Name: Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri il metodo di PCR bloccante wild-type con sequenziamento diretto per rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza nel gene myd88. Questa tecnica offre alta sensibilità per campioni di midollo osseo.

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Etica Dichiarazione: Tutti i test di campioni umani è stata eseguita dopo aver ottenuto l&#39;approvazione Institutional Review Board (IRB). 1. Estrazione del DNA da FFPE tessuto, sangue periferico, e aspirato midollare <ol><li> Per midollo osseo tessuto FFPE con kit di estrazione del DNA FFPE <ol><li> Iniziare con FFPE tessuto dai vetrini non colorati (5 - 10 sezioni: 5 - 10 um di spessore). NOTA: Se inizio con trucioli di tessuto, usare 3 - 6 sezioni a 5 - 10 micron di spessore e passare al punto 1.1.6. </li><li> Posizionare i vetrini in un cestino scivolo e preparare quattro serbatoi di lavaggio (due per xilene e due per il 100% alcol). Aggiungere un volume minimo di 600 mL di soluzione per ciascun cestello. </li><li> Deparaffinare i vetrini effettuando un lavaggio xilene 5 min in prima vaschetta. Trasferire i vetrini al secondo serbatoio di lavaggio xilene per altri 5 minuti. </li><li> Dopo deparaffinazione, lavare i vetrini con 100% di alcol per 5 min. Trasferire i vetrini al secondoSerbatoio lavaggio alcool per altri 5 minuti. </li><li> Lasciare le diapositive asciugare completamente sotto cappa prima raschiando con una lama di rasoio in una provetta. NOTA: Se uno scivolo H &amp; E con regione tumorale indicato è disponibile, per allineare le diapositive e raschiare solo la regione tumore. </li><li> Procedere con le istruzioni dal produttore volantino inclusi nel kit. </li></ol></li><li> Per BM aspirare e sangue periferico <ol><li> Estrarre secondo le istruzioni dispensa del produttore con queste specifiche. NOTA: Ci sono numerosi kit e metodi di estrazione del DNA da tessuti e cellule FFPE disponibili in commercio. Praticamente, tutti possono essere utilizzati. Utilizzare un metodo che viene stabilito in laboratorio. <ol><li> Utilizzare 200 microlitri di sangue periferico (PB) o 100 microlitri BM + 100 microlitri di PBS. </li><li> Utilizzare 4 microlitri RNasi una soluzione di riserva. </li><li> Eluire con 100 microlitri di tampone di eluizione. </li></ol></li></ol></li><li> La quantificazione del DNA<ol><li> Misurare concentrazioni di DNA utilizzando uno spettrofotometro garantire un / 280 nm 260 nm rapporto di circa 1,8 (per DNA puro). Se il rapporto è sensibilmente inferiore, esso può indicare la presenza di proteine, fenolo, o altri contaminanti che possono interferire con le applicazioni a valle. </li><li> Regolare concentrazioni di DNA a circa 50 - 100 ng / ml con tampone di eluizione appropriato. </li></ol></li></ol> 2. wild-type di blocco PCR <ol><li> Progettazione Primer <ol><li> Progettazione e ottenere primer per i geni di interesse in base alla precedenza descritte le linee guida generali della PCR Primer progettazione 13. Includi M13-forward e reverse primer di sequenziamento universali di primer PCR. NOTA: Il saggio MYD88 è stato sviluppato per amplificare esone 5 di MYD88 (G259 - N291) e 110 nucleotidi si trova nella regione 5&#39; intronic per coprire il sito di splice e parte di introne 4. L&#39;avanti e retromarcia primer sono stati progettati con un 5&#39; -M13 sequenza (M13-forward: TGT aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverse: CAG GAA GCT aca ATG acc) per consentire appaiamento dei primer sequenziamento complementari (vedi Materiali Tabella). </li></ol></li><li> Locked Nucleic Acid oligonucleotidi design <ol><li> Progettare l&#39;oligonucleotide blocco per essere di circa 10 - 15 basi di lunghezza e complementare al modello WT in cui si desidera arricchimento mutante. NOTA: Un oligo più breve migliorerà la discriminazione non corrispondente. Per raggiungere alta specificità di