Caricamento di un colorante di calcio in terminazioni di nervi della rana attraverso il ceppo del nervo: registrazione transitoria del calcio nella giunzione neuromuscolare della rana
8 luglio 2017
Qui descriviamo un metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il ceppo nervoso della rana nelle estremità nervose. Presentiamo inoltre un protocollo per la registrazione e l'analisi dei rapidi transitori di calcio nei terminali nervosi periferici.
Ciao, mi chiamo Dimitry Samigullin, lavoro nel laboratorio di Biofisica dei Processi Sinaptici dell'Istituto di Biochimica e Biofisica di Kazan, l'Accademia Russa delle Scienze. Nel nostro laboratorio studiamo vaste vie di segnalazione del calcio nella giunzione neuromuscolare. Uno dei metodi più accessibili per misurare il livello sinaptico di calcio è una registrazione ottica.
Qui descriviamo il metodo di caricamento di un colorante sensibile al calcio, attraverso un moncone nervoso, nelle terminazioni nervose della rana. Inoltre, presentiamo il protocollo per misurare e analizzare un vasto transitorio di calcio nei terminali delle rane. Utilizzando questo metodo è possibile studiare l'influenza di farmaci attivi sul livello presinaptico del calcio durante l'attività sinaptica.
Preparazione della soluzione di caricamento del colorante. Il colorante di calcio Oregon Green BAPTA della fluoresceina, è disponibile in 500 microlitri tramite una piccola quantità di 500 microgrammi di polvere. Aggiungere 14 microlitri di soluzione, contenente HEPES, alla polvere.
Vortice la soluzione di caricamento e girare verso il basso per mescolare accuratamente. Avvolgere il flaconcino con la soluzione di carico con un foglio, per evitare l'esposizione alla luce. Conservare la soluzione di carico a meno 20 gradi Celsius, in congelatore.
Procedura di caricamento del colorante. Sezionare un muscolo pettorale cutaneo dall'animale. Monta il tessuto sezionato in una capsula di Petri rivestita d'argento.
Tendere il fazzoletto con sottili spilli in acciaio inossidabile. Aggiungere la soluzione di Ringer alla capsula di Petri. Usando una lama di rasoio, tagliare un pezzettino, circa 2 millimetri del tubo della pipetta da dieci microlitri dall'estremità sottile.
Preparare un pezzo di plastilina per tenere la pipetta di riempimento sulla capsula di Petri. Collegare la pipetta di riempimento con una siringa di plastica attraverso un tubo di silicone e adattatori costituiti da tubi per pipette. Rimuovere la soluzione temporanea di Ringer dalla capsula di Petri con una pipetta di plastica.
Preparazione a secco con una siringa. Ciò impedirà l'aspirazione della soluzione nella pipetta di riempimento. Estrarre il flaconcino con la soluzione di carico dal congelatore e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente in un luogo buio.
Con una pinzetta fine e delle forbici, sotto controllo visivo, con microscopio sterile, tagliare il nervo vicino al muscolo. Lasciare circa due millimetri di moncone nervoso. Fissare la pipetta di riempimento con un tubo e la siringa, sulla piastra di Petri utilizzando la plastilina.
Spostalo vicino al ramo nervoso. Aspirare delicatamente il moncone nervoso nella pipetta di riempimento. Rimuovere il tubo di aspirazione dall'estremità smussata della pipetta di riempimento.
Asciugare il moncone nervoso nella pipetta di riempimento con la siringa. Spostare verso l'alto la pipetta di riempimento con il moncone nervoso. Isolare il moncone nervoso dall'esterno con vaselina.
Ancora una volta, asciugare il moncone nervoso nella pipetta di riempimento con la siringa. Aspirare i cinque microlitri di soluzione di carico del punto zero utilizzando una pipetta con punta lunga. Inserire delicatamente il puntale della pipetta con la soluzione di carico nella pipetta di riempimento.
Espellere la miscela direttamente sul moncone nervoso. Sigillare l'estremità aperta della pipetta di riempimento con vaselina. Aggiungere una piccola quantità di soluzione nella capsula di Petri.
