Name: Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri un saggio di legame alla nitrocellulosa per quantificare l'autofosforilazione di chinasi istidiniche batteriche. Questo metodo ad alto rendimento rileva picomoli di fosfoistidina e fornisce parametri cinetici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Pubblica Istruzione attraverso l&#39;assistenza Laurea in Aree di programma di fabbisogno nazionale (P200A100044).

Attenzione: Questo protocollo richiede una formazione adeguata per l&#39;uso e la manipolazione di materiali radioattivi. Si prega di utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto durante l&#39;esecuzione di questo test, tra cui schermatura contro le radiazioni beta. I rifiuti radioattivi deve essere maneggiato con cura, come i grandi volumi di rifiuti sono generati durante la fase di lavaggio dell&#39;esperimento. Assicurarsi che la rifiuti sono stoccati in un contenitore in posizione verticale, come un grande secchio o una bottiglia che non sarà facilmente rovesciato o fuoriuscita. Una volta che l&#39;esperimento è concluso, trasferire accuratamente tutti i rifiuti liquidi ad segnato in modo appropriato contenitori per rifiuti radioattivi. Manipolare tutti i materiali con cura, e mantenere un contatore Geiger vicino per monitorare l&#39;area di lavoro per la contaminazione. NOTA: Questo protocollo è una versione rivista di un saggio riportato in precedenza dal nostro gruppo. 15 stabilità Phosphohistidine in H 3 PO 4 dovrebbe essere testato per qualsiasi istidina chinasi non caratterizzato prima di utilizzare questo metodo. Il phosphohistidine sttest di abilità è stato descritto in precedenza. 15 Un controllo negativo che non contiene chinasi deve essere incluso. Ciò è necessario per sottrarre il segnale di fondo da ogni campione e assicurarsi che [γ- 32 P] -ATP è sufficientemente lavato dalla membrana. 1. Preparazione dei reagenti e materiali <ol><li> Purificare chinasi istidina dalla coltura batterica prima di utilizzare questo test. <ol><li> Purificare una chinasi istidina (gene ID 1.189.383) da Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) per lo sviluppo di questo test. Clonare il chinasi in vettore di espressione pET-23aHis-TEV con NdeI e siti di restrizione XhoI, ed effettuare mutagenesi sito-diretta per produrre il mutante costruire Vp1876 D499A. </li><li> Trasformare il plasmide in E. coli BL21 (DE3) pLysS, e far crescere le cellule in mezzi TB a 37 ° C. culture integrare con ampicillina (100 mg / ml) e cloramfenicolo (34 mg / ml), e crescere con l&#39;agitazione(250 rpm) ad una OD 600 di 0,6. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina con IPTG ad una concentrazione finale di 25 micron, e far crescere le culture per una notte a 16 ° C. Celle di raccolta per centrifugazione (5000 x g), Lyse per sonicazione, e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari (18.000 xg). </li><li> Purificare la chinasi His-tag utilizzando Ni-NTA agarosio. Confermare la purezza mediante SDS-PAGE. Ottimizzare la purificazione per ogni proteina, e confermare la purezza prima di utilizzare questo test. </li></ol></li><li> Preparare la mm H 3 PO 4 soluzione di lavaggio 25. Per 1 L di acqua deionizzata distillata, aggiungere H 3 PO 4 ad una concentrazione finale di 25 mM. Il pH di tale soluzione è circa 2,0. Posizionare 25 mM H 3 PO 4 su ghiaccio. </li><li> Preparare una soluzione 13x magazzino di 325 mm H 3 PO 4, da utilizzare per estinguere reazione chinasi. Il pH di tale soluzione è circa 1,5. Mettere 325 mm H 3 PO 4 sul ghiaccio. NOTA: H 3 PO 4 </sub&gt; Ad una concentrazione finale di 25 mM quenches sufficientemente la reazione, e aiuta anche a bloccare fosfato radiomarcato non associato ad istidina di legarsi alla membrana di nitrocellulosa. </li><li> Preparare una soluzione tampone di reazione 4x madre contenente 160 mM Tris-HCl pH 8.0, 600 mm KCl, 16 mM MgCl 2, e il 40% di glicerolo. </li><li> Quantificare istidina chinasi concentrazione di proteine con metodi stabiliti di concentrazione (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Preparare una soluzione istidina chinasi con una concentrazione che è 4 volte la concentrazione finale desiderata. Per ottenere adeguato segnale, la concentrazione proteica finale nella reazione