destinazione, è importante non usare troppo nucleotidi che bloccano dal momento che questo può comportare un oligonucleotide molto &quot;appiccicoso&quot;. Il contenuto e la lunghezza e bloccando nucleotidica dovrebbe essere ottimizzare secondo nucleotide specifico che deve essere bloccato. È importante per ottenere un&#39;elevata specificità di legame senza compromettere la struttura secondaria e rischiare auto-complementarità. </li><li> Progettare l&#39;oligo di blocco per avere un T m 10 - 15 ° C sopra la temperat estensioneUre durante il ciclo termico. Regolare la T m aggiungendo o rimuovendo basi bloccanti o sostituendo basi blocco per DNA evitando tratti lunghi (3 - 4 basi) di blocco basi G e C. <ol><li> Accedere al sito web strumenti di oligo (vedi Tabella dei Materiali) e selezionare la funzione &quot;blocco Oligo Tm Prediction&quot;. </li><li> Incollare la sequenza del modello WT che si desidera bloccare nella casella &quot;Oligo Sequenza&quot;. Aggiungere &quot;+&quot; davanti basi per indicare le basi bloccanti. </li><li> Selezionare il pulsante &quot;Calcola&quot; per determinare l&#39;approssimativa T m dell&#39;ibrido DNA-Blocker. </li></ol></li><li> Progettare l&#39;oligo di bloccaggio per evitare la formazione di strutture secondarie o auto-dimeri. <ol><li> Accedere al sito web strumenti di oligo (vedi Tabella dei Materiali) e selezionare la funzione &quot;blocco Oligo Optimizer&quot;. </li><li> Incollare la sequenza del modello WT che si desidera essere bloccato in area. Aggiungere &quot;+&quot; davanti basi per indicare il blocco basi. </li><li> Selezionare le due caselle per &quot;struttura secondaria&quot; e &quot;Self Only&quot;. Premere il pulsante Analizzare di valutare l&#39;oligo di strutture secondarie potenzialmente problematici o auto-dimeri. NOTA: I punteggi rappresentano stime molto approssimative del T m &#39;s delle strutture secondarie e auto-dimeri. punteggi più bassi sono quindi ottimali e possono essere raggiunti limitando bloccante-bloccante accoppiamento. L&#39;oligonucleotide blocco per MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] è stato progettato per coprire aminoacidi Q262-I266 e dispone di una 3&#39;-invertita dT di inibire sia l&#39;estensione dalla DNA polimerasi e degradazione 3&#39;-esonucleasi. Questo specifico oligo di blocco è un 17mer con 10 basi di blocco che sono indicati come &quot;+ N&quot;. I restanti 7 basi sono normali nucleotidi del DNA. </li></ol></li></ol></li><li> Setup WTB-PCR e termocicli <ol><li> Preparare una WTB-PCR Master mix (MMX) con 2,5 ml PCR tampone di reazione 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 mM dNTP, 0,2 uM avanti e indietro primer 1,2 pM MYD88blocker e DNAsi, RNasi-free, ultra-pura H 2 O per creare una finale volume della soluzione di 21.75 microlitri per reazione. NOTA: Lavorare concentrazioni sono per il volume di reazione finale di 25 ml (dopo l&#39;aggiunta del modello di DNA e polimerasi). PCR convenzionale MMX viene preparata semplicemente omettendo l&#39;aggiunta del bloccante. Tutte le fasi del protocollo rimangono identiche sia WTB e PCR convenzionale. Questo può essere utilizzato in convalida e arricchimento determinare ottenuto con l&#39;aggiunta di bloccante. <ol><li> Nel calcolare la quantità di MMX per preparare assicurarsi per tenere conto di 3 reazioni supplementari (controlli positivi e negativi e un controllo non-template per controllare contaminazione) e almeno 1 reazione aggiuntivo per errori di pipettamento. </li></ol></li><li> Vortex MMX accuratamente. Il MMX può essere conservato a -80 ° C fino a ayorecchio. </li><li> Aggiungere 0,25 ml di Taq DNA polimerasi per reazione alla MMX e miscelare. Una volta che la polimerasi è stato aggiunto al MMX, tenerlo in ghiaccio. </li><li> Mettere un nuovo 96 pozzetti PCR su un piatto freddo e pipettare 22 ml di MMX con polimerasi a ciascun pozzetto di reazione. </li><li> Aggiungere 3 ml di