Name: Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Scopri come generare e somministrare sferoidi di cellule stromali mesenchimali (MSC) in condizioni xeno-free per migliorare la ritenzione cellulare e la funzionalità terapeutica in applicazioni rigenerative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni P40RR17447 dal National Institute of Health e da RP150637 premio dal Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Ringraziamo il Dr. Darwin J. Prockop per il suo sostegno al progetto.

<ol><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+New+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).</li>
<li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li>
<li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Paracrine+Immunomodulatory+Potential+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+in+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 9176357(2016).</li>
<li>Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Potapova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+support+migration%2C+extracellular+matrix+invasion%2C+proliferation%2C+and+survival+of+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C.Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+Improve+Myocardial+Infarction+in+Mice+because+Cells+Embolized+in+Lung+Are+Activated+to+Secrete+the+Anti-inflammatory+Protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+%28PGE2%2C+TSG6%2C+and+STC1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
<li>Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html"> http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> (2016).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mesenchymal+Stromal+Cells%27+Paracrine+Immunomodulatory+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.Med.Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects.</a> Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li>
<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+%27licensing%27%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li>
<li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+round%3A+multipotent+stromal+cells%2C+a+three-dimensional+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La MSC ottimale per l&#39;uso in alcune applicazioni di ricerca e clinica deve essere altamente attivato per massimizzare il loro vantaggio, e preferibilmente prodotta in condizioni XF chimicamente definite per ridurre al minimo la consegna dei potenziali antigeni dai componenti di media xenogene quali FBS. Nei protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato metodi a 1) attivare MSC nella cultura 3D dalla formazione di sferoidi, 2) ottenere l&#39;attivazione 3D di cellule staminali mesenchimali in condizioni XF, 3) valutar...