dovrebbe essere idealmente almeno 5 micron. </li><li> Preparare una radiomarcato 4x [γ- 32 P] -ATP soluzione con la concentrazione 4x adeguata di ATP senza etichetta e l&#39;etichetta: il rapporto senza etichetta per l&#39;esperimento. NOTA: La quantità di [γ- 32 P] -ATP che dovrebbe essere incluso in questo mix dipende da quanto [^7; - 32 P] -ATP in ultima analisi, essere individuato per ogni reazione. Abbiamo ottenuto segnale adeguata, con concentrazioni finali comprese tra 0,1-5 uCi per reazione. È importante che l&#39;etichetta: senza etichetta rapporto ATP essere mantenuta costante per tutte le reazioni in un dato esperimento. diluizioni seriali devono essere effettuate quando più concentrazioni di ATP sono desiderati, in quanto questo e mantenere il etichettato: senza etichetta costante il rapporto ATP in tutte le concentrazioni. Le concentrazioni di ATP finali in genere varia da 10 micron a almeno 1 mm, e ogni concentrazione devono essere analizzati in triplice copia per ottenere dati cinetici affidabili. </li><li> 96- apparato ben Dot Blot <ol><li> Tagliare un pezzo x 12 cm 8 cm di membrana di nitrocellulosa (dimensione dei pori 0,2 micron). </li><li> Posizione nitrocellulosa in un apparato dot blot, assicurando che la membrana si adatta in modo tale che l&#39;apparecchio è sigillato, e tutti i pozzetti sono completamente coperta dalla membrana. Se montato correttamente, non ci dovrebbero essere perdite d&#39;aria quando il vuoto è applied. </li><li> Per raccogliere filtrato, collegare l&#39;apparecchio a un pallone braccio laterale secondario. Dal stelo della valvola, collegare il tubo adeguata in modo tale che il dispositivo può essere utilizzato comodamente senza ribaltare il matraccio secondario. </li><li> Collegare il pallone braccio laterale secondario per fonte di aspirazione / vuoto. </li><li> Prova che l&#39;apparecchio è completamente sigillato applicando vuoto per l&#39;apparato. Se l&#39;apparato viene montato correttamente, una forte depressione sarà presente in tutti i pozzetti. Tutti i collegamenti dei tubi possono essere avvolti in Parafilm o Saran Wrap per garantire una perfetta tenuta. </li><li> Facoltativamente, per testare il vuoto, pipetta 100 microlitri di tampone di reazione in un pozzetto. Il vuoto dovrebbe essere abbastanza forte per disegnare tutto il liquido attraverso il pozzo e sulla membrana. </li><li> Spegnere il vuoto fino a quando tutti i campioni sono pronti per essere individuati sulla membrana. </li></ol></li></ol> 2. Reazione Iniziazione e Tempra <ol><li> Miscelazione dei componenti di reazione <ol><li> Prima di initizione, preparare tutti i quattro componenti della reazione come soluzioni madre 4x: tampone di reazione (vedere paragrafo 1.4), istidina chinasi (1.5), [γ- 32 P] -ATP (1.6), e DDH 2 O. </li><li> Miscelare uguali volumi di tampone di reazione, istidina chinasi, e DDH 2 O. Lasciare questi componenti di reazione equilibrare a temperatura ambiente per un breve periodo (10 min). NOTA: Il volume finale di reazione dipende dal fatto che l&#39;esperimento è dipendente dal tempo, l&#39;enzima-dipendente, o substrato-dipendente. reazioni dipendenti dal tempo devono essere più grandi, come più aliquote sono prese dalla stessa reazione e raffreddati al punto di tempo desiderato. Il volume di reazione dipenderà dal numero di punti di tempo desiderati. Il test è ottimizzato per ciascuna macchia sulla membrana di nitrocellulosa per contenere 30 microlitri della reazione. Così, se 10 punti di tempo sono desiderati, il volume di reazione deve essere di almeno 300 ml (un volume superiore come 330 microlitri sarebbe preferibile nel caso di eventuali errori di pipettamento).Enzima e gli esperimenti substrato-dipendente richiedono volumi di reazione più piccoli. Il volume di reazione per questi esperimenti può essere piccolo come 30 microlitri, in quanto questo è il volume finale che sarà depositata su membrana di nitrocellulosa. </li><li> Per iniziare la reazione, aggiungere un volume della soluzione [γ- 32 P] -ATP alla reazione e mescolare pipettando su e giù. Traccia tempo di reazione trascorso con un timer e lasciare che la reazione di procedere per il tempo desiderato. </li><li> Per spegnere la reazione, aggiungere 1/13 del volume di reazione totale