DNA genomico (50 - 100 ng / ml a ciascuno dei pozzetti contenenti il ​​MMX con polimerasi. </li><li> Sigillare la piastra e centrifugare brevemente per assicurare la soluzione raggiunge il fondo di ciascun pozzetto. </li><li> Caricare la piastra PCR su un termociclatore. <ol><li> Impostare le condizioni per la reazione termociclaggio WTB-PCR come segue: denaturazione iniziale a 95 ° C per 6 min; 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, Primer ricottura a 56 ° C per 30 s, e estensione a 72 ° C per 1 min 20 s; estensione finale a 72 ° C per 10 min. NOTA: Le migliori pratiche coinvolge completando il resto del protocollo in una zona fisicamente separati per evitare la contaminazione da amplicon in configurazioni future. </li></ol></li></ol></li><li> Eseguire elettroforesi su gel secondo protocolli precedentemente descritte 14 per determinare se WTB-PCR ha avuto successo e confermare una mancanza di amplificazione nel controllo non-template. </li><li> Purificazione di PCR Prodotto da sfere magnetiche <ol><li> Rimuovere sfere magnetiche da 4 ° C e portare a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire 10 ml di prodotto PCR per una nuova piastra PCR. </li><li> Vortex le perline magnetiche vigorosamente per risospendere completamente le particelle magnetiche. </li><li> Aggiungere 18 ml sfere magnetiche ad ogni bene sulla nuova piastra. Pipetta mescolare 10 volte. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Posizionare la piastra PCR sulla piastra magnete laterale skirted per 2 minuti a perline separati dalla soluzione. </li><li> Aspirare il surnatante con una pipetta multicanale, evitando il pellet tallone. </li><li> Versare 150 ml di etanolo 70% in ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente for almeno 30 s. Aspirare l&#39;etanolo con una pipetta multicanale e scartare punte. Ripetere questa procedura di lavaggio una volta di più. </li><li> Utilizzando un 20 microlitri pipetta multicanale aspirare l&#39;etanolo restante da ciascun pozzetto e scartare punte. </li><li> Una volta che i pozzi sono asciutti (~ 10 min), togliere dal piatto magnete e aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi ad ogni mix bene e pipetta 15 volte o vortice delicatamente. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Posizionare la piastra PCR sulla piastra calamita per 1 min per perline separati dalla soluzione. </li><li> Trasferimento 35 ml di prodotto purificato ad una nuova piastra PCR. Ciò è prodotto di PCR purificato è pronto per procedere con sequenziamento bidirezionale o può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Quando si sviluppa un nuovo test, la quantificazione del prodotto purificato della PCR può essere richiesto. 1 - 3 ng / ml amplicon DNA è ottimale per il sequenziamento bidirezionale. Se la concentrazione è sempre bassa, aumentare la PCR prodotti e magnetici perline proportionally (1: 1,8). Se la concentrazione è elevata e costante, eluire con un maggior volume di acqua. </li></ol></li></ol> 3. Il sequenziamento del WTB-PCR prodotto <ol><li> Bi-direzionale Sequencing NOTA: Il seguente protocollo è una forma modificata di istruzioni del produttore, che è stato ottimizzato per utilizzare un minor numero di reagenti. <ol><li> Preparare in avanti e all&#39;indietro reazione di sequenziamento si mescola con 0,25 ml Ready Mix di reazione, 1,88 ml Sequencing Buffer, 1,78 mM M13-F o M13-R primer di sequenziamento e aggiungere e DNAsi, RNasi-free, ultra-pura H 2 O per creare una soluzione definitiva volume di 9 microlitri per reazione. Questo mix reazione di sequenziamento può essere conservato a -20 ° C per un massimo di un anno. </li><li> Pipettare 9 ml della miscela di reazione di sequenziamento in avanti in ciascun pozzetto di una nuova piastra da 96 pozzetti PCR per la reazione di sequenziamento in avanti. Ripetere su un piatto a parte per la reazione di sequenziamento inverso. </li><li> Aggiungere 