Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare l'autofosforilazione delle istidine chinasi batteriche purificate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione a due componenti. Come l'effetto di stimoli affini nelle interazioni proteina-proteina sull'autofosforilazione delle istidina chinasi.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che si tratta di un metodo ad alto rendimento che può essere utilizzato per rilevare con precisione i picomoli di fosfoistadina formati e ottenere parametri cinetici per le istidina chinasi. In qualità di borsista post-dottorato, utilizzo la filtrazione su membrane di nitrocellulosa per quantificare i ligandi radioattivi legati alle proteine. Di conseguenza, aveva senso sviluppare una tecnica simile per quantificare la fosforilazione dell'istidina nelle istidina chinasi batteriche.

Iniziare questa procedura con la preparazione dei reagenti e dei materiali come descritto nel protocollo di testo. Per impostare l'apparato dot-plot a 96 pozzetti, tagliare un pezzo di membrana di nitrocellulosa di otto centimetri per 12 centimetri. Posizionare la nitrocellulosa nell'apparato dot-plot.

Assicurarsi che la membrana si adatti in modo tale che l'apparecchio sia sigillato e che tutti i pozzetti siano completamente coperti dalla membrana. Per raccogliere il filtrato, collegare l'apparecchio a un pallone secondario per armi da fianco. Dallo stelo della valvola, collegare un tubo adeguato per consentire un comodo utilizzo dell'apparecchio senza ribaltare il pallone secondario.

Quindi, collegare il pallone secondario del braccio laterale a una fonte di vuoto dell'aspiratore. Verificare che l'apparecchio sia completamente sigillato applicando il vuoto all'apparecchio. Se l'apparecchio è assemblato correttamente, in tutti i pozzetti sarà presente un forte vuoto.

Tutti i collegamenti dei tubi possono essere avvolti in Parafilm o Saran per garantire una tenuta ermetica. Prima di iniziare, preparare tutti e quattro i componenti della reazione come quattro soluzioni stock X, come descritto nel protocollo di testo. Mescolare volumi uguali di tampone di reazione, istidina chinasi e acqua distillata doppia.

Lasciare che questi componenti di reazione si equilibrino a temperatura ambiente per un breve periodo. Per avviare la reazione, aggiungere un volume di soluzione di gamma-32 P ATP e mescolare facendo pippetting su e giù. Tieni traccia del tempo di reazione trascorso con un timer e lascia che la reazione proceda per il tempo desiderato.

Spegni la reazione. Aggiungere un'aliquota della reazione all'acido fosforico 325 millimolare. Mettere immediatamente le reazioni spente sul ghiaccio fino a quando tutte le reazioni non sono state terminate.

Posizionare l'apparato dot-plot a 96 pozzetti preassemblato in un contenitore secondario. Questo contenitore deve essere abbastanza grande da consentire un facile smontaggio dell'apparecchiatura, poiché l'apparecchiatura e la membrana saranno radioattivi dopo l'uso. Applicare un vuoto all'apparato dot-plot a 96 pozzetti.

Una volta che l'apparecchio è sotto vuoto, pipettare con cura la reazione temprata direttamente sulla membrana di nitrocellulosa in ciascun pozzetto. Ripetere questo processo fino a quando tutte le reazioni non sono caricate sulla membrana. Poiché la capacità di legare la nitrocellulosa è maggiore della quantità di istidina chinasi maculata, si può presumere che quasi tutta la chinasi si leghi alla membrana se caricata correttamente.

A seconda dell'apparecchio utilizzato, fare attenzione a non forare la nitrocellulosa. Osservate che tutta la reazione è entrata in contatto con la nitrocellulosa. È facile che alcune delle reazioni si attacchino alle pareti del pozzo.

Lavare i pozzetti con 100 microlitri di acido fosforico 25 millimolare ghiacciato. Ciò consentirà a qualsiasi volume di reazione che potrebbe essere stato intrappolato nel pozzo di raggiungere la membrana, garantendo il caricamento completo di tutte le reazioni. Lasciare che l'intero volume fluisca attraverso la membrana.

Smontare con cura l'apparecchio prima di spegnere l'aspirapolvere. Si noti che sia l'apparecchio che la membrana di nitrocellulosa sono radioattivi in questo momento. Non rimuovere alcun componente dell'apparecchio dal contenitore secondario.