di ghiacciata 325 mM H 3 PO 4 alla reazione e mescolare pipettando su e giù. In alternativa, aggiungere una aliquota della reazione a 325 mM H 3 PO 4. NOTA: La concentrazione finale di H 3 PO 4 dovrebbe essere di 25 mM per placare sufficientemente la reazione. Ad esempio, aggiungere 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO 4 a 30 microlitri di reazione, oppure aggiungere 30 microlitri di reazione a 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO &lt;sub&gt; 4. Il pH finale della reazione è di circa 4,0. Questa concentrazione di H 3 PO 4 è stato testato e confermato per placare la reazione della chinasi in questo buffer senza degradare phosphohistidine. <ol><li> Ad esempio, mescolare 7,5 microlitri di buffer 4x reazione, 7,5 microlitri 4x istidina chinasi, e 7,5 ml DDH 2 O. Iniziato reazione con 7,5 ml [γ- 32 P] -ATP. Placare la reazione con 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO 4. </li></ol></li><li> Porre immediatamente reazioni bonificati sul ghiaccio fino a quando tutte le reazioni sono stati terminati. NOTA: Per massimizzare l&#39;efficienza, si consiglia di avviare una reazione ogni 15 o 20 s fino a tutte le reazioni sono iniziati, e una volta che il tempo di reazione desiderata è passato, placare una reazione ogni 15 o 20 s fino a quando tutti sono state spente. Per coloro che utilizzano il test per la prima volta, un intervallo più lungo può essere più gestibile. </li></ol></li></ol> 3. Spotting oReazioni f bonificati di nitrocellulosa <ol><li> Inizia vuoto su 96 pozzetti apparato macchia dot <ol><li> Mettere l&#39;apparato preassemblato 96 pozzetti macchia punto (sezione 1.7) in un contenitore secondario. Questo contenitore deve essere abbastanza grande per l&#39;apparato di essere facilmente smontabile, come l&#39;apparato e la membrana sarà radioattivi dopo l&#39;uso. </li><li> Applicare il vuoto all&#39;apparato 96 pozzetti macchia punti. </li><li> Una volta che l&#39;apparato è sotto vuoto, pipettare attentamente la reazione bonificato direttamente sulla membrana di nitrocellulosa in ciascun pozzetto. Ripetere fino a quando tutte le reazioni sono caricati sulla membrana. Poiché la capacità di legame di nitrocellulosa (75 - 110 mg / cm 2) è maggiore della quantità di istidina chinasi che è individuato, si può presumere che quasi tutti chinasi si lega alla membrana quando caricato correttamente. NOTA: A seconda dello strumento utilizzato, bisogna fare attenzione a non forare la nitrocellulosa. Si osservi che tutti la reazione ha preso contatto con the nitrocellulosa. È facile per alcuni o tutti la reazione al bastone alle pareti del pozzo, e non raggiungono la nitrocellulosa. </li><li> Lavare i pozzetti con 100 ml di ghiacciata 25 mm H 3 PO 4. Ciò consentirà qualsiasi volume di reazione che può essere stato intrappolato nel pozzo per raggiungere la membrana, garantendo carico completo di tutte le reazioni. Consentire l&#39;intero volume di fluire attraverso la membrana. </li></ol></li><li> lo smontaggio e trasferimento Apparato membrana di nitrocellulosa <ol><li> Disassemblare con cura l&#39;apparato prima di spegnere il vuoto. Occorre considerare che sia l&#39;apparato e la membrana di nitrocellulosa sono radioattivi in ​​questo momento. Non rimuovere i componenti dell&#39;apparato dal contenitore secondario in questo momento. </li><li> Con pinze, trasferire accuratamente la membrana di nitrocellulosa dall&#39;apparato ad un contenitore di 200 ml circa 25 mM ghiacciato H 3 PO 4. Mettere un coperchio su questo contenitore, come il lavaggio sarà radioactive. In questo momento, il vuoto può essere spento. </li></ol></li></ol> 4. nitrocellulosa Processing <ol><li> nitrocellulosa lavaggio <ol><li> Posizionare il contenitore con la membrana lavaggio su un bilanciere. Lasciare la membrana al rock delicatamente per 20 min. </li><li> Dopo 20 min, con attenzione decantare la soluzione di lavaggio utilizzato in un grande secchio da utilizzare per lo stoccaggio temporaneo dei rifiuti. Aggiungere 200 ml di ghiacciata 25 mm H 3 PO 4 alla membrana e ripetere. NOTA: Almeno sono necessari per rimuovere lo sfondo [γ- 32 P] segnale -ATP dalla membrana tre 20 min lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, testare la soluzione di lavaggio utilizzato per la radiazione con un contatore Geiger. Continuare lavare la membrana come descritto sopra finché nessun segnale è presente nella soluzione di lavaggio. </li></ol></li><li> nitrocellulosa essiccazione <ol><li> Dopo la membrana è sufficientemente lavato, consentire la membrana all&#39;aria brevemente secca. Questo richiede in genere 5 minuti o meno.