1 ml di purificato WTB-PCR t prodottoo ciascun pozzetto sia avanti e retromarcia piastre. </li><li> Sigillare la piastra e centrifugare brevemente per assicurare la soluzione raggiunge il fondo di ciascun pozzetto. </li><li> Caricare la piastra PCR su un termociclatore. <ol><li> Impostare le condizioni termociclaggio per la reazione di sequenziamento come segue: 96 ° C per 1 min; 30 cicli di 96 ° C per 10 s, 50 ° C per 5 s, 60 ° C per 4 minuti; tenere a 4 ° C fino al momento per la purificazione. </li></ol></li></ol></li><li> Purificare Sequencing Products <ol><li> Preparare una soluzione fresca 01:25 di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e il 100% di etanolo. </li><li> Preparare una soluzione fresca di etanolo al 70%. </li><li> Aggiungere 30 ml di acetato di sodio / 100% soluzione etanolica a ciascun pozzetto di entrambi avanti e retromarcia piastre sequenziamento e mix pipetta 5 volte. </li><li> Risigillare la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Centrifugare la piastra a 2.250 xg per 15 min. </li><li> Rimuovere la pellicola sigillante e capovolgere sopra uno sprecocontenitore. NOTA: Inverti solo una volta o il pellet potrebbe allentarsi dal fondo bene. </li><li> Posizionare la piastra capovolta su un tovagliolo di carta pulito e centrifugare a 150 xg per 1 min. </li><li> Aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto. </li><li> Richiudere la piastra e far girare a 2.250 xg per 5 min. </li><li> Ripetere i punti 3.2.6 e 3.2.7. </li><li> Se i pozzi non sono completamente asciutti, lasciare asciugare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni sono protetti dalla luce durante l&#39;asciugatura. </li><li> Aggiungere 10 microlitri formammide in ciascun pozzetto e pipetta mix 10 volte. Sigillare il piatto. </li><li> Denaturare il termociclatore a 95 ° C per 3 min seguito da 4 ° C per 5 min. </li><li> Dopo denaturazione, sostituire il sigillante piatto con un setti e la sequenza sulla piattaforma di sequenziamento secondo le istruzioni del produttore 15. </li></ol></li></ol> 4. Analisi dei risultati di sequenziamento <ol><li> Visualizzare le tracce di sequenziamento utilizzando un sequenziamento datun software di analisi secondo le istruzioni del produttore 16 e allineare le rispettive sequenze di riferimento. Allineare MYD88 di sequenza di riferimento NCBI &quot;NM_002468&quot;. </li></ol>

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<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio WTB-PCR qui descritto utilizza una serie generica di primer con un oligo blocco progettato per bloccare l&#39;amplificazione di DNA WT durante l&#39;estensione (Figura 1). Il prodotto di WTB-PCR viene quindi sequenziato per l&#39;analisi mutazionale. L&#39;utilità di WTB-PCR / Sanger risiede nella sua semplicità, ad alta sensibilità e alta produttività. Utilizzando le indicazioni descritte qui, la maggior parte dei saggi basati Sanger esistenti possono essere facilmente modificati tramite l&#3...

Sanger sequenziamento è stato tradizionalmente il gold standard in fase di test per entrambi noti e sconosciuti mutazioni somatiche. Uno dei limiti di sequenziamento Sanger è il suo limite di rilevabilità (~ 10 - 20% allele mutante in un contesto di WT) 1. Questo livello di sensibilità è appropriato per rivelare mutazioni somatiche basso livello che possono essere presenti nei campioni di tessuti precancerose o pazienti con poche cellule tumorali circolanti, o quando midollo osseo (BM) è irregolare. Questo rende anche valutare malattia residua dopo la terapia o la rilevazione di mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia difficile mediante sequenziamento convenzionale solo 2. Sostituendo PCR convenzionale con acido nucleico bloccato (LNA) mediata wild-type blocco PCR (WTB-PCR) in Sanger sequenziamento, sensibilità fino allo 0,1% allele mutante in uno sfondo di WT può essere raggiunto 2, 3, 