Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare una camera avanzata delle pliche cutanee dorsali per esaminare in dettaglio lo sviluppo della vascolarizzazione associata al tumore in un modello murino. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come il miglioramento della terapia e la comprensione della progressione del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i processi vengono studiati nel giusto contesto, nella vita reale e che questi processi possono essere studiati nel tempo.

Questa procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Ann Seynhaeve, la ricercatrice senior del mio laboratorio. Da un topo donatore non transgenico, prelevare un frammento tumorale non necrotico di 10 mm di diametro per l'impianto nella camera della finestra dorsale del topo ricevente. Utilizzare un donatore di topo normale per un tumore singenico o un donatore di topo immunodeficiente per uno xenotrapianto.

Il topo ricevente deve avere almeno 12 settimane di età e pesare venti o più grammi. Eseguire tutte le procedure chirurgiche in condizioni asettiche. Ad esempio, sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici e i materiali della camera.

Dopo aver sedato il topo ricevente, rimuovere i peli da tutto il lato dorsale utilizzando un rifinitore elettrico, quindi utilizzare il gel depilatorio. Risciacquare la pelle e asciugarla. Infine, strofinare la pelle depilata con etanolo.

Ora, segna una linea centrale orizzontale lungo il dorso. Quindi, posizionare la finestra di visualizzazione almeno 2 mm sotto la linea e segnare il perimetro della finestra sulla pelle. Successivamente, utilizzando bisturi e forbici, rimuovere con cura la pelle all'interno della linea perimetrale senza danneggiare la fascia sottostante.

Quindi, solleva la plica cutanea e usa un perforatore per le orecchie per introdurre fori da 1 mm su entrambi i lati dell'area della finestra per i bulloni che tengono la finestra in posizione. Posizionare il telaio posteriore sul mouse e fissare il telaio posizionando i dadi sui bulloni. Quindi, tira la pelle di due o tre millimetri sopra il telaio per assicurarti che si adatti.

In tal caso, infilare aghi da 23 gauge attraverso i due fori di sutura nella parte superiore del telaio. Fissare il telaio serrando i dadi e tenerli con clampportaaghi, non serrare eccessivamente i dadi e impedire alla pelle di girare attorno ai bulloni. Quindi, sostituisci gli aghi con punti di sutura per fissare il telaio alla pelle.

Ora gira il mouse di lato. Da questa angolazione introdurre un pezzo spesso di vetro di riempimento e un vetro di copertura standard da 12 millimetri. Fissare entrambi con un anello di sicurezza in modo che la fascia aderisca al vetro.

Il passo successivo è quello di idratare la finestra utilizzando cloruro di sodio allo 0,9%. Lascia cadere alcune gocce sull'area di visualizzazione e assorbi l'eccesso. Ora, appena sotto la finestra, usa un ago calibro 25 con una curva di 90 gradi per creare una tasca profonda nella fascia che può contenere un millimetro cubo di tessuto tumorale.

Quindi inserire il tessuto tumorale nella tasca. Infine, chiudere l'area di visualizzazione della finestra utilizzando un vetro di copertura standard da 12 millimetri e un anello di sicurezza. Eventuali bolle d'aria si dissiperanno entro un'ora.

Prima di sedare il topo, riscaldare una piattaforma a temperatura controllata su misura a 37 gradi Celsius. Dopo aver sedato il mouse, posizionarlo sulla piattaforma riscaldata. Collegare una cono per erogare l'isoflurano e, se la valutazione richiederà più di cinque minuti, applicare un appuntamento oftalmico.

Ora, imbullonare la camera utilizzando i bulloni della finestra al supporto su misura e fissare il supporto alla piattaforma. Quindi, pulire la finestra di vetro con acqua e cotone. Ora, al microscopio, controlla lo sviluppo dei vasi nel tumore utilizzando l'obiettivo 10 volte, in campo chiaro e luce fluorescente.

Dopo l'esame macroscopico, accendere i laser confocali. Impostare il pannello di controllo del microscopio su un guadagno intelligente di 100 volt per giro. Un offset intelligente del 10% per giro, zoom medio, posizionamento medio X e Y e 100 micron di posizione Z per giro.

Impostare la modalità di acquisizione su XYZ o XYZT. Seleziona una risoluzione. Scegli una velocità di acquisizione di due o 400 Hertz.

Impostare il foro stenopeico su un'unità ariosa. E seleziona l'opzione X bidirezionale. Quando si valutano più fluorofori con un possibile intervallo spettrale sovrapposto, selezionare la scansione sequenziale tra i fotogrammi per evitare il bleedthrough e impostare i percorsi del fascio corretti.

Imposta la media delle linee su quattro e, infine, seleziona un nuovo set di dati per l'esperimento. Ora, concentrati sul tessuto di interesse nel farlo, è meglio utilizzare lenti asciutte con aperture numeriche più elevate. Successivamente, utilizza la scansione rapida in tempo reale per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore possibile regolando il guadagno e l'offset in modo che non vi sia sovraesposizione.

Ora, seleziona la pila Z nella scheda di acquisizione. Effettua una scansione Z veloce. Dalla scansione veloce, decidere le posizioni di inizio e fine della scansione completa.

Quindi, impostare la dimensione del passo Z in base alla dimensione del foro stenopeico e procedere con la scansione completa. I topi ospiti che esprimevano etichette fluorescenti sono stati sottoposti a imaging dopo l'impianto del tumore utilizzando il protocollo descritto. L'etichetta eNOStag-GFP si esprime nel Golgi e nella membrana cellulare delle cellule endoteliali.

L'etichetta ROSAmT/mG esprime la fioritura rossa in modo ubiquitario e la fioritura verde nelle cellule che esprimono la Cre ricombinasi. Un'applicazione di questa tecnologia è lo studio dello sviluppo dei vasi sanguigni, poiché tutti gli stadi si osservano nei tumori. Ad esempio, i fronti endoteliali possono essere visti germogliare in aree non vascolarizzate.

I tumori hanno anche vasi danneggiati e letti vascolari stabiliti con vasi ramificati maturi. Un'altra applicazione è quella di studiare la formazione del lume, il flusso sanguigno e lo stravaso applicando etichette al sangue, come le nanoparticelle che emettono fluorescenza. Pertanto, il flusso sanguigno può essere osservato nel lume dei tubi vascolari e vicino alle cellule della punta endoteliale.

Nelle celle della punta è osservabile la formazione di un lume del ceppo. La microscopia intravitale può essere utilizzata anche per studiare l'effetto degli agenti chemioterapici. Ad esempio, 24 ore dopo l'iniezione di nanoparticelle in un animale eNOStag-GFP, le nanoparticelle sono rimaste nel sistema vascolare con uno stravaso minimo nell'interstizio tumorale.

Tuttavia, quando le nanoparticelle sono state somministrate in combinazione con il TNF, è stato osservato uno stravaso nell'interstizio tumorale. Questa è la prova di un aumento della somministrazione di farmaci intertumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come installare una camera finestra per pliche cutanee dorsali e come studiare i processi correlati al tumore utilizzando la microscopia confocale.