Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni. Questa metodologia può aiutare a rispondere a domande chiave nei test di mutazione somatica, facilitando l'individuazione di mutazioni a frequenza molto bassa. Qui cercheremo mutazioni nel gene myd88 in campioni di midollo osseo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni altamente accurate e sensibili sulla presenza di mutazioni somatiche, anche con pochissime cellule neoplastiche. Questo saggio di sequenziamento basato sulla PCR con blocco wild type è stato sviluppato per amplificare parte dell'esone cinque nel gene myd88, garantendo la copertura dell'hotspot L265. I primer in avanti e all'indietro sono stati progettati con una sequenza M13 a cinque prime per consentire l'inginocchiamento dei primer di sequenziamento complementari.

Progettare l'oligonucleotide bloccante in modo che sia lungo circa 10-15 basi e complementare al modello di tipo selvatico in cui si desidera l'arricchimento mutante. Un oligo più corto migliorerà la discriminazione del mismatch. Per ottenere un'elevata specificità del bersaglio è importante non utilizzare troppo nucleotidi bloccanti, poiché ciò si tradurrà in oligonucleotidi molto appiccicosi.

Per progettare l'oligonucleotide bloccante, inizia navigando sul sito Web di Oligo Tools. Seleziona lo strumento di previsione Oligo TM. Si aprirà una nuova finestra.

Incolla la sequenza del modello wild type da bloccare nella casella della sequenza oligo. Aggiungi un segno più davanti alle basi del blocco per contrassegnarle. Fare clic sul pulsante Calcola per determinare la TM approssimativa dell'ibrido bloccante del DNA.

Le temperature di fusione calcolate appariranno nelle caselle sottostanti. Progettare l'oligo bloccante in modo che abbia una temperatura di fusione da 10 a 15 gradi Celsius al di sopra della temperatura di estensione durante il ciclo termico. Qui, la temperatura di estensione è di 72 gradi Celsius.

Per regolare la temperatura di fusione, aggiungere, rimuovere o sostituire le basi di blocco. Evitare lunghi tratti di tre o quattro basi C o G bloccanti. Successivamente, per evitare la formazione di strutture secondarie o l'auto-dimerizzazione, torna alla schermata iniziale del sito Web di Oligo Tools e seleziona lo strumento Oligo Optimizer.

Si aprirà una nuova finestra. Incolla la sequenza del modello di tipo jolly da bloccare nella casella. Aggiungi un segno più per indicare le basi di blocco.

Seleziona le due caselle per la struttura secondaria e solo per te stesso e premi il pulsante di analisi per vedere i punteggi per l'ibridazione e la struttura secondaria. Questi punteggi rappresentano stime molto approssimative delle temperature di fusione rispettivamente dei self dimeri e delle strutture secondarie. I punteggi più bassi sono ottimali e possono essere ottenuti limitando l'accoppiamento dei bloccanti.

Rimuovere o riposizionare i nucleotidi bloccanti per ottenere punteggi più bassi. L'oligonucleotide bloccante ottimizzato per myd88 mostrato qui trova un equilibrio tra la temperatura di fusione dell'ibrido bloccante del DNA e punteggi di ibridazione e struttura secondaria sufficientemente bassi. È stato progettato per coprire gli amminoacidi da Q262 a I266 e presenta un DT invertito a tre primi per inibire sia l'estensione da parte della DNA polimerasi che la degradazione da parte dell'esonucleasi a tre prime.

Una volta che i primer sono stati progettati, impostare la PCR bloccante wild type ed eseguire il termociclo come descritto nel documento di accompagnamento. Rimuovere le perle magnetiche dal deposito a quattro gradi Celsius e portarle a temperatura ambiente. Trasferire 10 microlitri di prodotto PCR in una nuova piastra PCR.

Agitare energicamente le perle magnetiche per risospendere completamente le particelle magnetiche e quindi aggiungere 18 microlitri di perline magnetiche a ciascun pozzetto della nuova piastra. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare. Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.

Dopo l'incubazione, posizionare la piastra PCR sulla piastra magnetica laterale per due minuti per separare le perle dalla soluzione. Utilizzare una pipetta multicanale per aspirare il surnatante. Fare attenzione a evitare il pellet di perline.

Quindi, erogare 150 microlitri di etanolo al 70% in ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 30 secondi. Quindi aspirare l'etanolo con una pipetta multicanale ed eliminare i puntali. Ripetere ancora una volta questa procedura di lavaggio.