4. InWTB-PCR, arricchimento per alleli mutanti è ottenuta tramite l&#39;aggiunta di una breve (~ 10 - 14 NT) blocco (LNA) oligonucleotide che si lega preferenzialmente WT DNA impedendo così l&#39;amplificazione del DNA WT. Il prodotto WTB-PCR arricchito mutante può quindi essere sequenziato. Bloccando WT DNA piuttosto che selezionare per mutazioni specifiche WTB-PCR permette l&#39;arricchimento di entrambe le mutazioni conosciute e non presenti nelle frazioni cellulari minute. Più metodi attualmente utilizzati per la rilevazione di mutazioni in piccole celle frazioni. Questo include PCR, amplificazione refrattaria sistema allele-specifica mutazione (ARMS), denaturazione cromatografia liquida ad alta prestazione (DHPLC), perline, emulsioni, amplificazione, e magnetismo (raggiante), rilascio indotta dal campo elettrico e misura (Efirm), alta risoluzione punto di fusione e altri. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono limitati dai falsi positivi e la capacità di rilevare solo una mutazione che il test è stato progettato per 4 </sup&gt;. WTB-PCR, tuttavia, consente all&#39;utente di visualizzare tracce di sequenziamento che consente il rilevamento di diversi tipi di mutazione e può aiutare a escludere falsi positivi dovuti ad artefatti o eventi deaminazione. sequenziamento di prossima generazione (NGS) può offrire una valida alternativa al sequenziamento convenzionale, tuttavia, sostanzialmente maggiori costi, complessità e tempo saggio più rendono un&#39;opzione inutile per molti tipi di malattie con poche marcatori molecolari distinti o per il monitoraggio di pazienti in terapia per emergenti mutazioni di resistenza. Inoltre, elevati tassi di falsi positivi al rilevamento varianti con frequenze alleliche mutanti inferiori al 5% possono rappresentare un problema per NGS ampliconi basati 5, 6. Qui mostriamo l&#39;aumento della sensibilità raggiunto da WTB-PCR in screening per mutazioni nel differenziamento mieloide fattore di 88 geni come descritto da Albitar et al. 3 MYD88 mutations sono importanti fattori diagnostici e prognostici in Macroglobulinemia di Waldenström (WM), IgM gammopatia monoclonale di significato sconosciuto (IgM MGUS), della milza linfoma della zona marginale (SMZL), e linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL). mutazioni MYD88 si trovano in quasi tutti i casi di WM e circa il 50% dei pazienti con immunoglobuline M (IgM) -secernenti MGUS. Contrastingly, mutazioni MyD88 si trovano solo 0-6% dei pazienti con SMZL e sono assenti nel mieloma multiplo 7, 8. Poiché morfologica sovrapposte, immunofenotipica, citogenetica, e caratteristiche cliniche tra WM e SMZL o mieloma multiplo IgM spesso può complicare diagnosi differenziale, la presenza di una mutazione MYD88 può servire come un fattore che identifica utile 9. Mutazioni MYD88 sono stati associati con una maggiore carico di malattia nei pazienti con DLBCL e la scarsa sopravvivenza globale dopo la terapia 7, </sup&gt; 10. Inoltre, poiché le mutazioni MYD88 sono più frequentemente trovati in attivo (ABC) DLBCL B-cell-like di centro germinale B-cell-like (GCB) DLBCL o linfoma primario del mediastino cellule B (PMBL), MYD88 stato mutazionale può servire come marker surrogato per il sottotipo ABC 11, 12. Il protocollo dettagliato qui fornito serve come modello da cui nuovi saggi possono essere sviluppati o maggior saggi sequenziamento esistenti possono essere facilmente adattati per rilevare accuratamente mutazioni a bassa frequenza in vari tipi di campioni. L&#39;approccio può essere utilizzato anche per monitorare e rilevare mutazioni resistenti che possono svilupparsi nei tumori o anche batteri che possono svilupparsi mentre i pazienti sono stati trattati con la terapia mirata o antibiotici. Inoltre, si rivolge e rimedi molti dei problemi connessi con l&#39;arricchimento di mutazione, in particolare nel tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE).