Staminali mesenchimali / cellule stromali (MSC) hanno mostrato un grande potenziale di vari approcci medicina rigenerativa. MSC sono stati inizialmente isolato come componente stromale del midollo osseo, ma da allora sono stati ottenuti da numerosi altri tessuti adulti, tra tessuto adiposo 1, 2, 3. È interessante notare che il metodo di isolamento principale abbraccia la notevole proprietà di MSC di aderire saldamente plastica coltura tissutale in presenza di siero fetale bovino (FBS). Sebbene questa tecnica tradizionale isolamento consente una facile e rapida espansione delle MSC in due dimensioni (2D) cultura, è anche molto artificiale e ignora significato del ambiente nativo tridimensionale (3D) che porta alla perdita potenziale di importanti caratteristiche cellulari 4, 5 , 6. Pertanto, lo studio delle MSC in colture 3D, chesono più fisiologico di culture 2D tradizionali, è emerso nella ricerca di &quot;diminuiti perduti /&quot; caratteristiche MSC. Inoltre, grande interesse è salito a identificare le condizioni (XF) senza xeno chimica definita per la cultura MSC e l&#39;attivazione, e quindi rendere le cellule più suscettibili per le applicazioni cliniche. Molti studi sono stati pubblicati che dimostrano la cultura 3D di MSC sia in biomateriali e come aggregati sferici o sferoidi. MSC in biomateriali sono stati inizialmente progettati per tecniche di ingegneria tissutale per sostituire i tessuti danneggiati con ponteggi cellule testa di serie, mentre le culture sferoidali di cellule staminali mesenchimali sono stati visti come un modo per capire il comportamento MSC in vivo dopo la somministrazione delle cellule per le terapie in studi pre-clinici o clinici 4, 5, 7. È interessante notare che, MSC formano sferoidi spontaneamente quando l&#39;aderenza alla plastica coltura dei tessuti non è consentito8, 9, 10. Tradizionalmente, l&#39;aggregazione delle cellule è stato facilitato da metodi pallone filatore o tecniche di sovrapposizione liquidi, metodi utilizzati inizialmente nella biologia del cancro negli sforzi per cercare di imitare il microambiente tumorale. Più di recente, ulteriori metodi sono emersi che dimostrano l&#39;aggregazione delle cellule in piatti della cultura pre-rivestito con prodotti chimici specifici per prevenire cellula-plastica adesione 4, 5, 6. Uno dei metodi più semplici ed economiche per generare sferoidi MSC è loro cultura in gocce appesi, una tecnica che è stato spesso usato per produrre corpi embrionali da cellule staminali embrionali. Con appendere cultura tecnica goccia, l&#39;adesione delle cellule alla plastica coltura tissutale è impedito sospendendo le cellule in una goccia di mezzo sul lato inferiore del coperchio coltura tissutale piatto e permettendo la gravità per facilitare AGGREG cellulezione nel vertice della goccia. La dimensione sferoide può essere facilmente manipolata cambiando la concentrazione cellulare o il volume di goccia, rendendo culture goccia pendente particolarmente facili da controllare. I primi studi sulla cultura 3D di cellule staminali mesenchimali hanno dimostrato differenze radicali nelle caratteristiche delle cellule in 3D rispetto alle loro controparti 2D 6, 8, 9. Allo stesso tempo, i rapporti hanno dimostrato che gli effetti benefici di MSC in vivo affidamento sulla loro capacità di diventare attivato da stimoli microambientali e, in risposta, per produrre anti-infiammatori e immunomodulante fattori di 11. È interessante notare che molti di questi fattori come la prostaglandina E2 (PGE2), fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6), e il fattore di crescita degli epatociti (HGF) sono state prodotte in quantità molto più grandi da sferoidi MSC rispetto MSC tradizionali 2D spianando la strada per la idea diutilizzando colture 3D per attivare le cellule 8, 12, 13. Inoltre, l&#39;attivazione genica in colture 3D apparve ricapitolare meccanismi, almeno in parte, di attivazione delle cellule dopo l&#39;iniezione in topi 12. Attivando MSC prima del loro utilizzo negli esperimenti, gli effetti delle cellule potrebbero essere prolungati e più prominente come l&#39;effetto MSC tradizionale in vivo è spesso ritardata e transitori, e può essere descritto come &quot;mordi e fuggi&quot;. Nel corso degli ultimi anni, importanti studi funzionali utilizzando sferoidi MSC hanno dimostrato che essi possono sopprimere le risposte infiammatorie e modulare l&#39;immunità in vivo influenzando cellule effettrici come i macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, e le cellule T che fanno sferoidi una forma interessante di MSC innescato 2 , 3. Inoltre, la produzione di molecole anti-cancro, come interleukin-24 (IL-24) e fattore di necrosi tumorale-correlati indurre apoptosi-ligando (TRAIL), sono aumentati in colture 3D di MSC rispetto al monostrato MSC, un fenomeno che potrebbe essere sfruttata per terapie antitumorali mirate 8, 10, 14. Come la cultura tradizionale MSC richiesto non solo l&#39;uso di colture di tessuto di plastica, ma anche FBS, un altro ostacolo per rendere sferoidi MSC più suscettibili per uso clinico aveva da superare. Per affrontare questo ostacolo, abbiamo recentemente dimostrato formazione di sferoidi MSC sotto specifiche condizioni XF chimicamente definite e stabilito che le sferoidi MSC risultanti sono stati attivati per produrre le stesse molecole anti-infiammatori e anti-cancro come sferoidi generati in condizioni con FBS 14. Qui, questi risultati sono presentati in diversi protocolli dettagliati che dimostrano la generazione di cellule staminali mesenchimali pre-attivati ​​nelle culture 3D utilizzando XFmedia. Inoltre, i protocolli vengono presentati che descrivono metodi efficaci per valutare i livelli di attivazione delle cellule staminali mesenchimali per quanto riguarda le loro anti-infiammatorio, anti-cancro effetti, insieme con un metodo pratico per trasportare sferoidi intatte in topi.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alfa; (minimo essenziale medio alfa)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>terreno minimo essenziale per la preparazione del terreno di crescita MSC (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (siero fetale bovino), selezione premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>15070063</td><td>componente di terreni di coltura completi per tutti i tipi di cellule</td></tr><tr><td>Unità filtranti di sterilizzazione, 0,22 e micro; m membrana PES</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>terreno di sterilizzazione</td></tr><tr><td>150 mm piatto per coltura cellulare</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; Coltura cellulare SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore umidificato CO2 con camicia d'acqua</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modello 3110</td><td>Incubazione di cellule in coltura</td></tr><tr><td>MCS a passaggio precoce</td><td>Centro per la preparazione e la distribuzione di cellule staminali adulte presso il Texas A& M Health Science Center College of Medicine Istituto di Medicina Rigenerativa presso Scott & Preparazione NA