Name: Elettroporazione in utero approcci per studiare leccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri l'elettroporazione in utero per studiare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali. Questo metodo consente l'analisi quantitativa di singole cellule fluorescenti.

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Siamo grati a R. Gutiérrez e A. Morales per la loro eccellente assistenza tecnica e di LA Weiss per la modifica. CGB è finanziato dagli spagnoli Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da BBVA Foundation e SAF2014-58598-jin (MINECO) a M. Navarrete e da una sovvenzione della Fondazione Areces e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-REDT (da MINECO) a Ramon M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II%2FIII+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2CLateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive in dettaglio come etichettare i neuroni della corteccia somatosensoriale di C75BL / 6 topi al fine di analizzare la loro connettività e la loro eccitabilità. Rispetto ai metodi esistenti, visualizza aspetti discriminanti connettività, come il numero di rami assonali per neurone, la loro precisa topografia, e la loro posizione anatomica. Modificando la posizione degli elettrodi, è possibile indirizzare altre popolazioni neuronali, come la corteccia del cingolo (mantenere lo stesso angolo tra gl...

Lo sviluppo di strutture dendritiche e assonale è un aspetto importante della regolazione circuito nel sistema nervoso, compreso nella corteccia cerebrale. Essa svolge un ruolo critico durante il cablaggio selettivo delle diverse sottopopolazioni neuronali. Un certo numero di rapporti recenti hanno dimostrato che, oltre alla connettività, la diversità molecolare dei neuroni è riflessa dalla acquisizione di modalità altamente specifiche di cottura. Tuttavia, i meccanismi che determinano l&#39;eccitabilità e la connettività dei sottotipi neuronali distinti durante lo sviluppo, così come il loro grado di coordinamento, sono ancora poco conosciuti 1, 2. In vivo in perdita e guadagno di funzione analizza consentire lo studio del rapporto tra il livello di espressione di geni specifici e la loro influenza nello sviluppo del circuito. In utero elettroporazione (IUE) è una tecnica ampiamente utilizzata per lo studiola funzione di un gene di interesse in specifiche popolazioni neuronali e studiare gli schemi generali della loro connettività. Tuttavia, per determinare le caratteristiche morfologiche degli assoni e dendriti in strati corticali in topi vivi, è essenziale per etichettare i neuroni scarsamente. Un sistema di ricombinazione Cre combinato con IUE può essere usato per marcare una scarsa popolazione di neuroni in una sufficientemente bassa densità per risolvere le proiezioni emessi dalle singole celle delle lamine corticali identificati. Questo metodo etichetta un numero sufficiente di neuroni per corteccia di ottenere dati quantitativi dopo l&#39;analisi dei numeri ragionevoli di cervelli elettroporate (Figura 1). Questo manoscritto presenta un metodo per tale analisi multa di connettività. Presenta inoltre una strategia simile per l&#39;analisi, in esperimenti separati, le proprietà elettriche dei neuroni eseguendo registrazioni current-clamp su verde proteina fluorescente (GFP) -electroporated cellule da fette corticali acute. questi protocoli sono versatili e possono essere applicati allo studio dell&#39;eccitabilità e la connettività dei neuroni di animali WT e transgenici, e anche di neuroni in cui perdite e guadagni di funzione vengono introdotti da plasmidi addizionali durante IUE. Sebbene questo protocollo descrive l&#39;elettroporazione di topi a giorno embrionale (E) 15.5, questa tecnica può essere eseguita a qualsiasi età tra E9.5 3 al giorno postnatale (P) 2 4. Mentre elettroporazione nelle fasi iniziali si rivolge neuroni e precursori del talamo e strati profondi della corteccia, i marchi di elettroporazione in seguito allo stadio strati più superficiali (ad esempio, neuroni E15.5 IUE obiettivi strato II-III). In sintesi, la combinazione di IUE con l&#39;analisi morfologica singola cellula ed elettrofisiologia è uno strumento utile per chiarire i meccanismi molecolari alla base della enorme diversità strutturale e funzionale dei neuroni nel sistema nervoso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio</td><td>Meda</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi # 3 - 12 cm</td><td>Strumenti</td> per scienze fini <td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi # 10</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Adson seghettate - Dritte 12 cm</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Fini Temprate - Dritte 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mezenbaum-Nelson Curvo L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Punte curve sottili - Stile 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forcipe-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Mathieu - Seghettato</td><td>Fine Strumenti di scienza</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Applier</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td>Suture 205016</td></tr><tr><td>- Rasoio elettrico Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato (100 mm, 1,0/0,58 diametro esterno/interno)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di aspirazione per pipette microcapillari calibrate</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Garza (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs (Star Cott)</td><td>Albasa-Needle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticorpo policlonale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi in platino 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp; per Imaging Fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizzatore Isofluorane</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di Scansione Laser</td><td>Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Microscopio</td><td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Estrattore di Micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>software di analisi patch clamp (p-Clamp Clampfit 10.3)</td>Software <td></td> di acquisizione <td>Molecular Devices</td><td></td></tr> <tr><td>(MultiClamp 700B Amplifier)</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato + base rotante&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo d'aria</td><td>Newport-Pompe</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>peristaltiche miniaturizzate</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Il sistema nervoso è composto da una vasta gamma di tipi neuronali distinti. Queste sottopopolazioni neuronali sono caratterizzati da, tra le altre caratteristiche, le loro morfologie dendritiche distinti, i loro modelli specifici di connettività assonale, e le loro risposte di cottura selettive. I meccanismi molecolari e cellulari responsabili di questi aspetti di differenziazione durante lo sviluppo sono ancora poco conosciuti. Qui, descriviamo protocolli combinati per l&#39;etichettatura e caratterizzare la connettività strutturale e l&#39;eccitabilità dei neuroni corticali. Modifica del protocollo di elettroporazione in utero (IUE) consente l&#39;etichettatura di una popolazione sparsa di neuroni. Questo, a sua volta, consente l&#39;identificazione e la manutenzione dei dendriti e assoni dei singoli neuroni, la precisa caratterizzazione della posizione laminare di proiezioni assonale e analisi morfometrica. IUE può anche essere usato per studiare variazioni l&#39;eccitabilitàwild-type (WT) o neuroni geneticamente modificati attraverso la combinazione con la registrazione a cellula intera da fettine acute di cervelli elettroporate. Queste due tecniche contribuiscono ad una migliore comprensione dell&#39;accoppiamento di connettività strutturale e funzionale dei meccanismi molecolari che controllano diversità neuronale durante lo sviluppo. Questi processi di sviluppo hanno importanti implicazioni sul cablaggio assonale, la diversità funzionale dei neuroni, e la biologia dei disturbi cognitivi.