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock da 1,5 o 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% alcol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Grado istologico; 91,5% etanolo, 5% alcol isopropilico, 4,5% alcol metilico</td></tr><tr><td>3730XL sequenziatore</td><td>ABI</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Per la purificazione PCR a biglie magnetiche</td></tr><tr><td>Alluminio lamine sigillanti</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Per PCR e celle frigorifere</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit di sequenziamento del ciclo</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Per il sequenziamento bidirezionale. Con centrifuga tampone per sequenziamento</td></tr><tr><td>5804 Series</td><td>Rotore Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP (per piastra PCR)</td></tr><tr><td>Piastra fredda per piastre a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-free, acqua</td><td></td><td></td><td></td>ultrapura</tr><tr><td>dNTP (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Magnete con gonna laterale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Per l'uso nella purificazione PCR.</td></tr><tr><td>Etanolo Assoluto&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Sito web Exiqon Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polimerasi (5 U/&micro; L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>Con tampone di reazione PCR concentrato 10x, con 20 mM di MgCl2</td></tr><tr><td>Gel elettroforesi</td><td></td><td></td> gel di <td>agarosio al 2%</td></tr><tr><td>Kit di estrazione FFPE GeneRead DNA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Contiene uracile DNA glicosilasi necessaria per ridurre gli artefatti di sequenziamento</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>Per il sequenziamento.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = basi LNA)</td></tr><tr><td>M13-F Primer di sequenziamento</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Primer di sequenziamento</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga Modello 5430</td><td>Rotore Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 (per provette per microcentrifuga da 1,5/2 mL)</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific PCR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>primer diretto</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TT GAT GGR</td></tr><tr><td>PCR REVERSE PRIMER</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR piastre</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatori</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1.000 & micro; L</td></tr><tr><td>Setti per piastre, 96 pozzetti</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Per aspirato BM e sangue periferico</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Per analisi di sequenziamento</td></tr><tr><td>Cestello</td><td></td><td></td><td></td>per vetrini</tr><tr><td>Acetato di sodio (3 M, pH 5,2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr>Puntali <td></td><td></td><td>per pipette sterili con filtro</td><td>20, 200, 1.000 & micro; L</td></tr><tr><td>Thermomixer C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td></td><td></td> di lavaggio<td>~ 1.000 mL</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Grado istologico</td></tr></tbody></table>

wild-type blocco pcr combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

rilevazione accurata identificazione di mutazioni a bassa frequenza possono essere problematico nel valutare malattia residua dopo la terapia, screening per mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia, o quando i pazienti hanno poche cellule tumorali circolanti. Wild-type blocco PCR seguita da analisi di sequenziamento offre alta sensibilità, flessibilità e semplicità come una metodologia per individuare queste mutazioni a bassa frequenza. Con l&#39;aggiunta di un costume disegnato bloccato oligonucleotide acido nucleico ad una nuova o precedentemente stabilito saggio di sequenziamento PCR convenzionale, sensibilità di circa 1 allele mutante in un fondo di 1.000 alleli WT possono essere raggiunti (1: 1.000). artefatti sequenziamento associati ad eventi deaminazione trovano comunemente nei tessuti paraffina fissate in formalina può essere parzialmente ovviato dall&#39;utilizzo di uracile glicosilasi DNA durante fasi di estrazione. Il protocollo ottimizzato qui è specifico per la rilevazione MYD88 mutazione, ma può servire come modello per la progettazione di qualsiasisaggio di WTB-PCR. Vantaggi del test WTB-PCR su altri saggi comunemente utilizzati per la rivelazione di mutazioni a bassa frequenza incluse allele specifico PCR e real-time PCR quantitativa comprendono meno occorrenze di falsi positivi, una maggiore flessibilità e facilità di implementazione, e la capacità di rilevare sia noto e mutazioni sconosciute.

Una panoramica concettuale di WTB-PCR durante l&#39;estensione è presentato in Figura 1. Poiché un singolo nucleotide disadattamento nell&#39;ibrido bloccante-DNA diminuisce notevolmente la sua temperatura di fusione (AT m = 20 - 30 ° C), amplificazione dell&#39;allele WT è bloccato mentre DNA stampo mutante è libero di completare l&#39;estensione 17. In questo modo, il DNA mutante è amplificato esponenzialmente mentre WT DNA viene ampl...