</li></ol></li></ol> 5. L&#39;esposizione a bagagli Phosphor schermo Nota: Questa sezione è facoltativa. Esponendo la membrana ad uno schermo al fosforo è vantaggiosa in quanto consente la visualizzazione dell&#39;intensità della chinasi radiomarcato in ogni punto sulla membrana. L&#39;intensità relativa di questi punti è direttamente proporzionale alla quantità di fosforilata istidina chinasi in ogni punto. L&#39;intensità può essere quantificata con un software di elaborazione delle immagini, e questi risultati può essere paragonato a quelli generati dalla sezione 7. Inoltre, questo passaggio consente un controllo di qualità. Anomalie visto in questa scansione potrebbero spiegare i risultati irregolari ottenuti dal conteggio a scintillazione. <ol><li> Preparazione schermo al fosforo <ol><li> Prima di esporre la membrana allo schermo di fosfori stoccaggio, esporre lo schermo al fosforo per luce bianca per almeno 5 minuti. Questo assicura che qualsiasi immagine residua che può essere tenuto dallo schermo viene cancellata. </li><li> Assicurarsi che lo schermo sia pulitoed asciutto. Se necessario, pulire delicatamente lo schermo con una soluzione di pulizia schermo al fosforo approvato dal produttore di schermi, e asciugare. </li></ol></li><li> preparazione membrana di nitrocellulosa <ol><li> spostare con attenzione la membrana di nitrocellulosa secca in un involucro di plastica sottile per evitare che l&#39;umidità residua da danneggiare lo schermo al fosforo. Assicurarsi che non vi siano grinze o bolle. </li></ol></li><li> L&#39;esposizione a schermo al fosforo <ol><li> Posizionare la membrana di nitrocellulosa avvolto nella schermata di cassette di archiviazione al fosforo, posizionare lo schermo a faccia in giù sulla membrana, e chiudere la cassetta. Non aprire la cassetta o spostare la membrana fino a quando è il momento di eseguire la scansione del schermo al fosforo, come lo spostamento della membrana durante l&#39;esposizione causerà una doppia immagine o macchiata da catturare. </li><li> Esporre per almeno 4 ore, o fino a quando il produttore schermo al fosforo suggerisce. </li><li> Dopo esposizione è stata completata, la scansione dello schermo fosforo e catturare l&#39;immagine con uno scanner fosforo. </li></ol></li></ol> 6. Preparazione nitrocellulosa a membrana per il conteggio a scintillazione <ol><li> Ponceau S colorazione e decolorazione <ol><li> Brevemente immergere la membrana di nitrocellulosa in soluzione colorante Ponceau S (0,1% Ponceau S (w / v) in 5% di acido acetico) per 1 - 2 min. Bagnare tutta la membrana con la macchia prima decolorazione. </li><li> Decantare eccesso Ponceau S dalla membrana. </li><li> Sciacquare la membrana con DDH 2 O fino a quando solo le macchie dalla chinasi istidina sono macchiati. Si noti che questa procedura funziona solo se tutti i punti contengono quantità rilevabili di proteine. NOTA: Questo passaggio è necessario confermare che la chinasi è legato alla nitrocellulosa, e che la proteina caricamento è ancora in tutti i punti. Consente inoltre chinasi maculato di essere facilmente tagliato fuori dalla membrana. </li></ol></li><li> Taglio macchie <ol><li> Utilizzando le forbici, tagliare ogni punto sulla membrana di nitrocellulosa. Non è necessario tagliare perfettamente along il bordo della macchia macchiato; se la membrana viene lavata sufficientemente, fondo dovuto al variare dimensioni delle macchie ritagliate sarà trascurabile. E &#39;importante solo per tagliare il posto intero per ogni reazione. </li><li> Utilizzando pinze, trasferire accuratamente ogni punto in fiale di scintillazione. No scintillazione cocktail è necessario in quanto il 32 P è facilmente rilevabile dalla radiazione Cherenkov. NOTA: In alternativa, il punto può essere tagliato utilizzando una sonda di carotaggio affilato. Rimuovere ogni punto dalla nitrocellulosa con la sonda di carotaggio, e spingerla in una fiala di