esposizione all'ossigeno. Le celle devono essere incubate per almeno 24 ore affinché il mezzo liquido si equilibri con l'atmosfera all'interno della postazione di lavoro. Per evitare questa limitazione, è possibile aggiungere alle celle mezzi precondizionati (deossigenati) se sono necessari punti temporali più brevi. Alcune proteine che legano il cappuccio richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m7, quindi alcuni interattori del cappuccio possono essere persi nel processo di purificazione. L'agarosio legato ad analoghi di cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Questo metodo consente all'utente di identificare nuovi fattori di traduzione regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap-dipendente.

Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m 7 GTP Affinity Colonna Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m 7 GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epite...

Qui, presentiamo protocolli di coltura cellulare umana per analizzare i fattori di inizio della traduzione che legano il cappuccio 5' dell'mRNA durante le condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del tappo m7GTP legato all'agarosio ed è adatto per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti.

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del cappuccio a sette metil-guanosina collegato all'agarosio per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo della sintesi proteica, come l'identificazione di nuovi fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap dipendente.Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono conservate in una workstation per ipossia fino al punto di lisi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché le cellule tumorali all'interno di un tumore sono esposte a livelli molto bassi di ossigeno e il controllo traslazionale svolge un ruolo chiave nella progressione del tumore. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto una recente pubblicazione dei colleghi di Corona che riportava che l'ossigenazione dei tessuti è in realtà più vicina a quella che chiamiamo ipossia piuttosto che alla normalità in cui le cellule vengono abitualmente coltivate.Iniziare questa procedura con la coltura cellulare come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, alimentare piastre coltivate da 150 millimetri contenenti 15 millilitri di terreno completo per ottenere una densità cellulare da 2500 a 5000 cellule per centimetro quadrato. Utilizzare due piastre da 150 millimetri per ogni saggio di legatura del tappo.Posizionare i piatti di coltura con semi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e un'atmosfera di anidride carbonica del cinque percento. Dopo che le cellule sono state incubate per almeno 24 ore, posizionare le cellule in una postazione di lavoro per ipossia per il tempo desiderato. Quindi, impostare la workstation sulla fisiossia appropriata.Preriscaldare una soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e la tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aliquotare 980 microlitri di tampone di lisi in una provetta da centrifuga da 1,5 microlitri per ogni saggio di legame del tappo in corso. 10 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi 100X e 10 microlitri di idrocloruro di fluoruro 4-benzensulfonilico ai 980 microlitri di tampone di lisi su ghiaccio.Gettare i supporti da ogni piatto da 150 millimetri in un contenitore per rifiuti all'interno della workstation per ipossia. Quindi, lavare le celle con tre o quattro millilitri di un X PBS caldo e scartare il liquido. Aggiungere un millilitro di tripsina EDTA calda allo 05% a ciascun piatto e lasciare riposare i piatti per due minuti o fino a quando le cellule non aderiscono più al piatto.Utilizzando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ripetere l'operazione se necessario in modo che ogni piastra di cellule venga trasferita in una provetta per microcentrifuga separata da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 6000 volte g per 90 secondi per pellettare le cellule.Dopo la centrifugazione, aspirare la tripsina utilizzando una pipetta senza disturbare il pellet. Lavare le cellule con un X PBS caldo pipettando delicatamente 200 microlitri di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Quindi aspirare il PBS senza disturbare il pellet.Quindi, pipettare 500 microlitri dalla soluzione tampone di lisi preparata da un millilitro sul primo pellet cellulare. Risospendere completamente il pellet pipettandolo su e giù. Combinare le celle ri-sospese con il pellet della seconda cella e risospendere il secondo pellet pipettandolo su e giù.Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e ri-sospesi per ogni campione. Successivamente, combina il lisato con i restanti 500 microlitri di tampone di lisi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 litri. Rimuovere i campioni dalla postazione di lavoro per l'ipossia.Liare le cellule con una leggera agitazione ruotando i campioni a quattro gradi Celsisus per 1,5-2 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule lisate a 1200 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e gettare il pellet.Riservare una parte del surnatante da utilizzare come controllo dell'input del lisato a cellule intere per l'analisi del western blot. Per prepararsi al test di legatura del tappo, utilizzare le forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta dell'impasto delle perle. Per ogni trasferimento del campione, 50 microlitri di liquame bianco di controllo delle perle di agarosio e 50 microlitri di liquame di perle di agarosio C10 m7GTP per separare le provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi, pellettare le perle centrifugando l'impasto a 500 volte g per 30 secondi. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le perle in 500 microlitri di TBS. Dopo aver ripetuto questi passaggi, pellettare le perline a 500 volte g per 30 secondi e rimuovere il surnatante.Quindi, trasferire il surnatante contenente il lisato nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio vuote. Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con leggera agitazione. Dopo 10 minuti, pellettare le perle di agarosio vuote centrifugando a 500 volte g per 30 secondi.Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato che non si lega alle perle nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio C10 m7GTP. Lavare le perle di agarosio vuote risospendendole in 500 microlitri di tampone di lisi, pellettando le perle centrifugando a 500 g di tempo per 30 secondi e scartando il surnatante. Ripetere l'operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi.Risospendere le perle di agarosio vuote in un tampone per campioni X SDS-PAGE. E fai bollire le perline per 90 secondi a 95 gradi Celsius. Conservare il campione a 20 gradi Celsius per future analisi Western Blot per osservare il tempo in cui la proteina di interesse si lega in modo non specifico alla perlina.Incubare il lisato con le perle di agarosio M7GTP legate al C10 con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsuis per catturare le proteine che legano il cappuccio. Dopo l'agitazione, pellettare le perle legate all'agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le perle di agarosio C10 m7GTP come prima.Risospendere le perle in 600 microlitri di tampone di lisi e aggiungere GTP a una concentrazione finale di un millimolare. Incubare le perle di agarosio C10 m7GTP più un millimolare di GTP con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Questo dissocierà le proteine che interagiscono in modo non specifico con m7GTP.Pellettare le perle di agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 200 microlitri di quattro tamponi per campioni X SDS-PAGE. Dopo aver lavato le perle come prima, sospenderle nuovamente in un tampone per campioni X SDS-PAGE e far bollire a 95 gradi Celsius per 90 secondi.Qui sono mostrati western blot rappresentativi di una tipica purificazione di affinità m7GTP di due principali proteine leganti il cappuccio in risposta alle fluttuazioni di ossigeno nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale renale umano primario. I lisati cellulari sono stati esposti all'otto percento, al cinque percento, al tre percento o all'uno percento di ossigeno per 24 ore. Le corsie includono il 10% dell'intero lisato cellulare come input, un GTP lavato per misurare la specificità per m7GTP e le proteine legate alle perle di m7GTP dopo il lavaggio GTP.I dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati dall'immagine J ed espressi come unità di densità relativa rispetto al 10% di input dell'intero lisato cellulare. I risultati indicano che le cellule umane coltivate sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine leganti il cappuccio per reclutare mRNA distinti per la traduzione. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere le cellule nella workstation di ipossia fino al punto di lisi, poiché l'ossigeno può alterare rapidamente le proprietà biochimiche di questi fattori di inizio della traduzione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il frazionamento dei polisomi, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine che legano il tappo si associano alla traduzione attiva in condizioni di basso ossigeno.

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Saponina permeabilizzate preparazione fibra in collaborazione con respirometrico analisi fosforilazione ossidativa fornisce una valutazione integrativa della funzione mitocondriale. Respirazione mitocondriale in stati fisiologici e patologici possono riflettere varie influenze normative ivi comprese le interazioni mitocondriale, morfologia e biochimica.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

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Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Strumenti OroborosQuesto video spiega come il flusso di ossigeno viene utilizzato per valutare la respirazione mitocondriale nelle cellule di mammifero viventi e permeabilizzate. Dimostra l'uso sequenziale della digitonina, dei substrati metabolici, dell'ADP, di un disaccoppiatore e di un inibitore per caratterizzare diversi stati respiratori. Il profilo del flusso di ossigeno risultante rivela la funzione mitocondriale e...

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Sintesi, incapsulamento dell'emoglobina e PEGilazione biortogonale in nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 per applicazioni di somministrazione di ossigeno

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siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

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