Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche
29 marzo 2017
La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni. Questa metodologia può aiutare a rispondere a domande chiave nei test di mutazione somatica, facilitando l'individuazione di mutazioni a frequenza molto bassa. Qui cercheremo mutazioni nel gene myd88 in campioni di midollo osseo.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni altamente accurate e sensibili sulla presenza di mutazioni somatiche, anche con pochissime cellule neoplastiche. Questo saggio di sequenziamento basato sulla PCR con blocco wild type è stato sviluppato per amplificare parte dell'esone cinque nel gene myd88, garantendo la copertura dell'hotspot L265. I primer in avanti e all'indietro sono stati progettati con una sequenza M13 a cinque prime per consentire l'inginocchiamento dei primer di sequenziamento complementari.
Progettare l'oligonucleotide bloccante in modo che sia lungo circa 10-15 basi e complementare al modello di tipo selvatico in cui si desidera l'arricchimento mutante. Un oligo più corto migliorerà la discriminazione del mismatch. Per ottenere un'elevata specificità del bersaglio è importante non utilizzare troppo nucleotidi bloccanti, poiché ciò si tradurrà in oligonucleotidi molto appiccicosi.
Per progettare l'oligonucleotide bloccante, inizia navigando sul sito Web di Oligo Tools. Seleziona lo strumento di previsione Oligo TM. Si aprirà una nuova finestra.
Incolla la sequenza del modello wild type da bloccare nella casella della sequenza oligo. Aggiungi un segno più davanti alle basi del blocco per contrassegnarle. Fare clic sul pulsante Calcola per determinare la TM approssimativa dell'ibrido bloccante del DNA.
Le temperature di fusione calcolate appariranno nelle caselle sottostanti. Progettare l'oligo bloccante in modo che abbia una temperatura di fusione da 10 a 15 gradi Celsius al di sopra della temperatura di estensione durante il ciclo termico. Qui, la temperatura di estensione è di 72 gradi Celsius.
Per regolare la temperatura di fusione, aggiungere, rimuovere o sostituire le basi di blocco. Evitare lunghi tratti di tre o quattro basi C o G bloccanti. Successivamente, per evitare la formazione di strutture secondarie o l'auto-dimerizzazione, torna alla schermata iniziale del sito Web di Oligo Tools e seleziona lo strumento Oligo Optimizer.
Si aprirà una nuova finestra. Incolla la sequenza del modello di tipo jolly da bloccare nella casella. Aggiungi un segno più per indicare le basi di blocco.
Seleziona le due caselle per la struttura secondaria e solo per te stesso e premi il pulsante di analisi per vedere i punteggi per l'ibridazione e la struttura secondaria. Questi punteggi rappresentano stime molto approssimative delle temperature di fusione rispettivamente dei self dimeri e delle strutture secondarie. I punteggi più bassi sono ottimali e possono essere ottenuti limitando l'accoppiamento dei bloccanti.
Rimuovere o riposizionare i nucleotidi bloccanti per ottenere punteggi più bassi. L'oligonucleotide bloccante ottimizzato per myd88 mostrato qui trova un equilibrio tra la temperatura di fusione dell'ibrido bloccante del DNA e punteggi di ibridazione e struttura secondaria sufficientemente bassi. È stato progettato per coprire gli amminoacidi da Q262 a I266 e presenta un DT invertito a tre primi per inibire sia l'estensione da parte della DNA polimerasi che la degradazione da parte dell'esonucleasi a tre prime.
Una volta che i primer sono stati progettati, impostare la PCR bloccante wild type ed eseguire il termociclo come descritto nel documento di accompagnamento. Rimuovere le perle magnetiche dal deposito a quattro gradi Celsius e portarle a temperatura ambiente. Trasferire 10 microlitri di prodotto PCR in una nuova piastra PCR.
Agitare energicamente le perle magnetiche per risospendere completamente le particelle magnetiche e quindi aggiungere 18 microlitri di perline magnetiche a ciascun pozzetto della nuova piastra. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare. Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.
Dopo l'incubazione, posizionare la piastra PCR sulla piastra magnetica laterale per due minuti per separare le perle dalla soluzione. Utilizzare una pipetta multicanale per aspirare il surnatante. Fare attenzione a evitare il pellet di perline.
Quindi, erogare 150 microlitri di etanolo al 70% in ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 30 secondi. Quindi aspirare l'etanolo con una pipetta multicanale ed eliminare i puntali. Ripetere ancora una volta questa procedura di lavaggio.
Utilizzando una pipetta multicanale da 20 microlitri, aspirare l'etanolo rimanente da ciascun pozzetto ed eliminare i puntali. Dopo aver lasciato asciugare circa 10 minuti i pozzetti della piastra, rimuoverlo dal magnete e aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto. Pipettare su e giù 15 volte per mescolare.
