Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del cappuccio a sette metil-guanosina collegato all'agarosio per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo della sintesi proteica, come l'identificazione di nuovi fattori regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap dipendente.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono conservate in una workstation per ipossia fino al punto di lisi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché le cellule tumorali all'interno di un tumore sono esposte a livelli molto bassi di ossigeno e il controllo traslazionale svolge un ruolo chiave nella progressione del tumore. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto una recente pubblicazione dei colleghi di Corona che riportava che l'ossigenazione dei tessuti è in realtà più vicina a quella che chiamiamo ipossia piuttosto che alla normalità in cui le cellule vengono abitualmente coltivate.

Iniziare questa procedura con la coltura cellulare come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, alimentare piastre coltivate da 150 millimetri contenenti 15 millilitri di terreno completo per ottenere una densità cellulare da 2500 a 5000 cellule per centimetro quadrato. Utilizzare due piastre da 150 millimetri per ogni saggio di legatura del tappo.

Posizionare i piatti di coltura con semi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e un'atmosfera di anidride carbonica del cinque percento. Dopo che le cellule sono state incubate per almeno 24 ore, posizionare le cellule in una postazione di lavoro per ipossia per il tempo desiderato. Quindi, impostare la workstation sulla fisiossia appropriata.

Preriscaldare una soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e la tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aliquotare 980 microlitri di tampone di lisi in una provetta da centrifuga da 1,5 microlitri per ogni saggio di legame del tappo in corso. 10 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi 100X e 10 microlitri di idrocloruro di fluoruro 4-benzensulfonilico ai 980 microlitri di tampone di lisi su ghiaccio.

Gettare i supporti da ogni piatto da 150 millimetri in un contenitore per rifiuti all'interno della workstation per ipossia. Quindi, lavare le celle con tre o quattro millilitri di un X PBS caldo e scartare il liquido. Aggiungere un millilitro di tripsina EDTA calda allo 05% a ciascun piatto e lasciare riposare i piatti per due minuti o fino a quando le cellule non aderiscono più al piatto.

Utilizzando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ripetere l'operazione se necessario in modo che ogni piastra di cellule venga trasferita in una provetta per microcentrifuga separata da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 6000 volte g per 90 secondi per pellettare le cellule.

Dopo la centrifugazione, aspirare la tripsina utilizzando una pipetta senza disturbare il pellet. Lavare le cellule con un X PBS caldo pipettando delicatamente 200 microlitri di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Quindi aspirare il PBS senza disturbare il pellet.

Quindi, pipettare 500 microlitri dalla soluzione tampone di lisi preparata da un millilitro sul primo pellet cellulare. Risospendere completamente il pellet pipettandolo su e giù. Combinare le celle ri-sospese con il pellet della seconda cella e risospendere il secondo pellet pipettandolo su e giù.

Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e ri-sospesi per ogni campione. Successivamente, combina il lisato con i restanti 500 microlitri di tampone di lisi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 litri. Rimuovere i campioni dalla postazione di lavoro per l'ipossia.

Liare le cellule con una leggera agitazione ruotando i campioni a quattro gradi Celsisus per 1,5-2 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule lisate a 1200 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e gettare il pellet.

Riservare una parte del surnatante da utilizzare come controllo dell'input del lisato a cellule intere per l'analisi del western blot. Per prepararsi al test di legatura del tappo, utilizzare le forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta dell'impasto delle perle. Per ogni trasferimento del campione, 50 microlitri di liquame bianco di controllo delle perle di agarosio e 50 microlitri di liquame di perle di agarosio C10 m7GTP per separare le provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, pellettare le perle centrifugando l'impasto a 500 volte g per 30 secondi. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le perle in 500 microlitri di TBS. Dopo aver ripetuto questi passaggi, pellettare le perline a 500 volte g per 30 secondi e rimuovere il surnatante.

Quindi, trasferire il surnatante contenente il lisato nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio vuote. Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con leggera agitazione. Dopo 10 minuti, pellettare le perle di agarosio vuote centrifugando a 500 volte g per 30 secondi.

Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato che non si lega alle perle nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente le perle di agarosio C10 m7GTP. Lavare le perle di agarosio vuote risospendendole in 500 microlitri di tampone di lisi, pellettando le perle centrifugando a 500 g di tempo per 30 secondi e scartando il surnatante. Ripetere l'operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi.

Risospendere le perle di agarosio vuote in un tampone per campioni X SDS-PAGE. E fai bollire le perline per 90 secondi a 95 gradi Celsius. Conservare il campione a 20 gradi Celsius per future analisi Western Blot per osservare il tempo in cui la proteina di interesse si lega in modo non specifico alla perlina.

Incubare il lisato con le perle di agarosio M7GTP legate al C10 con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsuis per catturare le proteine che legano il cappuccio. Dopo l'agitazione, pellettare le perle legate all'agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le perle di agarosio C10 m7GTP come prima.

Risospendere le perle in 600 microlitri di tampone di lisi e aggiungere GTP a una concentrazione finale di un millimolare. Incubare le perle di agarosio C10 m7GTP più un millimolare di GTP con una leggera agitazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Questo dissocierà le proteine che interagiscono in modo non specifico con m7GTP.

Pellettare le perle di agarosio C10 m7GTP centrifugando a 500 volte g per 30 secondi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 200 microlitri di quattro tamponi per campioni X SDS-PAGE. Dopo aver lavato le perle come prima, sospenderle nuovamente in un tampone per campioni X SDS-PAGE e far bollire a 95 gradi Celsius per 90 secondi.

Qui sono mostrati western blot rappresentativi di una tipica purificazione di affinità m7GTP di due principali proteine leganti il cappuccio in risposta alle fluttuazioni di ossigeno nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale renale umano primario. I lisati cellulari sono stati esposti all'otto percento, al cinque percento, al tre percento o all'uno percento di ossigeno per 24 ore. Le corsie includono il 10% dell'intero lisato cellulare come input, un GTP lavato per misurare la specificità per m7GTP e le proteine legate alle perle di m7GTP dopo il lavaggio GTP.

I dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati dall'immagine J ed espressi come unità di densità relativa rispetto al 10% di input dell'intero lisato cellulare. I risultati indicano che le cellule umane coltivate sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine leganti il cappuccio per reclutare mRNA distinti per la traduzione. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come catturare le proteine che legano il cappuccio in condizioni di basso ossigeno.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere le cellule nella workstation di ipossia fino al punto di lisi, poiché l'ossigeno può alterare rapidamente le proprietà biochimiche di questi fattori di inizio della traduzione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il frazionamento dei polisomi, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine che legano il tappo si associano alla traduzione attiva in condizioni di basso ossigeno.