Incubare il preparato a temperatura ambiente in un luogo buio e umido per cinque ore. Dopo la procedura di incubazione, prendere il preparato e rimuovere la pipetta di riempimento con la soluzione di caricamento. Mettere il preparato in una vasca da bagno e lavarlo con la soluzione di Ringer.
Conservare il bagno con la preparazione per una notte in frigorifero a otto gradi Celsius di temperatura. Preparare il tessuto per la microscopia. Prendi il preparato dal bagno.
Montare il preparato in una camera rivestita d'argento e allungare leggermente il tessuto. Sciacquare il fazzoletto con la soluzione fresca di Ringer. Prendi l'elettrodo di stimolazione dell'aspirazione.
Posizionare l'elettrodo di aspirazione di stimolazione nella camera con la punta vicino all'estremità tagliata del nervo. Attira il nervo verso l'elettrodo. La costruzione dell'elettrodo è descritta nell'articolo di Khazokoff, un link all'articolo è nei materiali.
Fissare la camera di preparazione sul tavolino del microscopio. Posizionare la sonda di temperatura. Collegare i tubi di afflusso a un cavo di alimentazione per l'elemento Peltier nella camera di preparazione.
Posizionare il tubo di deflusso nella camera di preparazione. Accendi una pompa di perfusione. Attivare il termine unità di controllo.
Impostare la temperatura sull'unità di controllo in modo che raggiunga i 20 gradi Celsius. Installare uno schermo di protezione dai raggi ultravioletti. Impostare la durata del ritardo e il periodo sullo stimolatore.
Collegare un filo dall'elettrodo di aspirazione con lo stimolatore. Accendilo. Con un obiettivo a basso ingrandimento, controllare la contrazione muscolare attivando lo stimolo.
Riempire il sistema di perfusione con una soluzione di Ringer a basso contenuto di calcio e ad alto contenuto di magnesio. Impostare la velocità di perfusione di circa due millilitri al minuto. Sostituire l'obiettivo con un ingrandimento di 40 volte.
Attivare la lunghezza d'onda di emissione Polychrome V.Select e l'illuminazione in modalità continua. Aprire l'otturatore. Con un obiettivo con ingrandimento inferiore a 40 volte, in modalità a fluorescenza le illuminazioni assicurano che i terminali siano caricati.
Trova il terminale e concentrati su di esso. Il nervo caricato e le terminazioni nervose motorie ben caricate, sono rappresentate in figura. Acquisizione video con telecamera CCD Neuro Red-Short.
Esegui il software Turbo-SM. Seleziona, Modifica impostazioni. Il numero di fotogrammi in ingresso è 500.
Inserisci il nome dell'esperimento. La configurazione di base è di 1000 fotogrammi al secondo. 80 per 80.
Scegli il trigger esterno. Immettere il tempo di pre-attivazione. Meno dieci millisecondi.
Inserire il numero di ripetizioni, 20. Nel software Polychrome, selezionare la modalità di illuminazione del trigger esterno. Esegui il software Clampex.
Protocollo di stimolazione del carico. Il protocollo è disponibile per il download dalla nostra pagina di laboratorio sul sito web dell'Università Federale di Kazan. Prima di registrare, cattura un dark frame nel software Turbo-SM.
Sul cubo trinoculare selezionare i livelli di scambio del percorso della luce. 100 percento per la fotocamera. Esegui il protocollo di stimolazione.
Seleziona la regione di interesse e controlla il segnale. In risposta alla stimolazione nervosa registriamo una variazione dell'intensità della fluorescenza che riflette l'ingresso del calcio nella terminazione nervosa. Analisi dei dati.
Nel software Turbo-SM, selezionare il file. Quindi, seleziona, media dei file. Seleziona i file.
Immettere il nome del file medio e fare la media. Salva il file medio come file adatto. Selezionare, salvare come file adatto.
Inserisci il nome del file e salvalo. Eseguire l'immagine J e aprire gli strumenti sottostanti. Analisi, strumenti, ROI Manager.
Trova il file medio salvato in formato adatto. Trascinalo e rilascialo su Immagine J.Ingrandisci la finestra per una visualizzazione migliore. Seleziona una regione rettangolare di interesse su quello che ritieni essere lo sfondo.
Aggiungilo a ROI Manager. In Gestione ROI, seleziona Altro. Multi-misura. Carica verso il basso.