Quindi incubare a temperatura ambiente per due minuti. Dopo l'incubazione, riposizionare la piastra PCR sulla piastra magnetica per un minuto per separare le perle dalla soluzione. Trasferire 35 microlitri di prodotto purificato in una nuova piastra PCR ed eseguire il sequenziamento bidirezionale come descritto nel documento di accompagnamento.
Una volta eseguito il sequenziamento bidirezionale per purificare i prodotti di sequenziamento, preparare una soluzione fresca una volta in 25 di acetato di sodio a tre molari a PH 5,2 ed etanolo al 100%. Preparare anche una soluzione fresca di etanolo al 70%. A ciascun pozzetto delle piastre di sequenziamento diretto e inverso, aggiungere 30 microlitri di acetato di sodio in etanolo al 100% e pipettare su e giù cinque volte per mescolare.
Quindi richiudere la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Trascorsi 20 minuti, centrifugare la piastra a 2,250 volte G per 15 minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il sigillante per piastre e capovolgere la piastra una volta su un contenitore per rifiuti.
Se la piastra viene capovolta più volte, i pellet potrebbero allentarsi dal fondo del pozzetto. Posizionare il piatto capovolto su un tovagliolo di carta pulito e centrifugare a 150 volte G per un minuto. Quindi, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto e richiudere la piastra.
Centrifugare a 2, 250 volte G per cinque minuti. Quindi ripetere il processo di rimozione del sigillante per piastre e capovolgere la piastra. Se i pozzetti non sono completamente asciutti, lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente.
Assicurarsi che i campioni siano protetti dalla luce. Una volta che i pozzetti sono completamente asciutti, aggiungere 10 microlitri di formamide a ciascun pozzetto e pipettare su e giù 10 volte per mescolare. Richiudere la piastra.
Denaturare utilizzando un termociclatore a 95 gradi Celsius per tre minuti seguito da quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la denaturazione, sostituire la sigillante per piastre con un septa e sequenziare su una piattaforma di sequenziamento secondo le istruzioni del produttore. Utilizzando il software di analisi delle sequenze, visualizza le tracce e allinea le sequenze alle sequenze di riferimento appropriate.
Allineare myd88 alla sequenza di riferimento NCBI NM002468. Il DNA genomico di pazienti con e senza mutazioni è stato sottoposto a PCR bloccante sia convenzionale che wild type e i prodotti PCR risultanti sono stati quindi sequenziati. Come si può vedere qui, l'allele mutante è stato arricchito quando è stata eseguita la PCR di blocco wild type e non sono stati osservati falsi positivi nel DNA wild type.
Un calo caratteristico dell'intensità del segnale, come mostrato qui, si osserva spesso se viene utilizzata una concentrazione troppo elevata di bloccante o se la purificazione post-PCR non è riuscita a rimuovere il bloccante prima del sequenziamento bidirezionale. Ciò si verifica quando la purificazione enzimatica viene eseguita al posto della purificazione a biglie magnetiche. Qualsiasi test basato sulla PCR che arricchisce gli alleli mutanti rileverà artefatti a bassa frequenza.
Queste tracce mostrano un aumento degli artefatti di sequenziamento del CG, rispetto agli artefatti di TA nel tessuto FFPE quando la citosina o la citosina metilata vengono deaminate tramite infissazione formale rispettivamente all'uracile o alla tiamina. L'uracil, DNA glicosilasi, o UDG, può asportare l'uracile prima della PCR di blocco wild type, contribuendo a ridurre gli artefatti di sequenziamento. Tuttavia, la tiamina derivante dalla cinque metil citosina deaminata, che si trova frequentemente nelle isole CPG, non può essere asportata dall'UDG.
La diminuzione della concentrazione di bloccanti utilizzati nella PCR bloccante wild type può aiutare a ridurre l'insorgenza di artefatti di sequenziamento che non vengono risolti dal trattamento UDG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare le mutazioni somatiche con un alto grado di accuratezza e sensibilità, utilizzando la tecnica del blocco wild type. Il principio di questa tecnologia può essere applicato al rilevamento di mutazioni in piccole sottopopolazioni di cellule.
Pertanto, è utile nel rilevare la malattia minima residua, monitorare i pazienti e prevedere la recidiva precoce in pazienti con varie neoplasie.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza mediante PCR con blocco del tipo selvaggio seguita da sequenziamento diretto. La tecnica è particolarmente efficace per l'analisi di campioni di midollo osseo per mutazioni nel gene myd88.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genetica
- Oncoologia
- Biologia Molecolare
Sfondo
- Le mutazioni somatiche possono verificarsi a basse frequenze in vari tessuti.
- La rilevazione di queste mutazioni è fondamentale per comprendere la biologia del cancro.
- I metodi tradizionali potrebbero non avere la sensibilità necessaria per il rilevamento a bassa frequenza.
- La PCR con blocco del tipo selvaggio offre un approccio innovativo per potenziare le capacità di rilevamento.