scintillazione con uno spillo. Con questo metodo, la membrana non deve essere toccato, riducendo ulteriormente l&#39;esposizione alle radiazioni. </li></ol></li><li> Determinazione CPM / pmol di [γ- 32 P] -ATP soluzione <ol><li> Spot diverse diluizioni di [γ- 32 P] -ATP soluzione (paragrafo 1.5) sul 1 cm x 1 cm quadrati di nitrocellulosa. asciugare all&#39;aria brevemente. </li><li> Utilizzando pinze, trasferire accuratamente ogni quadrato in scintillazionefiale. No scintillazione cocktail è necessario. Questi campioni saranno utilizzati per generare una curva standard per determinare il CPM / pmol della soluzione ATP. </li></ol></li></ol> 7. il conteggio a scintillazione <ol><li> Caricare tutti fiale di scintillazione in cassette contatore a scintillazione. Inserire le cassette in contatore a scintillazione. </li><li> Eseguire programma di conteggio a scintillazione per misurare CPM per ogni flacone. Questi dati, insieme con il CPM / pmol della miscela ATP radiomarcato (dal punto 6.3), possono essere utilizzati per calcolare la quantità di fosforilata istidina chinasi presente in ogni punto, e quindi la velocità di autofosforilazione. 18,19 </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di legame nitrocellulosa che abbiamo descritto ha molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza per caratterizzare chinasi istidina. Rispetto ai tradizionali SDS / PAGE autoradiografia-based, il nostro metodo è maggiore produttività e meno tempo. La membrana di nitrocellulosa è facile da gestire rispetto gel SDS, e non deve essere fissato. Ponceau macchiare la nitrocellulosa consente per le macchie di proteine ​​per essere visualizzati. Questo fornisce un modo semplice per tagliare ogni spot per i...

risposta adattativa è cruciale per la sopravvivenza dei batteri. Al fine di rilevare e rispondere a cambiamenti ambientali, batteri usano un sistema stimolo-risposta nota come segnalazione bicomponente. 1,2 In un tipico sistema a due componenti, la chinasi istidina rileva uno stimolo affine, autophosphorylates suo residuo istidina conservati, poi trasferisce fosfato ad un residuo aspartato conservati nel dominio ricevente di una proteina regolatore di risposta. 3 Questo evento attiva un cambiamento nell&#39;attività del regolatore di risposta, che stimola un effetto valle. 4,5 Così, i batteri sono in grado di rilevare e adattarsi ai cambiamenti nell&#39;ambiente locale. Alcuni sistemi di segnalazione a due componenti si discostano da questo archetipo. In alcuni casi, il dominio sensoriale della chinasi istidina è una proteina stand-alone, che rileva direttamente l&#39;input sensoriale e modifica attività chinasica attraverso una interazione proteina-proteina. 6-8 Tuttavia, il fondoprocesso amental e il ruolo globale del sistema rimane lo stesso. segnalazione bicomponente è un sistema stimolo-risposta onnipresente che è essenziale per la sopravvivenza dei batteri, e chinasi istidina giocano un ruolo critico nella trasduzione del segnale. 9 Nonostante l&#39;importanza di istidina chinasi alla biologia batterica, rimangono poco caratterizzato. Ciò è dovuto alla instabilità intrinseca di phosphohistidine, e la mancanza di un metodo pratico per misurare autofosforilazione. Phosphohistidine è più labile di Fosfoserina, phosphothreonine, e fosfotirosina. 10 Così, le tecniche che vengono comunemente utilizzati per analizzare chinasi Ser / Thr / Tyr non sono applicabili per chinasi istidina. 11 saggi in vitro per lo studio chinasi istidina sono stati in gran parte limitato a SDS-PAGE autoradiografia. 12,13 In questo metodo, [γ- 32 P] -ATP viene incubata con chinasi, e la fosforilazione della chinasi viene analizzato dal polgel yacrylamide elettroforesi (PAGE) seguita da autoradiografia del gel. Questo metodo può essere usato per monitorare autofosforilazione chinasi, nonché phosphotransfer dalla chinasi ad un regolatore di risposta. Tuttavia, questo metodo ha notevoli carenze. test basato sulla pagina sono bassa produttività e che richiede tempo. Tali limitazioni non sono favorevoli a caratterizzare una proteina e accertare i parametri cinetici. Un metodo alternativo per lo studio chinasi istidina che è stato pubblicato di recente utilizza anticorpi per rilevare phosphohistidine autofosforilazione. 