Copia i dati, esporta in Excel. In Excel, utilizzare la funzione media per calcolare il valore medio dello sfondo per un rapporto. Senza chiudere Excel, torna all'immagine J.Chiudi la finestra con il calcolo in background senza salvare.
Usa ROI Manager, elimina il disegno di sfondo rettangolare. Processo strumentale aperto, matematica, sottrarre. Immettere il valore medio calcolato della soglia da Excel e sottrarre il terreno dalle pile.
Selezionare una regione rettangolare di interesse attorno a un terminale nervoso. Aggiungilo a ROI Manager. In ROI Manager, seleziona, altro, Multi-misura, carico verso il basso, media.
Copia e incolla nella finestra di Excel. Usa il grafico del grafico dello strumento Excel. Selezionare un'area piana prima di avviare il segnale.
Carica il grafico con i dettagli dai primi valori di fluorescenza a riposo, fino all'inizio del segnale. Quindi determinare il numero di punti per mediare i valori di fluorescenza a riposo. Fai la media di questi valori, quindi trova il numero medio della fluorescenza a riposo.
Dividi i segnali per fluorescenza al resto. Sottrai uno e moltiplica per il 100 percento. Tracciare il segnale e calcolare l'ampiezza del transitorio di calcio.
I parametri temporali dei segnali di fluorescenza dipendono dalla velocità delle reazioni dirette e/o inverse della formazione del complesso calcio-colorante. Il tempo di salita del segnale del calcio rappresenta la dinamica dell'input di calcio. È la diffusione nel terminale e l'interazione del calcio con il colorante.
Il decadimento del transitorio del calcio dipende dall'affinità del colorante e dalla velocità di tamponamento del calcio e dalla sua sospensione. L'analisi dell'ampiezza transitoria del calcio può essere utilizzata per studiare l'influenza di diversi principi attivi sull'ingresso di calcio che partecipano al rilascio di neurotrasmettitori. Questa tecnica di caricamento è adatta per l'imaging delle variazioni del calcio citosomiale.
Con indicatori fluorescenti e sia la stimolazione nervosa singola, sia l'attività sinaptica ritmica. L'analisi dell'ampiezza transitoria del calcio può essere utilizzata per studiare l'influenza di diverse sostanze sull'ingresso di calcio che partecipa al rilascio di neurotrasmettitori. Ci sono alcuni punti importanti a cui vogliamo prestare attenzione.
La procedura di incubazione comprende due fasi. Incubazione a temperatura ambiente e in frigorifero. È importante controllare il tempo di incubazione con il colorante a temperatura ambiente.
A seconda della lunghezza del moncone nervoso, del colorante e della temperatura nella stanza, il tempo di incubazione può variare. Se si sovraespongono i terminali pre-operatori e le parti prossimali, vicino al moncone nervoso, possono essere sovraccaricate. A causa della lunga incubazione in frigorifero, il colorante è distribuito uniformemente lungo le terminazioni nervose.
È essenziale posizionare il nervo nella soluzione di caricamento del colorante, entro alcuni minuti dal taglio, per consentire al colorante di entrare nel nervo, poiché intervalli di tempo più lunghi hanno prodotto un carico inefficace, presumibilmente a causa della ricezione del nervo chiuso. Per ridurre la compartimentazione del colorante è possibile utilizzare la forma estesa del colorante. È molto importante prevenire la lunga illuminazione fluorescente del tessuto perché ne influisce sulla sopravvivenza.
Utilizziamo l'ottica Nomarski nel canale della luce visibile per la ricerca dei terminali. Durante la registrazione, limitiamo la vista illuminata, tramite il diaframma. La lunga durata del processo di caricamento può essere ridotta utilizzando il timbro dell'otturatore del nervo.
In questo caso, è possibile utilizzare un micro-bypass in vetro.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo per caricare un colorante sensibile al calcio nelle terminazioni nervose di rana attraverso un moncone nervoso. Inoltre, viene descritto un protocollo per registrare e analizzare i transitori rapidi di calcio in queste terminazioni nervose periferiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Segnalazione del calcio
Sfondo
- Il segnale del calcio svolge un ruolo cruciale nella trasmissione sinaptica.