Scopo dello studio
- Migliorare il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza.
- Indirizzare in modo specifico le mutazioni nel gene myd88.
- Convalidare l'efficacia del metodo PCR con blocco del tipo selvatico.
Metodi Utilizzati
- È stata utilizzata una PCR di blocco di tipo selvaggio per amplificare regioni geniche specifiche.
- È stata eseguita una sequenza diretta per identificare le mutazioni.
- I campioni di midollo osseo sono stati analizzati per verificare la presenza di mutazioni.
- I primer sono stati progettati per garantire la copertura del sito caldo L265 nell'esone cinque.
Risultati principali
- Il metodo ha rilevato con successo mutazioni a bassa frequenza in campioni di midollo osseo.
- Sono state ottenute un'elevata sensibilità e accuratezza nell'identificazione di mutazioni somatiche.
- I risultati hanno confermato la presenza di mutazioni nel gene myd88.
- La tecnica ha dimostrato un potenziale per applicazioni più ampie nei test di mutazione.
Conclusioni
- La PCR di blocco di tipo selvaggio è uno strumento utile per rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza.
- Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle alterazioni genetiche nel cancro.
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliarne l'uso in ambito clinico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza è fondamentale per il monitoraggio della malattia minima residua, l'identificazione della resistenza emergente e l'indirizzamento delle decisioni terapeutiche nello sviluppo di farmaci oncologici. Il metodo PCR con blocco dell'allele wild-type aumenta la sensibilità fino a circa 1 allele mutato ogni 1.000 alleli wild-type, consentendo il rilevamento precoce dell'evoluzione tumorale. Questa capacità migliora l'affidabilità predittiva negli studi preclinici e traslazionali, permettendo una valutazione affidabile dell'eterogeneità genetica anche con quantità limitate di campione, come cellule tumorali circolanti o aspirati di midollo osseo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il rilevamento di alleli mutanti a bassa abbondanza in campioni eterogenei.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio attraverso una quantificazione precisa del carico di mutazioni in modelli preclinici.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia negli studi di modulazione del bersaglio riducendo i tassi di falsi negativi nel rilevamento delle mutazioni.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output di sequenziamento quantitativi che distinguono vere mutazioni a bassa frequenza dal rumore di fondo.
- Valore operativo: Produce ampliconi arricchiti per mutanti standardizzati e riproducibili, adatti ai flussi di lavoro di sequenziamento successivi.
- Utilità della piattaforma: Favorisce la scalabilità e il riutilizzo del saggio su più bersagli genici grazie a una progettazione adattabile degli oligonucleotidi bloccanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la continuità traslazionale rilevando mutazioni in sistemi rilevanti per le malattie, come campioni di midollo osseo.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale della frequenza dell'allele mutato per valutare la risposta terapeutica e l'insorgenza di resistenza.
- Controllo del rischio: Supporta decisioni precliniche di prosecuzione o interruzione dello sviluppo fornendo soglie misurabili per l'evoluzione clonale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della target fino all'ottimizzazione del lead e ai test di efficacia preclinica, in particolare quando il monitoraggio delle alterazioni genetiche guida la selezione del composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo il rilevamento di mutazioni somatiche nei percorsi genici di interesse.
- Screening: Fornisce prodotti PCR purificati pronti per il saggio, con ridotta interferenza del tipo selvatico, per una chiamata affidabile delle varianti.
- Analisi: Offre letture di sequenziamento bidirezionali che permettono la visualizzazione e la quantificazione specifica per allele.
- Ricerca traslazionale: Si collega all'allineamento dei biomarcatori tramite il tracciamento delle mutazioni in tipi di campioni clinicamente rilevanti.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare di rilevamento applicabile a numerosi oncogeni oltre a MYD88.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella rilevazione delle mutazioni e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla resistenza.
- Valore operativo: Potenzia la standardizzazione e la riproducibilità del saggio grazie alla purificazione basata su microsfere e alla progettazione controllata di oligonucleotidi bloccanti.
- Valore strategico: Consente decisioni più informate sul proseguimento o meno del progetto, abilitando la rilevazione precoce di mutazioni che conferiscono resistenza.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento con rischio calibrato identificando cloni resistenti a bassa frequenza prima dell'ampliamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di oligonucleotidi e nell'ottimizzazione della temperatura di fusione per un efficace blocco del tipo selvaggio.
- È dipendente dall'accesso a termociclatori, sistemi di purificazione con perle magnetiche e piattaforme di sequenziamento bidirezionali.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione dell'oligonucleotide bloccante per minimizzare gli artefatti di sequenziamento.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi tipi di campioni, come tessuti FFPE o biopsie liquide.
- Comporta limitazioni pratiche, tra cui possibili artefatti di sequenziamento residui derivanti da eventi di deaminazione non completamente risolti dalla uracile-DNA glicosilasi.
