Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free

L'obiettivo generale di questi esperimenti è generare ed iniettare in modo efficiente aggregati sferici terapeutici, o sferoidi, di cellule staminali/mesenchimali, o MSC, potenziate in condizioni prive di componenti xenogene, in applicazioni sperimentali e cliniche. Questi metodi possono contribuire a superare gli ostacoli principali nel campo della terapia con MSC, come la scarsa ritenzione cellulare, la sopravvivenza e la funzionalità, che spesso si osservano dopo il trapianto di cellule disperse e in seguito a condizioni avverse comunemente associate al danno tissutale.

Il principale vantaggio di queste procedure è che gli sferoidi di MSC possono essere preparati, attivati e iniettati in assenza di prodotti animali immunogeni, come il FBS, che attualmente limitano alcune applicazioni cliniche delle cellule e possono anche rendere ambigua l'interpretazione di alcuni dati preclinici. Sebbene questo meccanismo possa essere molto utile nel mediare l'efficacia basata sulle MSC, può essere impiegato anche per comprendere la riparazione tissutale mediata dalle MSC e in che modo altre formulazioni di mezzo possono modificare il profilo terapeutico del genex plus. La dimostrazione di queste procedure sarà effettuata da Josh Beaver e Bret Clough, due tecnici del mio laboratorio.

Dopo la semina e l'incubazione delle cellule staminali mesenchimali, secondo il protocollo descritto, utilizzare tripsina ed EDTA per raccogliere le cellule, quindi centrifugare le cellule raccolte a 450 × g e raccogliere tutte le cellule in un singolo tubo conico con il mezzo appropriato. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in un piccolo volume di mezzo. Dopo il conteggio delle cellule, per generare sferoidi di circa 25.000 cellule, diluire le MSC raccolte in uno dei seguenti mezzi a una concentrazione di 714 cellule per microlitro.

Successivamente, pipettare gocce di 35 microlitri di cellule sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di coltura da 150 millimetri capovolta. Trasferire 20 millilitri di PBS a temperatura ambiente nella base della piastra e, con un unico movimento continuo e costante, capovolgere il coperchio contenente le gocce in modo che le aperture delle gocce siano rivolte verso il basso. Quindi posizionare con attenzione il coperchio sulla base della piastra di coltura.

Trasferire la piastra nell'incubatore per tre giorni senza disturbarla, per consentire un adeguato assemblaggio delle sfere. Al termine dell'incubazione, iniziare il raccolto degli sferoidi rimuovendo con attenzione il coperchio e capovolgendolo in modo che le gocce siano nuovamente rivolte verso l'alto. Successivamente, inclinare il coperchio di circa 10-20 gradi e utilizzare un distaccatore cellulare per spingere le gocce contenenti gli sferoidi verso il bordo della piastra.

Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire il mezzo finale delle sfere in un tubo conico da 15 millilitri e utilizzare PBS a temperatura ambiente e la stessa punta della pipetta per lavare la piastra, assicurando il recupero massimo degli sferoidi. Per i saggi di PCR in tempo reale, centrifugare la sospensione di sfere a 450 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aspirare il soprannatante.

Lavare gli sferoidi con PBS e ripetere entrambi i passaggi di centrifugazione e aspirazione. Per la somministrazione negli animali, lasciare sedimentare le sfere sul fondo del tubo senza centrifugazione. Per raccogliere il mezzo condizionato, o CM, per saggi di potenziale immunomodulante e antitumorale, utilizzando un distaccacellule e una pipetta come appena dimostrato, raccogliere gli sferoidi e il mezzo CM in un tubo conico da 15 millilitri.

Tuttavia, non lavare i coperchi con PBS. Dopo la centrifugazione a 450 volte G per 5-10 minuti, trasferire il soprannatante in provette da 1,5 millilitri. Centrifugare il soprannatante a 10.000 volte G e a temperatura ambiente per 5-10 minuti.

Quindi utilizzare una pipetta per raccogliere con attenzione il CM chiarificato in nuove provette da 1,5 millilitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver preparato gli sferoidi come appena dimostrato in questo video e aver atteso tre o quattro minuti affinché si depositino sul fondo della provetta, aspirare il sopranatante e lavare gli sferoidi aggiungendo HBSS integrato con 0,2-0,5% HSA per mantenere condizioni xeno-free. Successivamente, aspirare il sopranatante.

Coprire gli sferoidi con 100-200 microlitri di HBSS/HSA sterile e posizionare le provette sul ghiaccio. Dopo aver anestetizzato un topo secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare l'animale all'interno della cappa BSL-2 con la superficie dorsale rivolta verso il basso e utilizzare etanolo al 70% per disinfettare l'addome inferiore del topo. Rimuovere il cappuccio di un catetere endovenoso da 20 gauge e, tenendo la pelle del topo con una mano, individuare il punto mediano di una linea artificiale che collega l'articolazione del ginocchio flessa e la zona genitale; con la punta dell'ago dell'insieme catetere-stiletto orientata verso la linea mediana, utilizzare l'altra mano per eseguire un'iniezione intraperitoneale.