- I metodi di registrazione ottica sono efficaci per misurare i livelli di calcio a livello sinaptico.
- Comprendere la dinamica del calcio può aiutare a chiarire gli effetti dei farmaci sull'attività sinaptica.
- Le giunzioni neuromuscolari del rospo costituiscono un modello per lo studio di questi processi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per caricare coloranti sensibili al calcio nelle terminazioni nervose.
- Stabilire un protocollo per misurare i transitori di calcio in risposta alla stimolazione nervosa.
- Facilitare lo studio degli effetti dei farmaci sui livelli presinaptici di calcio durante l'attività sinaptica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una soluzione di carico con colorante al calcio utilizzando Oregon Green BAPTA.
- Dissezione e montaggio del tessuto muscolare di rana per l'applicazione del colorante.
- Utilizzo di una pipetta di riempimento per caricare il colorante nel moncone nervoso.
- Registrazione delle variazioni di fluorescenza in risposta alla stimolazione nervosa.
Risultati principali
- Caricamento riuscito del colorante sensibile al calcio nelle terminazioni nervose della rana.
- Osservazione di transitori rapidi del calcio durante l'attività sinaptica.
- Stabilimento di un protocollo per l'analisi della dinamica del calcio nelle terminazioni nervose.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo nello studio degli effetti dei farmaci sulla segnalazione del calcio.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato permette un efficace caricamento e misurazione dei segnali di calcio nelle terminazioni nervose della rana.
- Questo approccio può migliorare la comprensione dei meccanismi sinaptici e delle interazioni farmacologiche.
- Studi futuri potranno basarsi su questo protocollo per esplorare diversi aspetti della segnalazione del calcio nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione quantitativa dei transitori di calcio presinaptici è fondamentale per ridurre i rischi associati ai primi bersagli in neurobiologia e per validare i meccanismi alla base della trasmissione sinaptica. Questo protocollo consente una registrazione ottica precisa della dinamica del calcio nelle giunzioni neuromuscolari del rospo, fornendo un supporto predittivo nell'individuazione dell'interazione con il bersaglio e nella modulazione farmacologica. L'approccio rafforza la continuità traslazionale dalla biologia della scoperta alla valutazione preclinica della funzione sinaptica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta dell'ingresso di calcio presinaptico durante la trasmissione neurochimica.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico quantificando la modulazione indotta da farmaci sull'ingresso di calcio.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio in sistemi sinaptici rilevanti per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per il caricamento di coloranti sensibili al calcio nei terminali nervosi.
- Fornisce letture quantitative della fluorescenza adatte alla valutazione comparativa di composti.
- Stabilisce condizioni sperimentali per il rilevamento con elevata risoluzione temporale dei transitori di calcio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori misurando le risposte sinaptiche funzionali.
- Permette una continuità dalla scoperta in vitro ai modelli preclinici della funzione neuromuscolare.
- Supporta decisioni di avanzamento basate su rischi e su endpoint sinaptici quantitativi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test basati su ipotesi riguardo alla dinamica del calcio sinaptico e a interventi di tipo farmacologico.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla sugli effetti dei farmaci sull'ingresso del calcio presinaptico.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative standardizzate della fluorescenza per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Fornisce dati ad alta risoluzione temporale per il confronto statistico delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a modelli preclinici neuromuscolari.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo riutilizzabile per diverse applicazioni di ricerca sinaptica e neuromuscolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dei bersagli sinaptici e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Standardizza il caricamento del colorante e l’imaging per flussi di lavoro riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti quantificando le risposte sinaptiche funzionali ai composti candidati.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei bersagli neuromuscolari e sinaptici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in neurofisiologia, imaging a fluorescenza e analisi quantitativa dei dati.
- Richiede l'accesso a telecamere CCD ad alta velocità, microscopi a fluorescenza e software di analisi.
- Necessita di un rigoroso controllo temporale e termico durante il caricamento del colorante e l'incubazione.
- È fondamentale standardizzare la selezione delle regioni di interesse e la sottrazione del fondo per garantire la comparabilità dei dati.
- Una manipolazione accurata del tessuto e la riduzione al minimo della fototossicità sono essenziali per l'integrità dei dati.