La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni. Questa metodologia può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei test sulle mutazioni somatiche facilitando il rilevamento di mutazioni con frequenza molto bassa. In questo caso, cercheremo mutazioni nel gene myd88 in campioni di midollo osseo.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce informazioni altamente accurate e sensibili sulla presenza di mutazioni somatiche, anche con un numero molto ridotto di cellule neoplastiche. Questo saggio di sequenziamento basato su PCR con blocco del tipo selvaggio è stato sviluppato per amplificare una parte dell'esone cinque del gene myd88, garantendo la copertura del sito caldo L265. I primer diretto e inverso sono stati progettati con una sequenza M13 in posizione cinque primaria per consentire l'uso di primer di sequenziamento complementari.Progettare l'oligonucleotide di blocco in modo che abbia una lunghezza di circa 10-15 basi ed sia complementare al template di tipo selvaggio nel punto in cui si desidera un arricchimento del mutante. Un oligonucleotide più corto migliorerà la discriminazione degli appaiamenti non corretti. Per ottenere un'elevata specificità del bersaglio, è importante non utilizzare una quantità eccessiva di nucleotidi di blocco, poiché ciò renderebbe gli oligonucleotidi eccessivamente stabili.Per progettare l'oligonucleotide di blocco, iniziare accedendo al sito web Oligo Tools. Selezionare lo strumento di previsione della temperatura di melting (Oligo TM). Si aprirà una nuova finestra.Incollare la sequenza del template di tipo selvaggio da bloccare nella casella della sequenza dell'oligo. Aggiungere un segno più davanti alle basi del bloccatore per identificarle. Fare clic sul pulsante di calcolo per determinare la TM approssimativa dell'ibrido del bloccatore di DNA.Le temperature di fusione calcolate verranno visualizzate nelle caselle sottostanti. Progettare l'oligonucleotide di blocco in modo che abbia una temperatura di fusione di 10-15 gradi Celsius superiore alla temperatura di estensione durante la termociclia. In questo caso, la temperatura di estensione è di 72 gradi Celsius.Per regolare la temperatura di fusione, aggiungere, rimuovere o sostituire le basi bloccanti. Evitare tratti lunghi di tre o quattro basi bloccanti C o G. Successivamente, per evitare la formazione di strutture secondarie o la dimerizzazione spontanea, tornare alla schermata iniziale del sito web Oligo Tools e selezionare lo strumento Oligo Optimizer.Si aprirà una nuova finestra. Incollare la sequenza del template di tipo selvaggio da bloccare nella casella. Aggiungere un segno più per indicare le basi da bloccare.Selezionare le due caselle per la struttura secondaria e solo self, quindi premere il pulsante analizza per visualizzare i punteggi per l'ibridazione e la struttura secondaria. Questi punteggi rappresentano stime molto approssimative delle temperature di fusione dei dimeri self e delle strutture secondarie, rispettivamente. I punteggi più bassi sono ottimali e possono essere ottenuti limitando l'appaiamento tra i blocchi di blocco.Rimuovere o riposizionare i nucleotidi bloccanti al fine di ottenere punteggi più bassi. L'oligonucleotide bloccante ottimizzato per myd88 mostrato qui raggiunge un equilibrio tra la temperatura di fusione dell'ibrido del bloccante a DNA e punteggi di ibridazione e di struttura secondaria sufficientemente bassi. È stato progettato per coprire gli amminoacidi Q262 fino a I266 e presenta un DT invertito in posizione tre prime per inibire sia l'estensione da parte della DNA polimerasi che la degradazione da parte della esonucleasi tre prime.Dopo aver progettato i primer, impostare la PCR di blocco del tipo selvaggio ed eseguire il termociclaggio come descritto nel documento allegato. Rimuovere le perle magnetiche dallo stoccaggio a quattro gradi Celsius e portarle a temperatura ambiente. Trasferire 10 microlitri del prodotto PCR in una nuova piastra PCR.Vortexare energicamente le perle magnetiche per risospendere completamente le particelle magnetiche, quindi aggiungere 18 microlitri di perle magnetiche in ogni pozzetto della nuova piastra. Pipettare su e gi&ugrave; 10 volte per mescolare. Incubare quindi la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.Dopo l'incubazione, posizionare la piastra PCR sul magnete con bordo laterale per due minuti al fine di separare le perle dalla soluzione. Utilizzare una pipetta multicanale per aspirare il soprannatante. Avere cura di evitare il pellet di perle.Successivamente, distribuire 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 30 secondi. Quindi aspirare l'etanolo con una pipetta multicanale e smaltire i puntali. Ripetere questa procedura di lavaggio un'altra volta.Utilizzando una pipetta multicanale da 20 microlitri, aspirare l'etanolo rimanente da ogni pozzetto e smaltire i puntali. Dopo aver lasciato asciugare i pozzetti della piastra per