Per caratterizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni nel dettaglio e in tutto lo sviluppo, è essenziale per etichettare i neuroni scarsamente. Un sistema Cre-ricombinasi diluita permette l&#39;espressione di un gene di interesse in una popolazione sparsa di neuroni, in modo che solo i neuroni che incorporano questo enzima esprimono GFP (Figura 1A). Usando questa strategia, strato di II-III è mirato ed etichettato da IUE a E15.5. CAG-DsRed2 a 1 mg / mL, è co-elettropo...

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l&#39;eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l&#39;eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

L'obiettivo generale di questo approccio di elettroporazione in utero è caratterizzare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali in condizioni normali e sperimentali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella neurobiologia dello sviluppo, come l'analisi della struttura e della connettività funzionale del cervello e la biologia dei disturbi cognitivi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di marcare una popolazione sparsa di neuroni e di visualizzare i dendriti, permettendo l'accesso ai singoli neuroni, il che porta a un'analisi quantitativa più efficiente e più fedele.Prima dell'iniezione, preparare dieci microlitri di miscela di DNA per ogni intervento chirurgico, sia per l'etichettatura di singole cellule che per lo studio standard della tecnica del patch clamp. Successivamente, manipolare delicatamente gli embrioni con le dita per individuare il telencefalo. Poi, posizionare una micropipetta in borosilicato preparata in una pipetta orale.Fare passare la punta dell'ago attraverso l'utero, evitando i vasi sanguigni, fino a raggiungere il ventricolo laterale. Successivamente, iniettare lentamente circa un microlitro di soluzione di DNA colorata con Fast Green fino a quando non si osserva una grande macchia blu. Un passaggio critico di questa procedura è l'iniezione del DNA.Questa operazione deve essere eseguita nel modo più delicato possibile. Posizionare ora i due elettrodi di platino da sette millimetri lateralmente sulla testa di un embrione ed applicare una tensione attraverso gli elettrodi di platino. In questo procedimento, crioprotettere i cervelli fissati in dieci millilitri di soluzione al 30% di saccarosio in PBS a quattro gradi Celsius per uno o due giorni, fino a quando non affondano.Quindi preparare cubetti di alluminio di un centimetro cubo e riempire i cubetti per due terzi con OCT. Successivamente, inserire i cervelli nei cubetti e congelarli su ghiaccio secco. Infine, conservare i cervelli congelati a 80 gradi Celsius.Per sezionare i cervelli al criostato, posizionare una goccia di OCT sulla superficie del disco del campione. Rimuovere il foglio di alluminio dal blocco istologico e posizionare il blocco nell'orientamento desiderato sulla OCT liquida. Applicare una pressione ferma finché il blocco istologico non è fissato.Inserire quindi il disco del campione nella testa del campione del criostato e orientare il campione per il sezionamento. Tagliare poi sezioni spesse 50-100 micrometri e trasferire le criosezioni galleggianti nel PBS utilizzando un pennello sottile. Successivamente, bloccare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente con siero bovino fetale al 5% in PBS, contenente Triton X-100 allo 0,5%.Successivamente, incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius con un anticorpo primario diluito 1:500 nella soluzione di blocco. Il giorno seguente, lavare le sezioni tre volte in PBS. Aggiungere un anticorpo secondario diluito 1:500 nella soluzione di blocco e incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente.Quindi lavare le sezioni tre volte in PBS. Successivamente, controcolorare le sezioni con dapE in PBS contenente 0,5% di Triton X-100 per dieci minuti. Risciacquare le sezioni con PBS e montarle con un mezzo di montaggio.Per ricostruire i neuroni, acquisire immagini delle sezioni cerebrali con ingrandimento elevato e alta risoluzione. Successivamente, selezionare l'opzione di scansione a tasselli (Tile Scan) nel software di acquisizione per coprire l'area di interesse, comprendendo tutti i dendriti e i prolungamenti assonali. Acquisire un numero sufficiente di stack lungo l'asse Z per evitare perdita di informazioni.In seguito, aprire l'immagine e selezionare l'opzione di linea segmentata dal menu. Tracciare una linea seguendo la struttura del