14 Mentre questo metodo ha il vantaggio di distinguere tra 1-phosphohistidine e 3-phosphohistidine, a seconda della strumentazione utilizzata per il rilevamento, questo metodo non può offrire una vasta gamma dinamica o limite superiore alta di rilevamento. Pertanto, vi è la necessità per un saggio rapido, meno faticoso e più sensibile che può essere usato per studiare queste proteine ​​importanti. Qui, descriviamo e demonstrate un saggio di legame nitrocellulosa accuratamente sviluppato che può essere utilizzato per quantificare autofosforilazione di purificati chinasi istidina batteriche in vitro. Questo saggio è un throughput più elevato e meno tempo rispetto test basato sulla pagina. Il metodo utilizza anche la radiazione Cherenkov per phosphohistidine quantificazione, che offre un elevato limite superiore di rilevazione e una vasta gamma dinamica. Il saggio può essere utilizzato per determinare i parametri cinetici per chinasi istidina.

<table><tbody><tr><td>Acido fosforico</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>Per reazioni di quenching e lavaggio nitrocellulosa</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, per tampone di reazione chinasica</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>Per tampone di reazione chinasi</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>Per tampone</td></tr> <tr><td>di reazione chinasiGlicerolo</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>Per tampone di reazione chinasica</td></tr><tr><td>5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Substrato chinasi</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp;</td><td>6.000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>Apparecchio a 96 pozzetti per macchie</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>Per reazioni di spotting</td></tr><tr><td>Nitrocellulosa</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>Per reazioni di spotting</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>Per la colorazione di nitrocellulosa</td></tr></tbody></table>

quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa binding

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Dimostriamo un metodo utile per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Le istidina chinasi sono note per il loro coinvolgimento nella trasduzione del segnale a due componenti, un sistema ubiquitario attraverso il quale i batteri percepiscono e rispondono agli stimoli ambientali. La segnalazione a due componenti è caratterizzata dall'autofosforilazione di un'istidina chinasi, seguita dal fosfotrasferimento al dominio ricevente di una proteina regolatrice della risposta, che alla fine porta a una risposta di uscita. L'autofosforilazione dell'istidina chinasi risponde alla presenza di uno stimolo ambientale affine, fornendo così ai batteri un mezzo per rilevare e rispondere ai cambiamenti nell'ambiente. Nonostante la loro importanza nella biologia batterica, le istidina chinasi rimangono poco conosciute a causa della labilità intrinseca della fosfoistidina. I metodi convenzionali per lo studio di queste proteine, come l'autoradiografia SDS-PAGE, presentano carenze significative. Abbiamo sviluppato un saggio di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per caratterizzare le istidina chinasi. Il protocollo per questo test è semplice e facile da eseguire. Il nostro metodo è più produttivo, richiede meno tempo e offre una gamma dinamica maggiore rispetto all'autoradiografia SDS-PAGE.

<html> Un insieme di dati rappresentativi è stato generato con un&#39;immagine catturata con un imager fosforo (Figura 1), Ponceau S macchia della membrana di nitrocellulosa (Figura 2), e dati di conteggio a scintillazione (Figura 3). La figura 3A mostra le costanti cinetiche degli enzimi in una trama Lineweaver-Burk. Questi risultati sono stati ottenuti utilizzando una chinasi istidina purificata dalla specie gram-negati...

Segnaliamo e dimostriamo un saggio ottimizzato di legame della nitrocellulosa che può essere utilizzato per quantificare l'autofosforilazione delle istidina chinasi batteriche purificate. Il nostro metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche basate su SDS-PAGE, fornendo una valida alternativa per la caratterizzazione di queste importanti proteine.