circa 10 minuti, rimuoverla dal magnete e aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi in ogni pozzetto. Pipettare su e giù per 15 volte per mescolare.Quindi, incubare a temperatura ambiente per due minuti. Dopo l'incubazione, posizionare nuovamente la piastra PCR sulla piastra magnetica per un minuto al fine di separare le perle dalla soluzione. Trasferire 35 microlitri del prodotto purificato in una nuova piastra PCR ed eseguire il sequenziamento bidirezionale come descritto nel documento allegato.Dopo aver eseguito il sequenziamento bidirezionale, per purificare i prodotti del sequenziamento preparare una soluzione fresca al 25% di acetato di sodio tre molare a pH 5,2 e alcol etilico al 100%. Preparare inoltre una soluzione fresca di alcol etilico al 70%. In ogni pozzetto delle piastre per il sequenziamento diretto e inverso aggiungere 30 microlitri di acetato di sodio in alcol etilico al 100% ed eseguire cinque aspirazioni e dispense con la pipetta per mescolare.Quindi sigillare nuovamente la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Trascorsi 20 minuti, centrifugare la piastra a 2.250 ×g per 15 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il sigillo della piastra e capovolgere una volta la piastra sopra un contenitore per rifiuti.Se la piastra viene capovolta più volte, i pellet potrebbero staccarsi dai fondi delle pozzette. Posizionare la piastra capovolta su un tovagliolo di carta pulito e centrifugare a 150 ×g per un minuto. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetta e sigillare nuovamente la piastra.Centrifugare a 2.250 ×g per cinque minuti. Quindi ripetere il processo di rimozione del sigillante della piastra e di capovolgimento della piastra. Se le pozzette non sono completamente asciutte, lasciarle asciugare all'aria a temperatura ambiente.Assicurarsi che i campioni siano protetti dalla luce. Una volta che le pozzette sono completamente asciutte, aggiungere 10 microlitri di formammide in ciascuna pozzetta e aspirare e rilasciare 10 volte per mescolare. Richiudere ermeticamente la piastra.Denaturare utilizzando un termociclatore a 95 gradi Celsius per tre minuti, seguiti da cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la denaturazione, sostituire il sigillo della piastra con un setto e procedere al sequenziamento su una piattaforma di sequenziamento seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzando un software di analisi delle sequenze, visualizzare i tracciati e allineare le sequenze alle sequenze di riferimento appropriate.Allineare myd88 alla sequenza di riferimento NCBI NM002468. Il DNA genomico proveniente da pazienti con e senza mutazioni è stato sottoposto sia a PCR convenzionale che a PCR con blocco del tipo selvaggio, e i prodotti di PCR risultanti sono stati quindi sequenziati. Come si può osservare qui, l'allele mutato è risultato arricchito quando è stata eseguita la PCR con blocco del tipo selvaggio, e non sono stati osservati falsi positivi nel DNA di tipo selvaggio.Un calo caratteristico dell'intensità del segnale, come mostrato qui, si osserva spesso quando viene utilizzata una concentrazione eccessiva di bloccante o quando la purificazione post PCR non è riuscita a rimuovere il bloccante prima del sequenziamento bidirezionale. Questo si verifica quando la purificazione enzimatica viene eseguita al posto della purificazione con perle magnetiche. Qualsiasi saggio basato sulla PCR che arricchisca gli alleli mutanti rileverà artefatti a bassa frequenza.Questi tracciati mostrano un aumento degli artefatti di sequenziamento CG rispetto agli artefatti TA nei tessuti FFPE quando la citosina o la citosina metilata vengono deaminate tramite fissazione formale in uracile o tiamina, rispettivamente. L'uracile DNA glicosilasi o UDG può escindere l'uracile prima della PCR di blocco del tipo selvatico, contribuendo a ridurre gli artefatti di sequenziamento. Tuttavia, la tiamina risultante dalla deaminazione della cinque metil citosina, che si verifica frequentemente nelle isole CPG, non può essere escissa dall'UDG.La riduzione della concentrazione del bloccante utilizzata nella PCR di blocco del tipo selvaggio può contribuire a diminuire l'insorgenza di artefatti di sequenziamento che non vengono corretti dal trattamento con UDG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come testare le mutazioni somatiche con un elevato grado di accuratezza e sensibilità, utilizzando la tecnica di blocco del tipo selvaggio. Il principio di questa tecnologia può essere applicato al rilevamento di mutazioni in piccole sottopopolazioni cellulari.Pertanto, è utile nel rilevamento della malattia residua minima, nel monitoraggio dei pazienti e nella predizione della recidiva precoce in pazienti con vari neoplasmi.

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Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche (Video) | JoVE Journal

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