Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare l'autofosforilazione di chinasi istidiniche batteriche purificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione a due componenti, come l'effetto di stimoli specifici sulle interazioni proteina-proteina nell'autofosforilazione delle chinasi istidiniche.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che si tratta di un metodo ad alto rendimento che può essere utilizzato per rilevare con precisione picomoli di fosfoistidina formati e ottenere parametri cinetici per le chinasi dell'istidina. Durante il mio dottorato, ho utilizzato la filtrazione su membrane di nitrocellulosa per quantificare ligandi radioattivi legati alle proteine. Di conseguenza, è sembrato logico sviluppare una tecnica simile per quantificare la fosforilazione dell'istidina nelle chinasi dell'istidina batteriche.

Iniziare questa procedura preparando i reagenti e i materiali come descritto nel protocollo testuale. Per allestire l'apparato per dot-plot a 96 pozzetti, tagliare un pezzo di membrana di nitrocellulosa di otto centimetri per dodici centimetri. Posizionare la nitrocellulosa nell'apparato per dot-plot.

Assicurarsi che la membrana sia posizionata correttamente in modo che l'apparecchiatura sia sigillata e tutti i pozzetti siano completamente coperti dalla membrana. Per raccogliere il filtrato, collegare l'apparecchiatura a un secondo pallone laterale. Dal tubo di valvola, collegare un tubo adeguato in modo da poter utilizzare comodamente l'apparecchiatura senza rovesciare il pallone secondario.

Quindi, collegare il pallone secondario con braccio laterale a una fonte di vuoto ad aspiratore. Verificare che l'apparato sia completamente sigillato applicando il vuoto all'apparato. Se l'apparato è stato assemblato correttamente, un forte vuoto sarà presente in tutti i pozzetti.

Tutti i collegamenti dei tubi possono essere avvolti con pellicola trasparente o Parafilm per garantire una chiusura ermetica. Prima dell'avvio, preparare tutti e quattro i componenti della reazione come soluzioni stock X, come descritto nel protocollo testuale. Mescolare volumi uguali di buffer di reazione, chinasi dell'istidina e acqua doppio distillata.

Lasciare che questi componenti della reazione raggiungano l'equilibrio a temperatura ambiente per un breve periodo di tempo. Per avviare la reazione, aggiungere un volume di soluzione di gamma-32 P ATP e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Monitorare il tempo trascorso della reazione con un timer e lasciare procedere la reazione per il tempo desiderato.

Interrompere la reazione. Aggiungere un'aliquote della reazione a acido fosforico 325 millimolare. Porre immediatamente le reazioni interrotte sul ghiaccio finché tutte le reazioni non sono state terminate.

Posizionare l'apparato preassemblato per dot-plot a 96 pozzetti in un contenitore secondario. Questo contenitore deve essere abbastanza grande da permettere una facile disassemblaggio dell'apparato, poiché l'apparato e la membrana saranno radioattivi dopo l'uso. Applicare un vuoto all'apparato per dot-plot a 96 pozzetti.

Una volta che l'apparato è sotto vuoto, pipettare con attenzione la reazione spenta direttamente sul filtro di nitrocellulosa in ciascun pozzetto. Ripetere questo processo fino a quando tutte le reazioni sono state caricate sul filtro. Poiché la capacità di legame della nitrocellulosa è maggiore rispetto alla quantità di chinasi istidinica depositata, si può presumere che quasi tutta la chinasi si leghi al filtro quando viene caricata correttamente.

A seconda dell'apparecchiatura utilizzata, prestare attenzione a non forare la nitrocellulosa. Assicurarsi che tutta la reazione sia venuta a contatto con la nitrocellulosa. È facile che parte della reazione aderisca alle pareti del pozzetto.

Lavare le pozzette con 100 microlitri di acido fosforico 25 millimolare freddo di ghiaccio. Questo permetterà a qualsiasi volume di reazione che potrebbe essere rimasto intrappolato nella pozzetta di raggiungere la membrana, garantendo un caricamento completo di tutte le reazioni. Lasciare che l'intero volume passi attraverso la membrana.

Smontare con attenzione l'apparecchiatura prima di spegnere il vuoto. Si avvisa che in questo momento sia l'apparecchiatura che la membrana di nitrocellulosa sono radioattive. Non rimuovere alcun componente dell'apparecchiatura dal contenitore secondario.