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare l'autofosforilazione di chinasi istidiniche batteriche purificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione a due componenti, come l'effetto di stimoli specifici sulle interazioni proteina-proteina nell'autofosforilazione delle chinasi istidiniche.I principali vantaggi di questa tecnica sono che si tratta di un metodo ad alto rendimento che può essere utilizzato per rilevare con precisione picomoli di fosfoistidina formati e ottenere parametri cinetici per le chinasi dell'istidina. Durante il mio dottorato, ho utilizzato la filtrazione su membrane di nitrocellulosa per quantificare ligandi radioattivi legati alle proteine. Di conseguenza, è sembrato logico sviluppare una tecnica simile per quantificare la fosforilazione dell'istidina nelle chinasi dell'istidina batteriche.Iniziare questa procedura preparando i reagenti e i materiali come descritto nel protocollo testuale. Per allestire l'apparato per dot-plot a 96 pozzetti, tagliare un pezzo di membrana di nitrocellulosa di otto centimetri per dodici centimetri. Posizionare la nitrocellulosa nell'apparato per dot-plot.Assicurarsi che la membrana sia posizionata correttamente in modo che l'apparecchiatura sia sigillata e tutti i pozzetti siano completamente coperti dalla membrana. Per raccogliere il filtrato, collegare l'apparecchiatura a un secondo pallone laterale. Dal tubo di valvola, collegare un tubo adeguato in modo da poter utilizzare comodamente l'apparecchiatura senza rovesciare il pallone secondario.Quindi, collegare il pallone secondario con braccio laterale a una fonte di vuoto ad aspiratore. Verificare che l'apparato sia completamente sigillato applicando il vuoto all'apparato. Se l'apparato è stato assemblato correttamente, un forte vuoto sarà presente in tutti i pozzetti.Tutti i collegamenti dei tubi possono essere avvolti con pellicola trasparente o Parafilm per garantire una chiusura ermetica. Prima dell'avvio, preparare tutti e quattro i componenti della reazione come soluzioni stock X, come descritto nel protocollo testuale. Mescolare volumi uguali di buffer di reazione, chinasi dell'istidina e acqua doppio distillata.Lasciare che questi componenti della reazione raggiungano l'equilibrio a temperatura ambiente per un breve periodo di tempo. Per avviare la reazione, aggiungere un volume di soluzione di gamma-32 P ATP e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Monitorare il tempo trascorso della reazione con un timer e lasciare procedere la reazione per il tempo desiderato.Interrompere la reazione. Aggiungere un'aliquote della reazione a acido fosforico 325 millimolare. Porre immediatamente le reazioni interrotte sul ghiaccio finché tutte le reazioni non sono state terminate.Posizionare l'apparato preassemblato per dot-plot a 96 pozzetti in un contenitore secondario. Questo contenitore deve essere abbastanza grande da permettere una facile disassemblaggio dell'apparato, poiché l'apparato e la membrana saranno radioattivi dopo l'uso. Applicare un vuoto all'apparato per dot-plot a 96 pozzetti.Una volta che l'apparato è sotto vuoto, pipettare con attenzione la reazione spenta direttamente sul filtro di nitrocellulosa in ciascun pozzetto. Ripetere questo processo fino a quando tutte le reazioni sono state caricate sul filtro. Poiché la capacità di legame della nitrocellulosa è maggiore rispetto alla quantità di chinasi istidinica depositata, si può presumere che quasi tutta la chinasi si leghi al filtro quando viene caricata correttamente.A seconda dell'apparecchiatura utilizzata, prestare attenzione a non forare la nitrocellulosa. Assicurarsi che tutta la reazione sia venuta a contatto con la nitrocellulosa. È facile che parte della reazione aderisca alle pareti del pozzetto.Lavare le pozzette con 100 microlitri di acido fosforico 25 millimolare freddo di ghiaccio. Questo permetterà a qualsiasi volume di reazione che potrebbe essere rimasto intrappolato nella pozzetta di raggiungere la membrana, garantendo un caricamento completo di tutte le reazioni. Lasciare che l'intero volume passi attraverso la membrana.Smontare con attenzione l'apparecchiatura prima di spegnere il vuoto. Si avvisa che in questo momento sia l'apparecchiatura che la membrana di nitrocellulosa sono radioattive. Non rimuovere alcun componente dell'apparecchiatura dal contenitore secondario.Con una pinzetta, trasferire con attenzione la membrana di nitrocellulosa dall'apparecchio a un contenitore