Rimuovere delicatamente l'ago metallico dall'insieme del filo guida del catetere. Controllare la presenza di sangue, urina e feci sull'ago e smaltirlo. Verificare il corretto posizionamento del catetere di plastica inserendo una punta di pipetta da 100 a 200 microlitri contenente 100 microlitri di HBSS/HSA sterile nell'adattatore del catetere per siringa, formando una chiusura ermetica.

Quindi iniettare lentamente il fluido all'interno della cavità peritoneale. Con una punta di pipetta da 100 a 200 microlitri, raccogliere gli sferoidi di MSA e l'HBSS/HSA e trasferire l'intero volume nella cavità peritoneale attraverso il catetere, come appena dimostrato. Successivamente, lavare il tubo contenente le sferoidi con 100 microlitri di HBSS/HSA e trasferire l'intero volume di sferoidi nella cavità peritoneale.

Posizionare un pad di garza imbevuto di antisettico sopra il catetere e rimuovere lentamente il catetere dalla cavità peritoneale, quindi smaltirlo. Ispezionare il catetere per verificare la presenza di sferoidi residui. Successivamente, massaggiare delicatamente la cavità peritoneale con le dita per assicurare una distribuzione uniforme dei sferoidi.

Immediatamente dopo aver inoculato gli sferoidi nei topi, valutare il livello di attivazione degli sferoidi preparati per le iniezioni trasferendo da 40 a 120 sferoidi nel catetere in una piastra da 12 o 6 pozzetti contenente da uno a due millilitri di Alpha MEM integrato con 2% FBS e penicillina-streptomicina 1X. Sei ore dopo, trasferire il mezzo dai pozzetti in provette da 1,5 o 15 millilitri e centrifugare le provette a 450 × g a temperatura ambiente per cinque minuti. Infine, trasferire il CM chiarificato in nuove provette da 1,5 millilitro e utilizzare un kit ELISA commerciale seguendo il protocollo del produttore per dosare la concentrazione di PGE-2.

Come mostrato qui, quando circa 25.000 MSC vengono sospese in gocce di 35 microlitri di CCM, le cellule si assemblano inizialmente in piccoli aggregati, ma alla fine si fondono per generare una singola sfera compatta all'apice della goccia dopo 72 ore. Questa figura dimostra che la formazione di singole sfere compatte e di XFM-1 richiede un'integrazione con 13 milligrammi per millilitro di HSA, una concentrazione che riflette il contenuto proteico totale stimato nel CCM. Durante l'assemblaggio della sfera, il fenotipo delle MSC cambia radicalmente e, quando coltivate in un mezzo chimicamente definito e privo di componenti xenogene, l'espressione di numerosi fattori antinfiammatori, tra cui PGE2 e TSG6, è aumentata.

Tuttavia, la produzione di TSG6 e PGE2 non è notevolmente aumentata nelle MSC coltivate come sfere in XFM-2 o XFM-1 senza HSA. Infine, in modo simile agli effetti in vitro, le sfere di XFM-1 con HSA iniettate nella cavità peritoneale di topi subito dopo l'induzione di infiammazione sistemica mediante somministrazione endovenosa di LPS hanno aumentato i livelli di PGE2 e IL-10 nel peritoneo, riducendo al contempo il fattore di necrosi tumorale alfa proinfiammatorio. Una volta acquisita padronanza, ogni piastra di gocce sospese può essere preparata in uno o due minuti.

E la somministrazione intraperitoneale di sferoidi integri può essere completata in 5-10 minuti per animale se eseguita correttamente. Quando si producono sferoidi di MSC mediante la tecnica della goccia sospesa, è importante ricordare che diverse formulazioni di mezzi privi di componenti xenogene non sono ugualmente efficaci per quanto riguarda la formazione delle sfere e il potenziamento dell'espressione dei geni terapeutici. Dopo questo procedimento, altre metodiche come la microscopia confocale possono essere utilizzate per comprendere l'organizzazione delle MSC all'interno dei sferoidi e anche quali ulteriori vie di segnalazione potrebbero essere attivate nelle MSC in diverse regioni del sferoide.

Dopo questo sviluppo, questo metodo ha permesso agli scienziati che studiano le cellule staminali mesenchimali di analizzare altre condizioni di coltura tridimensionale e il loro effetto sul priming delle cellule staminali mesenchimali e sull'espressione genica terapeutica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare il priming delle cellule staminali mesenchimali sotto forma di sferoidi utilizzando la tecnica della goccia sospesa, di come valutarne l'efficacia terapeutica in vitro e di come somministrare efficacemente sferoidi integri nei topi per test di efficacia in vivo. E non dimenticare che lavorare con cellule staminali umane adulte richiede attrezzature specifiche e un'adeguata formazione ed è potenzialmente pericoloso se le cellule non vengono manipolate correttamente.

È necessario indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati quando si manipolano cellule staminali umane adulte.