Con una pinzetta, trasferire con attenzione la membrana di nitrocellulosa dall'apparecchio a un contenitore contenente circa 200 millilitri di acido fosforico ghiacciato 25 millimolare. Coprire il contenitore, poiché il lavaggio sarà radioattivo. A questo punto, è possibile spegnere il vuoto.

Posizionare il contenitore con la membrana di lavaggio su un agitatore. Lasciare agitare dolcemente la membrana per 20 minuti. Trascorsi 20 minuti, versare con attenzione la soluzione di lavaggio usata in un secchio grande da utilizzare per lo stoccaggio temporaneo dei rifiuti.

Aggiungere 200 millilitri di acido fosforico 25 millimolare ghiacciato alla membrana. Lavare la membrana in questo modo almeno tre volte per rimuovere il segnale di fondo di gamma-32 P ATP dalla membrana. Dopo il terzo lavaggio, verificare la soluzione di lavaggio utilizzata per rilevare radiazioni mediante un contatore Geiger.

Continuare a lavare la membrana fino a quando non è presente alcun segnale nella soluzione di lavaggio. Dopo che la membrana è stata lavata sufficientemente, lasciarla asciugare brevemente all'aria, operazione che richiede tipicamente cinque minuti o meno. Dopo l'esposizione della nitrocellulosa a un colorante verde per il fosforo, come descritto nel protocollo testuale, procedere alla colorazione con Ponceau S e alla decolorazione.

Immergere brevemente la membrana di nitrocellulosa nella soluzione di colorante Ponceau S per uno o due minuti. Bagnare completamente l'intera membrana con il colorante prima della decolorazione. Successivamente, eliminare l'eccesso di Ponceau S dalla membrana.

Risciacquare la membrana con acqua doppio distillata fino a quando solo le macchie della chinasi dell'istidina risultano colorate. Si noti che questa procedura funzionerà solo se tutte le macchie contengono quantità rilevabili di proteina. Utilizzando delle forbici, ritagliare ogni macchia presente sulla membrana di nitrocellulosa.

Non è necessario tagliare perfettamente lungo il bordo della macchia colorata. Se la membrana è stata lavata adeguatamente, lo sfondo dovuto alle dimensioni variabili delle macchie ritagliate è trascurabile. È importante soltanto ritagliare l'intera macchia per ogni reazione.

Utilizzando pinzette, trasferire con attenzione ogni spot in vial per scintillazione. Non è necessario alcun cocktail di scintillazione, poiché il fosforo-32 è facilmente rilevabile mediante radiazione Cherenkov. Successivamente, applicare su quadrati di nitrocellulosa di un centimetro per un centimetro diverse diluizioni della soluzione di gamma-32 P ATP.

Utilizzando pinzette, trasferire con attenzione ogni quadrato in vial per scintillazione senza aggiungere il cocktail di scintillazione. Questi campioni verranno utilizzati per generare una curva standard per determinare i conteggi al minuto per picomole della soluzione di ATP. Qui è mostrata la colorazione con Ponceau della membrana di nitrocellulosa.

La colorazione è uniforme in tutti i campioni, indicando che tutti i campioni sono stati caricati in quantità uguale. I risultati della fluorografia della membrana in nitrocellulosa mostrano il livello relativo di fosfoistidina radioetichettata in ciascun punto. La quarta e l'ottava riga sono controlli negativi che dimostrano come l'eccesso di ATP sia stato rimossa dalla membrana in nitrocellulosa.

Di seguito sono mostrati i risultati rappresentativi della quantificazione dell'autofosforilazione della chinasi dell'istidina. Questi dati sono ottenuti dal conteggio di scintillazione di ogni spot ritagliato dalla membrana. La curva standard di conteggi al minuto per picomole di ATP, mostrata qui, è anch'essa ottenuta dal conteggio di scintillazione ed è utilizzata per calcolare le picomoli di fosfoistidina presenti in ciascun campione.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'introduzione di stimoli cognati o proteine che si ipotizza modulino l'attività delle chinasi, possono essere aggiunti all'esperimento per rispondere a ulteriori domande, ad esempio l'effetto di questi additivi sull'attività delle chinasi. Non dimenticare che lavorare con sostanze radioattive può essere estremamente pericoloso. Precauzioni come un'adeguata formazione sulla sicurezza radiologica e l'uso di dispositivi di protezione individuale e schermature devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.