Name: Elettroporazione in utero approcci per studiare leccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri l'elettroporazione in utero per studiare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali. Questo metodo consente l'analisi quantitativa di singole cellule fluorescenti.

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Siamo grati a R. Gutiérrez e A. Morales per la loro eccellente assistenza tecnica e di LA Weiss per la modifica. CGB è finanziato dagli spagnoli Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da BBVA Foundation e SAF2014-58598-jin (MINECO) a M. Navarrete e da una sovvenzione della Fondazione Areces e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-REDT (da MINECO) a Ramon M. Nieto.

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<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive in dettaglio come etichettare i neuroni della corteccia somatosensoriale di C75BL / 6 topi al fine di analizzare la loro connettività e la loro eccitabilità. Rispetto ai metodi esistenti, visualizza aspetti discriminanti connettività, come il numero di rami assonali per neurone, la loro precisa topografia, e la loro posizione anatomica. Modificando la posizione degli elettrodi, è possibile indirizzare altre popolazioni neuronali, come la corteccia del cingolo (mantenere lo stesso angolo tra gl...

Lo sviluppo di strutture dendritiche e assonale è un aspetto importante della regolazione circuito nel sistema nervoso, compreso nella corteccia cerebrale. Essa svolge un ruolo critico durante il cablaggio selettivo delle diverse sottopopolazioni neuronali. Un certo numero di rapporti recenti hanno dimostrato che, oltre alla connettività, la diversità molecolare dei neuroni è riflessa dalla acquisizione di modalità altamente specifiche di cottura. Tuttavia, i meccanismi che determinano l&#39;eccitabilità e la connettività dei sottotipi neuronali distinti durante lo sviluppo, così come il loro grado di coordinamento, sono ancora poco conosciuti 1, 2. In vivo in perdita e guadagno di funzione analizza consentire lo studio del rapporto tra il livello di espressione di geni specifici e la loro influenza nello sviluppo del circuito. In utero elettroporazione (IUE) è una tecnica ampiamente utilizzata per lo studiola funzione di un gene di interesse in specifiche popolazioni neuronali e studiare gli schemi generali della loro connettività. Tuttavia, per determinare le caratteristiche morfologiche degli assoni e dendriti in strati corticali in topi vivi, è essenziale per etichettare i neuroni scarsamente. Un sistema di ricombinazione Cre combinato con IUE può essere usato per marcare una scarsa popolazione di neuroni in una sufficientemente bassa densità per risolvere le proiezioni emessi dalle singole celle delle lamine corticali identificati. Questo metodo etichetta un numero sufficiente di neuroni per corteccia di ottenere dati quantitativi dopo l&#39;analisi dei numeri ragionevoli di cervelli elettroporate (Figura 1). Questo manoscritto presenta un metodo per tale analisi multa di connettività. Presenta inoltre una strategia simile per l&#39;analisi, in esperimenti separati, le proprietà elettriche dei neuroni eseguendo registrazioni current-clamp su verde proteina fluorescente (GFP) -electroporated cellule da fette corticali acute. questi protocoli sono versatili e possono essere applicati allo studio dell&#39;eccitabilità e la connettività dei neuroni di animali WT e transgenici, e anche di neuroni in cui perdite e guadagni di funzione vengono introdotti da plasmidi addizionali durante IUE. Sebbene questo protocollo descrive l&#39;elettroporazione di topi a giorno embrionale (E) 15.5, questa tecnica può essere eseguita a qualsiasi età tra E9.5 3 al giorno postnatale (P) 2 4. Mentre elettroporazione nelle fasi iniziali si rivolge neuroni e precursori del talamo e strati profondi della corteccia, i marchi di elettroporazione in seguito allo stadio strati più superficiali (ad esempio, neuroni E15.5 IUE obiettivi strato II-III). In sintesi, la combinazione di IUE con l&#39;analisi morfologica singola cellula ed elettrofisiologia è uno strumento utile per chiarire i meccanismi molecolari alla base della enorme diversità strutturale e funzionale dei neuroni nel sistema nervoso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio</td><td>Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi # 3 - 12 cm</td><td>Strumenti</td> per scienze fini <td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi # 10</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Adson seghettate - Dritte 12 cm</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Fini Temprate - Dritte 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mezenbaum-Nelson Curvo L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Punte curve sottili - Stile 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forcipe-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Mathieu - Seghettato</td><td>Fine Strumenti di scienza</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Applier</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td>Suture 205016</td></tr><tr><td>- Rasoio elettrico Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato (100 mm, 1,0/0,58 diametro esterno/interno)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di aspirazione per pipette microcapillari calibrate</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Garza (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs (Star Cott)</td><td>Albasa-Needle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticorpo policlonale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi in platino 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp; per Imaging Fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizzatore Isofluorane</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di Scansione Laser</td><td>Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Microscopio</td><td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Estrattore di Micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>software di analisi patch clamp (p-Clamp Clampfit 10.3)</td>Software <td></td> di acquisizione <td>Molecular Devices</td><td></td></tr> <tr><td>(MultiClamp 700B Amplifier)</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato + base rotante&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo d'aria</td><td>Newport-Pompe</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>peristaltiche miniaturizzate</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Il sistema nervoso è composto da una vasta gamma di tipi neuronali distinti. Queste sottopopolazioni neuronali sono caratterizzati da, tra le altre caratteristiche, le loro morfologie dendritiche distinti, i loro modelli specifici di connettività assonale, e le loro risposte di cottura selettive. I meccanismi molecolari e cellulari responsabili di questi aspetti di differenziazione durante lo sviluppo sono ancora poco conosciuti. Qui, descriviamo protocolli combinati per l&#39;etichettatura e caratterizzare la connettività strutturale e l&#39;eccitabilità dei neuroni corticali. Modifica del protocollo di elettroporazione in utero (IUE) consente l&#39;etichettatura di una popolazione sparsa di neuroni. Questo, a sua volta, consente l&#39;identificazione e la manutenzione dei dendriti e assoni dei singoli neuroni, la precisa caratterizzazione della posizione laminare di proiezioni assonale e analisi morfometrica. IUE può anche essere usato per studiare variazioni l&#39;eccitabilitàwild-type (WT) o neuroni geneticamente modificati attraverso la combinazione con la registrazione a cellula intera da fettine acute di cervelli elettroporate. Queste due tecniche contribuiscono ad una migliore comprensione dell&#39;accoppiamento di connettività strutturale e funzionale dei meccanismi molecolari che controllano diversità neuronale durante lo sviluppo. Questi processi di sviluppo hanno importanti implicazioni sul cablaggio assonale, la diversità funzionale dei neuroni, e la biologia dei disturbi cognitivi.