Utilizzando una pipetta multicanale da 20 microlitri, aspirare l'etanolo rimanente da ciascun pozzetto ed eliminare i puntali. Dopo aver lasciato asciugare circa 10 minuti i pozzetti della piastra, rimuoverlo dal magnete e aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto. Pipettare su e giù 15 volte per mescolare.

Quindi incubare a temperatura ambiente per due minuti. Dopo l'incubazione, riposizionare la piastra PCR sulla piastra magnetica per un minuto per separare le perle dalla soluzione. Trasferire 35 microlitri di prodotto purificato in una nuova piastra PCR ed eseguire il sequenziamento bidirezionale come descritto nel documento di accompagnamento.

Una volta eseguito il sequenziamento bidirezionale per purificare i prodotti di sequenziamento, preparare una soluzione fresca una volta in 25 di acetato di sodio a tre molari a PH 5,2 ed etanolo al 100%. Preparare anche una soluzione fresca di etanolo al 70%. A ciascun pozzetto delle piastre di sequenziamento diretto e inverso, aggiungere 30 microlitri di acetato di sodio in etanolo al 100% e pipettare su e giù cinque volte per mescolare.

Quindi richiudere la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Trascorsi 20 minuti, centrifugare la piastra a 2,250 volte G per 15 minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il sigillante per piastre e capovolgere la piastra una volta su un contenitore per rifiuti.

Se la piastra viene capovolta più volte, i pellet potrebbero allentarsi dal fondo del pozzetto. Posizionare il piatto capovolto su un tovagliolo di carta pulito e centrifugare a 150 volte G per un minuto. Quindi, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto e richiudere la piastra.

Centrifugare a 2, 250 volte G per cinque minuti. Quindi ripetere il processo di rimozione del sigillante per piastre e capovolgere la piastra. Se i pozzetti non sono completamente asciutti, lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente.

Assicurarsi che i campioni siano protetti dalla luce. Una volta che i pozzetti sono completamente asciutti, aggiungere 10 microlitri di formamide a ciascun pozzetto e pipettare su e giù 10 volte per mescolare. Richiudere la piastra.

Denaturare utilizzando un termociclatore a 95 gradi Celsius per tre minuti seguito da quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la denaturazione, sostituire la sigillante per piastre con un septa e sequenziare su una piattaforma di sequenziamento secondo le istruzioni del produttore. Utilizzando il software di analisi delle sequenze, visualizza le tracce e allinea le sequenze alle sequenze di riferimento appropriate.

Allineare myd88 alla sequenza di riferimento NCBI NM002468. Il DNA genomico di pazienti con e senza mutazioni è stato sottoposto a PCR bloccante sia convenzionale che wild type e i prodotti PCR risultanti sono stati quindi sequenziati. Come si può vedere qui, l'allele mutante è stato arricchito quando è stata eseguita la PCR di blocco wild type e non sono stati osservati falsi positivi nel DNA wild type.

Un calo caratteristico dell'intensità del segnale, come mostrato qui, si osserva spesso se viene utilizzata una concentrazione troppo elevata di bloccante o se la purificazione post-PCR non è riuscita a rimuovere il bloccante prima del sequenziamento bidirezionale. Ciò si verifica quando la purificazione enzimatica viene eseguita al posto della purificazione a biglie magnetiche. Qualsiasi test basato sulla PCR che arricchisce gli alleli mutanti rileverà artefatti a bassa frequenza.

Queste tracce mostrano un aumento degli artefatti di sequenziamento del CG, rispetto agli artefatti di TA nel tessuto FFPE quando la citosina o la citosina metilata vengono deaminate tramite infissazione formale rispettivamente all'uracile o alla tiamina. L'uracil, DNA glicosilasi, o UDG, può asportare l'uracile prima della PCR di blocco wild type, contribuendo a ridurre gli artefatti di sequenziamento. Tuttavia, la tiamina derivante dalla cinque metil citosina deaminata, che si trova frequentemente nelle isole CPG, non può essere asportata dall'UDG.

La diminuzione della concentrazione di bloccanti utilizzati nella PCR bloccante wild type può aiutare a ridurre l'insorgenza di artefatti di sequenziamento che non vengono risolti dal trattamento UDG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare le mutazioni somatiche con un alto grado di accuratezza e sensibilità, utilizzando la tecnica del blocco wild type. Il principio di questa tecnologia può essere applicato al rilevamento di mutazioni in piccole sottopopolazioni di cellule.

Pertanto, è utile nel rilevare la malattia minima residua, monitorare i pazienti e prevedere la recidiva precoce in pazienti con varie neoplasie.