bianca</td><td></td><td>di colture 2D e 3D di MSC</td></tr> a <tr><td>bagnomaria</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>mezzi riscaldanti a 37 gradi C</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>manipolazione manuale di liquidi</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>pipette sereologiche</td></tr><tr><td>per manipolazione Costar pipetta sierologica sterile (5, 10, 25 e 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td> per <td>manipolazione di liquidi</td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), pH 7,4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>per la lavorazione di colture cellulari</td></tr> Soluzione di <tr><td>tripsina/EDTA allo 0,25%</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>sollevamento di cellule aderenti e aggregati cellulari disperdenti</td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 ml</td><td>Centrifugazione cellulare</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 ml</td> Centrifugazione cellulare <td>Corning/BD</td><td>Falcon 352098</td><td>Centrifugazione refrigerata</td></tr><tr><td>Eppendor</td><td>Ependorf/Fisher Scientific</td><td>Modello 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td> per centrifugazione cellulare <td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>Conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>blu di tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 Esclusione</td><td>delle cellule morte SIGMA durante il conteggio delle cellule nell'ematocitometro</td></tr><tr><td>Definito xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Terreni privi di xeno specificamente formulati per la crescita e l'espansione di cellule staminali mesenchimali umane</td></tr><tr><td>Definito xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>Terreno definito e privo di xeno per cellule staminali mesenchimali umane</td></tr><tr><td>HSA (Human serum albumin)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Componente di terreni MSC privi di xeno</td></tr><tr><td>rHSA (albumina sierica umana ricombinante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; SIGMA</td><td>Componente di terreni MSC privi di xeno</td></tr><tr><td>Isolamento dell'RNA totale Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Estrazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Omogeneizzazione del campione prima dell'estrazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>Set di DNasi senza RNAsi</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Eliminazione del DNA su colonna durante l'estrazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp; </td><td>Inibizione ALDRICH delle RNAsi nel tampone RLT</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td> Campione di <td>miscelazione</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA Concentrazione e qualità dell'RNA</td>Biorad NA</tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>trascrizione dell'RNA totale in cDNA</td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>varia la</td><td>combinazione primer/sonda per la PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Fast Universal PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td> Master <td>Mix per la reazione alla PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>centrifugazione cellulare, raccolta e conservazione dei campioni</td></tr> <tr><td>(-80 &deg; C) congelatore</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modello Thermo Forma 8695</td><td>conservazione campioni</td></tr><tr><td>PGE2 (Prostaglandina E2) Kit ELISA</td><td>R& D Sistemi</td><td>KGE004B</td><td>stima della concentrazione di citochine nel campione</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s modificato Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032</td><td>terreni di coltura di macrofagi</td></tr><tr><td>J774 macrofagi di topo</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>linea cellulare di macrofagi di topo</td></tr><tr>piastra a<td>12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro stimolazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>LPS (lipopolisaccaride)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro stimolazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Kit ELISA TNF-a di topo</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>stima della concentrazione di citochine nel campione</td></tr><tr><td>di topo IL-10 (interleuchina 10) Kit ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>Stima della concentrazione di citochine nel campione</td></tr><tr><td>Terreno RPMI-1640</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>terreno di coltura di splenociti</td></tr><tr><td>Topi BALB/c</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>in vivo consegna di sferoidi; preparazione di splenociti</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro stimolazione splenocitaria</td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Preparazione degli splenociti</td></tr><tr><td>Soluzione di lisi dei globuli rossi (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>rimozione dei globuli rossi durante l'isolamento degli splenociti</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&#947; (interferone gamma) Kit ELISA</td><td>R& Sistemi D</td><td>MIF 00</td><td>stima della concentrazione di citochine nel campione</td></tr><tr><td>di cellule di cancro alla prostata LNCaP.</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>studia l'effetto delle MSC 3D sulle linee cellulari tumorali in vitro</td></tr><tr><td>Kit di analisi della proliferazione cellulare basato sul DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>Misurazione del numero di cellule in base al contenuto di DNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>componente del reagente di lisi</td></tr><tr><td>EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)</td>Chelante del calcio <td>FERR1021</td> <td>ThermoFisher</td>,<td> componente del reagente di lisi</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Degradazione dell'RNA per la misurazione del DNA</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multimodale basato su filtro</td><td>Tecnologia BMG</td><td></td><td>Saggi per micropiastre NA (ELISA, quantificazione cellulare, ecc.)</td></tr><tr><td>HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>risorsione degli sferoidi MSC prima delle iniezioni in vivo</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>Anestesia per iniezioni in vivo</td></tr><tr><td>Ossigeno, gas compresso</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>Per l'uso con l'isoflurano</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2 armadio</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modello 1385</td><td></td></tr><tr><td>Catetere/ago per via endovenosa di sicurezza per coltura cellulare, 20 G, 1 pollice</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>Erogazione di shperoid nella cavità peritoneale</td></tr><tr><td>Puntali per micropipette sterili</td><td>Eppendorf</td><td>varia la</td><td>gestione di liquidi/cellule</td></tr></tbody></table>