Per caratterizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni nel dettaglio e in tutto lo sviluppo, è essenziale per etichettare i neuroni scarsamente. Un sistema Cre-ricombinasi diluita permette l&#39;espressione di un gene di interesse in una popolazione sparsa di neuroni, in modo che solo i neuroni che incorporano questo enzima esprimono GFP (Figura 1A). Usando questa strategia, strato di II-III è mirato ed etichettato da IUE a E15.5. CAG-DsRed2 a 1 mg / mL, è co-elettropo...

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l&#39;eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l&#39;eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

L'obiettivo generale di questo approccio di elettroporazione in utero è caratterizzare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali in condizioni normali e sperimentali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella neurobiologia dello sviluppo, come l'analisi della struttura e della connettività funzionale del cervello e la biologia dei disturbi cognitivi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di marcare una popolazione sparsa di neuroni e di visualizzare i dendriti, permettendo l'accesso ai singoli neuroni, il che porta a un'analisi quantitativa più efficiente e più fedele.Prima dell'iniezione, preparare dieci microlitri di miscela di DNA per ogni intervento chirurgico, sia per l'etichettatura di singole cellule che per lo studio standard della tecnica del patch clamp. Successivamente, manipolare delicatamente gli embrioni con le dita per individuare il telencefalo. Poi, posizionare una micropipetta in borosilicato preparata in una pipetta orale.Fare passare la punta dell'ago attraverso l'utero, evitando i vasi sanguigni, fino a raggiungere il ventricolo laterale. Successivamente, iniettare lentamente circa un mic

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Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

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Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

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Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

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