contenente circa 200 millilitri di acido fosforico ghiacciato 25 millimolare. Coprire il contenitore, poiché il lavaggio sarà radioattivo. A questo punto, è possibile spegnere il vuoto.Posizionare il contenitore con la membrana di lavaggio su un agitatore. Lasciare agitare dolcemente la membrana per 20 minuti. Trascorsi 20 minuti, versare con attenzione la soluzione di lavaggio usata in un secchio grande da utilizzare per lo stoccaggio temporaneo dei rifiuti.Aggiungere 200 millilitri di acido fosforico 25 millimolare ghiacciato alla membrana. Lavare la membrana in questo modo almeno tre volte per rimuovere il segnale di fondo di gamma-32 P ATP dalla membrana. Dopo il terzo lavaggio, verificare la soluzione di lavaggio utilizzata per rilevare radiazioni mediante un contatore Geiger.Continuare a lavare la membrana fino a quando non è presente alcun segnale nella soluzione di lavaggio. Dopo che la membrana è stata lavata sufficientemente, lasciarla asciugare brevemente all'aria, operazione che richiede tipicamente cinque minuti o meno. Dopo l'esposizione della nitrocellulosa a un colorante verde per il fosforo, come descritto nel protocollo testuale, procedere alla colorazione con Ponceau S e alla decolorazione.Immergere brevemente la membrana di nitrocellulosa nella soluzione di colorante Ponceau S per uno o due minuti. Bagnare completamente l'intera membrana con il colorante prima della decolorazione. Successivamente, eliminare l'eccesso di Ponceau S dalla membrana.Risciacquare la membrana con acqua doppio distillata fino a quando solo le macchie della chinasi dell'istidina risultano colorate. Si noti che questa procedura funzionerà solo se tutte le macchie contengono quantità rilevabili di proteina. Utilizzando delle forbici, ritagliare ogni macchia presente sulla membrana di nitrocellulosa.Non è necessario tagliare perfettamente lungo il bordo della macchia colorata. Se la membrana è stata lavata adeguatamente, lo sfondo dovuto alle dimensioni variabili delle macchie ritagliate è trascurabile. È importante soltanto ritagliare l'intera macchia per ogni reazione.Utilizzando pinzette, trasferire con attenzione ogni spot in vial per scintillazione. Non è necessario alcun cocktail di scintillazione, poiché il fosforo-32 è facilmente rilevabile mediante radiazione Cherenkov. Successivamente, applicare su quadrati di nitrocellulosa di un centimetro per un centimetro diverse diluizioni della soluzione di gamma-32 P ATP.Utilizzando pinzette, trasferire con attenzione ogni quadrato in vial per scintillazione senza aggiungere il cocktail di scintillazione. Questi campioni verranno utilizzati per generare una curva standard per determinare i conteggi al minuto per picomole della soluzione di ATP. Qui è mostrata la colorazione con Ponceau della membrana di nitrocellulosa.La colorazione è uniforme in tutti i campioni, indicando che tutti i campioni sono stati caricati in quantità uguale. I risultati della fluorografia della membrana in nitrocellulosa mostrano il livello relativo di fosfoistidina radioetichettata in ciascun punto. La quarta e l'ottava riga sono controlli negativi che dimostrano come l'eccesso di ATP sia stato rimossa dalla membrana in nitrocellulosa.Di seguito sono mostrati i risultati rappresentativi della quantificazione dell'autofosforilazione della chinasi dell'istidina. Questi dati sono ottenuti dal conteggio di scintillazione di ogni spot ritagliato dalla membrana. La curva standard di conteggi al minuto per picomole di ATP, mostrata qui, è anch'essa ottenuta dal conteggio di scintillazione ed è utilizzata per calcolare le picomoli di fosfoistidina presenti in ciascun campione.Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'introduzione di stimoli cognati o proteine che si ipotizza modulino l'attività delle chinasi, possono essere aggiunti all'esperimento per rispondere a ulteriori domande, ad esempio l'effetto di questi additivi sull'attività delle chinasi. Non dimenticare che lavorare con sostanze radioattive può essere estremamente pericoloso. Precauzioni come un'adeguata formazione sulla sicurezza radiologica e l'uso di dispositivi di protezione individuale e schermature devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

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Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

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Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

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