produzione e somministrazione di therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (msc) spheroids innescato in culture 3-d, in condizioni xeno-free

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) sono molto promettenti in bioingegneria e medicina rigenerativa. MSC possono essere isolate da più tessuti adulti attraverso la loro forte aderenza alla plastica coltura dei tessuti e poi ulteriormente espanse in vitro, più comunemente utilizzando siero fetale bovino (FBS). Poiché FBS può causare MSC diventare immunogeno, la sua presenza nelle culture MSC limita sia applicazioni cliniche e sperimentali delle cellule. (XF) media liberi-xeno Pertanto, gli studi impiegando chimicamente definiti per le culture MSC sono estremamente preziose. Molti effetti benefici di cellule staminali mesenchimali sono state attribuite alla loro capacità di regolare l&#39;infiammazione e l&#39;immunità, soprattutto attraverso la secrezione di fattori immunomodulatori come fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). Tuttavia, MSC richiedono l&#39;attivazione per la produzione di questi fattori e dal momento che l&#39;effetto di MSC è spesso transitoria, grande interesse è emerso per scoprire modi di pre-attivando le cellule prior per il loro utilizzo, eliminando così il tempo di ritardo per l&#39;attivazione in vivo. Qui vi presentiamo i protocolli per attivare in modo efficiente o MSC primi tridimensionale culture (3D) in condizioni XF chimicamente definite e per amministrare questi MSC pre-attivati in vivo. In particolare, abbiamo prima descritto metodi per generare MSC sferica micro-tessuti o &quot;sferoidi&quot; in gocce appesi utilizzando media XF e dimostrare come le sfere e mezzo condizionato (CM) possono essere raccolte per varie applicazioni. In secondo luogo, descriviamo schermi di espressione genica e saggi in vitro funzionali di valutare rapidamente il livello di attivazione MSC in sferoidi, sottolineando il potenziale anti-infiammatori e anti-cancro delle cellule. In terzo luogo, si descrive un nuovo metodo per iniettare sferoidi MSC intatti nel mouse cavità peritoneale in vivo prove di efficacia. Nel complesso, i protocolli qui superare le grandi sfide di ottenere cellule staminali mesenchimali pre-attivato in chimica definita XF concondizioni e offrono un sistema flessibile per amministrare sferoidi MSC per le terapie.

Nel lavoro attuale, appesi culture goccia sono stati impiegati per generare compatte micro-tessuti sferiche o &quot;sferoidi&quot; di MSC attivati ​​in condizioni XF. La tabella di marcia in fase di sperimentazione in figura 1 illustra che le MSC sono incoraggiati a auto-assemblarsi in sferoidi quando sospeso in appeso gocce per 72 ore, dopo di che gli sferoidi, o la CM carichi di fattori terapeutici sfera-derivati, possono essere raccolti e potenzialmente utilizzati in ...

Il potenziale terapeutico delle cellule staminali/stromali mesenchimali (MSC) è ben documentato, tuttavia il metodo migliore per preparare le cellule per i pazienti rimane controverso. In questo articolo, comunichiamo i protocolli per generare e somministrare in modo efficiente aggregati sferici terapeutici o "sferoidi" di MSC innescati in condizioni prive di xeno per applicazioni sperimentali e cliniche.

Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

L'obiettivo generale di questi esperimenti è generare ed iniettare in modo efficiente aggregati sferici terapeutici, o sferoidi, di cellule staminali/mesenchimali, o MSC, potenziate in condizioni prive di componenti xenogene, in applicazioni sperimentali e cliniche. Questi metodi possono contribuire a superare gli ostacoli principali nel campo della terapia con MSC, come la scarsa ritenzione cellulare, la sopravvivenza e la funzionalità, che spesso si osservano dopo il trapianto di cellule disperse e in seguito a condizioni avverse comunemente associate al danno tissutale.Il principale vantaggio di queste procedure è che gli sferoidi di MSC possono essere preparati, attivati e iniettati in assenza di prodotti animali immunogeni, come il FBS, che attualmente limitano alcune applicazioni cliniche delle cellule e possono anche rendere ambigua l'interpretazione di alcuni dati preclinici. Sebbene questo meccanismo possa essere molto utile nel mediare l'efficacia basata sulle MSC, può essere impiegato anche per comprendere la riparazione tissutale mediata dalle MSC e in che modo altre formulazioni di mezzo possono modificare il profilo terapeutico del genex plus. La dimostrazione di ques

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Coltura umane cellule mesenchimali stromali (hMSCs) con siero autologo, riduce i rischi di rigetto di materiale xenogenico e altri effetti negativi. Esso permette inoltre il recupero di un sottoinsieme di progenitori mesodermici, che può trasportare hMSCs freschi. Incorporare hMSCs in un coagulo di fibrina autologa consente una facile maneggevolezza ed efficace impianto chirurgico.

Mesenchimali stromali coltura cellulare e la consegna in autologhi Condizioni: un approccio intelligente per applicazioni ortopediche

Qui, presentiamo protocolli di coltura del legamento parontale umano (PDL) sferoidi cellulari da pellicole chitosane. La coltura degli sferoidi cellulari tridimensionali (3D) fornisce un'alternativa al sistema di coltura del polistirolo (TCPS) della coltura dei tessuti convenzionale.

Formazione di spheroidcellule a celle di legamento parontale umano su Chitosan Films

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Qui presentiamo un protocollo per raccogliere cellule aderenti da palloni multistrato in modo semi-automatico chiuso utilizzando un sistema di centrifugazione controcorrente. Questo protocollo può essere applicato per la raccolta di celle aderenti e in sospensione da altre piattaforme di espansione cellulare con poche modifiche ai passaggi esistenti.

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

I prodotti xenogenici (chimici o di derivazione animale) introdotti nelle fasi di preparazione/manipolazione della terapia cellulare sono associati ad un aumentato rischio di reattività immunitaria e trasmissione patogena nei pazienti ospiti. Qui viene descritto un metodo completamente privo di xenogenici per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano.

Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Un protocollo è descritto per la produzione di cellule dipendenti dall'ancoraggio per microtrasportatori e microbioreatori come potenziali terapie cellulari. Rivolgendosi a un caso d'uso della sindrome da difficoltà respiratoria acuta, sono illustrati un rendimento cellulare comparabile e un'espressione genica favorevole rispetto alle condizioni di processo basate su fiaschette. Questo protocollo è estendibile ad altre celle dipendenti dall'ancoraggio e indicazioni del bersaglio.

Produzione basata su microbioreattori di cellule stromali mesenchimali dipendenti dall'ancoraggio, preparate per la sindrome da difficoltà respiratoria acuta

Qui descriviamo i metodi per la dissezione dei tessuti fetali e materni da placenta umana termine, seguito da isolamento e l'espansione delle cellule stromali / staminali mesenchimali (MSC) da questi tessuti.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Un metodo per l'allevamento di Drosophila melanogaster in condizioni axeniche e gnotobiotic è presentato. Fly embrioni vengono dechorionated in ipoclorito di sodio, trasferiti asetticamente alla dieta sterili, e allevati in contenitori chiusi. Inoculando dieta ed embrioni con i batteri porta ad associazioni gnotobiotic, e la presenza di batteri è confermata dalla placcatura di tutto il corpo omogenati Drosophila.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

Scopri come generare e somministrare sferoidi di cellule stromali mesenchimali (MSC) in condizioni xeno-free per migliorare la ritenzione cellulare e la funzionalità terapeutica in applicazioni rigenerative.

Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free (Video) | JoVE Journal

Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free

Esplora altri video