Con una pinza, trasferire con cura la membrana di nitrocellulosa dall'apparecchio in un contenitore di circa 200 millilitri di acido fosforico ghiacciato da 25 millimolari. Metti un coperchio su questo contenitore, poiché il lavaggio sarà radioattivo. A questo punto, l'aspirapolvere potrebbe essere spento.

Posizionare il contenitore con la membrana di lavaggio su un bilanciere. Lasciare che la membrana oscilli delicatamente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, decantare accuratamente la soluzione di lavaggio usata in un grande secchio da utilizzare per lo stoccaggio temporaneo dei rifiuti.

Aggiungere 200 millilitri di acido fosforico 25 millimolare ghiacciato alla membrana. Lavare la membrana in questo modo almeno tre volte per rimuovere il segnale di fondo gamma-32 P ATP dalla membrana. Dopo il terzo lavaggio, testare la soluzione di lavaggio utilizzata per l'irradiazione con un contatore Geiger.

Continuare a lavare la membrana fino a quando non è presente alcun segnale nella soluzione di lavaggio. Dopo che la membrana è stata sufficientemente lavata, lasciarla asciugare brevemente all'aria, operazione che in genere richiede cinque minuti o meno. Dopo l'esposizione della nitrocellulosa a un verde fosforoso, come descritto nel protocollo di testo, preparare per la colorazione e la decolorazione di Ponceau S.

Immergere brevemente la membrana di nitrocellulosa nella soluzione colorante Ponceau S per uno o due minuti. Bagnare l'intera membrana con la macchia prima della decolorazione. Quindi, decantare l'eccesso di Ponceau S dalla membrana.

Sciacquare la membrana con acqua distillata doppia fino a quando non si macchiano solo le macchie dell'istidina chinasi. Si noti che questa procedura funzionerà solo se tutti gli spot contengono quantità rilevabili di proteine. Usando le forbici, ritaglia ogni punto sulla membrana di nitrocellulosa.

Non è necessario tagliare perfettamente lungo il bordo del punto macchiato. Se la membrana è stata lavata a sufficienza, lo sfondo dovuto alla dimensione variabile delle macchie ritagliate è trascurabile. È importante solo ritagliare l'intero punto per ogni reazione.

Usando una pinza, trasferire con cura ogni punto nelle fiale di scintillazione. Non è necessario alcun cocktail di scintillazione, poiché il fosforo 32 è facilmente rilevabile dalla radiazione Cherenkov. Successivamente, individuare diverse diluizioni della soluzione di ATP gamma-32 P su quadrati di nitrocellulosa di un centimetro per un centimetro.

Usando una pinza, trasferisci con cura ogni quadrato in fiale di scintillazione senza cocktail di scintillazione. Questi campioni saranno utilizzati per generare una curva standard per determinare i conteggi al minuto per picomolo della soluzione di ATP. La colorazione di Ponceau della membrana di nitrocellulosa è mostrata qui.

La colorazione è uniforme in tutti i campioni, indicando che tutti i campioni sono caricati allo stesso modo. I risultati della fluorografia della membrana nitrocellulosica mostrano il livello relativo di fosfoistidina radiomarcata in ciascun punto. La quarta e l'ottava fila sono controlli negativi che dimostrano che l'ATP in eccesso viene lavato via dalla membrana di nitrocellulosa.

Qui sono mostrati i risultati rappresentativi della quantificazione dell'autofosforilazione dell'istidina chinasi. Questi dati sono generati dal conteggio a scintillazione di ogni punto ritagliato dalla membrana. La curva standard dei conteggi al minuto per picomolo di ATP mostrata qui è anch'essa generata dal conteggio a scintillazione e viene utilizzata per calcolare i picomoli di fosfoistidina presenti in ciascun campione.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'introduzione di stimoli affini o proteine che si ipotizza possano modulare l'attività chinasica, possono essere aggiunti all'esperimento per rispondere a ulteriori domande come l'effetto di questi additivi sull'attività chinasica. Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese precauzioni come un'adeguata formazione sulla sicurezza dalle radiazioni e l'uso di dispositivi di protezione individuale e schermi.