neurone. Successivamente, andare su Analizza, Strumenti, quindi Gestore ROI e infine Aggiungi per salvare la linea.Ripetere questo processo per ogni assone o dendrite del neurone analizzato. Nel menu Gestione ROI, premere Misura per ottenere la lunghezza. Esportare le misurazioni in un file di testo o in un foglio elettronico per l'analisi.Per effettuare una registrazione di un neurone che esprime GFP da un topo elettroporato con GFP, posizionare il cervello in una piastra di coltura fredda. Rimuovere il cervelletto con piccole forbici. Quindi prendere il cervello con una spatola e asciugarlo tamponandolo delicatamente su un tovagliolo di carta.Incollare il piano caudale ventrale del cervello su un supporto per vibratomo. Posizionare il supporto su un vibratomo riempito con ACSF freddo di ghiaccio ed assicurarsi che la camera del vibratomo riceva una carbogenazione continua. Successivamente, ottenere sezioni acute tagliando sezioni coronali di 300 micrometri entro 15 minuti.Successivamente, incubare le sezioni fresche a 25 gradi Celsius per almeno 60 minuti in ACSF, insufflando carbogeno. Dopo 60 minuti, trasferire una sezione nella camera di registrazione utilizzando una pipetta di Pasteur o un piccolo pennello. Fissare la sezione con un pettine e perfondere con ACSF a una velocità di due millilitri al minuto.Per effettuare il patch di un neurone positivo per GFP, individuare l'area di interesse attraverso il microscopio a 10x. Successivamente, trovare una cellula positiva per GFP utilizzando l'obiettivo a 60x. Poi, riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione intracellulare.Successivamente, posizionare una pipetta di vetro nel supporto per pipette. In seguito, inserire la punta della pipetta nel bagno e mettere a fuoco la punta. Una volta che la pipetta è nel bagno, applicare una pressione positiva attraverso il sistema di controllo della pressione posteriore.Avvicinarsi alla cellula di interesse sotto guida visiva mantenendo una pressione all'indietro nella pipetta. Quando appare una piccola fossetta sulla superficie della cellula, rilasciare la pressione. A questo punto, può formarsi un sigillo stretto con una resistenza superiore a un giga-ohm.In caso contrario, applicare una leggera pressione negativa per facilitare il processo. Mentre si sta formando il sigillo, portare il voltaggio di mantenimento del clamp a 60 millivolt. Una volta formato il sigillo giga-ohm, applicare un impulso di aspirazione per rompere la membrana cellulare ed entrare in modalità cella intera.Una volta raggiunta la modalità a cellula intera, passare dalla modalità voltage clamp a quella current clamp e iniziare la registrazione. Queste immagini mostrano il trasferimento di vettori nei neuroni dello strato 2/3 mediante elettroporazione in utero al giorno embrionale 15,5, e le sezioni coronali sono state preparate al giorno postnatale 16. Il vettore CAG DsRed2 è stato cotrasfettato come controllo.La GFP è espressa solo in quei neuroni che hanno incorporato anche la cre, permettendo la ricombinazione dei siti LoxP nel vettore CALNL GFP. Di seguito è riportata un'immagine confocale ad alto ingrandimento degli alberi dendritici di un altro neurone GFP etichettato in modo sparso. Si tratta di un neurone piramidale elettroporato con GFP, osservato in condizioni di campo chiaro e di fluorescenza verde.Di seguito è riportata una tipica risposta con scarica regolare di un neurone di controllo elettroporato con CAG-GFP nello strato 2/3. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per le elettroporazioni in utero e in mezza giornata per la registrazione con patch clamp, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire l'intervento chirurgico il più rapidamente possibile per ridurre lo stress della madre e aumentare le probabilità di sopravvivenza dei cuccioli.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi dell'espressione genica, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulla relazione tra l'espressione di geni specifici e il loro impatto nello sviluppo dell'organismo ospite. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroscienza dello sviluppo per esplorare la connettività e la morfologia dei neuroni nei topi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare interventi in utero per descrivere la struttura e la connettività dei neuroni a livello singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni marcati con fluorescenza.

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