Elettroporazione in utero approcci per studiare l'eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

L'obiettivo generale di questo approccio all'elettroporazione in utero è quello di caratterizzare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali in condizioni normali e sperimentali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella neurobiologia dello sviluppo, come l'analisi della struttura e della connettività funzionale del cervello e la biologia dei disturbi cognitivi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la marcatura di una popolazione sparsa di neuroni e consente di vestire i dendriti e accedere ai singoli neuroni, il che porta a un'analisi quantitativa più efficiente e più fimetica.

Prima dell'iniezione, preparare dieci microlitri di miscela di DNA per ogni intervento chirurgico per l'etichettatura di singole cellule o per lo studio standard con patch clamp. Quindi, manipolare delicatamente gli embrioni con le dita per localizzare il telencefalo. Quindi, posizionare un capillare borosilicato preparato in una pipetta per bocca.

Passare la punta dell'ago attraverso l'utero, evitando i vasi sanguigni, fino a raggiungere il ventricolo laterale. Successivamente, iniettare lentamente circa un microlitro di soluzione di DNA colorato Fast Green fino a quando non si osserva una grande macchia blu. Un passaggio critico in questa procedura è l'iniezione del DNA.

Questo dovrebbe essere fatto il più delicatamente possibile. Ora, posiziona gli elettrodi di platino da sette millimetri lateralmente sulla testa di un embrione e applica la tensione attraverso gli elettrodi di platino. In questa procedura, crioproteggere i cervelli fissi in dieci millilitri di saccarosio al 30% in PBS a quattro gradi Celsius per uno o due giorni fino a quando non affondano.

Quindi preparare un centimetro di cubetti di carta stagnola e riempire i cubetti per 2/3 o il modo con OCT. Successivamente, metti i cervelli nei cubetti e congelali su ghiaccio secco. Successivamente conservare i cervelli congelati a 80 gradi Celsius.

Per sezionare i cervelli nel criostato, posizionare una goccia di OCT sulla superficie del disco del campione. Staccare il foglio di alluminio dal blocco istologico e posizionare il blocco con l'orientamento desiderato sopra l'OCT liquido. Applicare una pressione decisa fino a quando il blocco istologico non è fissato.

Quindi inserire il disco del campione nella testa del campione del criostato e orientare il campione per il sezionamento. Quindi tagliare sezioni spesse 50-100 micrometri e trasferire le criosezioni galleggianti su PBS utilizzando un pennello fine. Successivamente, bloccare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente con il 5% di siero fetale bovino in PBS, contenente lo 0,5% di Triton X-100.

Successivamente, incubarli per una notte a quattro gradi Celsius con anticorpo primario 1:500 diluito in soluzione bloccante. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte in PBS. Aggiungere l'anticorpo secondario 1:500 diluito in soluzione bloccante e incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi lavare le sezioni tre volte in PBS. Successivamente, controcolorare le sezioni con dapE in PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 per dieci minuti. Sciacquare le sezioni con PBS e montarle con un mezzo di montaggio.

Per ricostruire i neuroni, acquisire immagini delle sezioni cerebrali con alto ingrandimento e alta risoluzione. Quindi, selezionare Tile Scan nel software di acquisizione per coprire l'area di interesse, che copre tutti i dendriti e i processi assonali. Acquisisci un numero sufficiente di pile sull'asse Z per evitare la perdita di informazioni.

Successivamente, apri l'immagine e seleziona l'opzione linea segmentata dal menu. Traccia una linea seguendo la struttura del neurone. Successivamente, vai su Analizza, Strumenti, seguito da ROI manager, quindi Aggiungi per salvare la riga.

Ripetere questo processo per ogni assone o dendrite del neurone analizzato. Nel menu ROI Manager, premi Misura per ottenere la lunghezza. Esporta le misurazioni in un file di testo o in un foglio di calcolo per l'analisi.

Per eseguire una registrazione del neurone espresso da GFP da un topo elettroporato GFP, posizionare il cervello in un piatto di coltura refrigerato. Taglia il cervelletto con piccole forbici. Quindi raccogli il cervello con una spatola e asciugalo su un tovagliolo di carta.

Incolla il piano caudale ventrale del cervello su un supporto per vibratomo. Posizionare il supporto su un vibratomo riempito con ACSF ghiacciato e assicurarsi che la camera del vibratomo abbia una carbogenazione continua. Successivamente, ottenere fette acute tagliando sezioni coronali di 300 micrometri entro 15 minuti.

Quindi, incubare le fette acute a 25 gradi Celsius per almeno 60 minuti in ACSF mentre bolle con carbogen. Dopo 60 minuti, trasferire una fetta nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur o un pennellino. Tenere premuta la fetta con un'arpa e cospargerla di ACSF a una velocità di due millilitri al minuto.

Per applicare il patch a un neurone positivo alla GFP, individuare l'area di interesse attraverso il microscopio a 10x. Quindi trova una cellula positiva alla GFP utilizzando l'obiettivo 60x. Quindi, riempire l'elettrodo di registrazione con una soluzione intracellulare.

Successivamente, inserire una pipetta di vetro nel portapipetta. Successivamente, posizionare la punta della pipetta nella vasca da bagno e concentrarsi sulla punta. Una volta che la pipetta è nel bagno, applicare una pressione positiva attraverso il sistema di controllo della contropressione.

Avvicinarsi alla cellula di interesse sotto guida visiva mantenendo la contropressione nella pipetta. Alla comparsa di una piccola fossetta sulla superficie della cella, rilasciare la pressione. A questo punto, si può formare una tenuta ermetica con una resistenza superiore a un giga-ohm.

In caso contrario, applicare una leggera pressione negativa per facilitarlo. Durante la formazione della guarnizione, portare la pinza di tensione di mantenimento a 60 millivolt. Una volta formata la tenuta giga-ohm, applicare un impulso di aspirazione per rompere la membrana cellulare e irrompere nell'intera modalità cella.

Una volta che è in modalità cella intera, passa dalla modalità pinza di tensione alla modalità pinza di corrente e avvia la registrazione. Queste immagini mostrano la consegna di vettori ai neuroni di strato 2/3 mediante elettroporazione in utero al giorno 15.5 embrionale e le sezioni coronali sono state preparate al giorno 16 post-natale. Il vettore CAG DsRed2 è stato cotrasfettato come controllo.

La GFP è espressa solo in quei neuroni che incorporano anche cre, permettendo la ricombinazione dei siti LoxP nel vettore GFP CALNL. Ecco un'immagine confocale ad alto ingrandimento degli arbori dendritici di un altro neurone GFP scarsamente marcato. Si tratta di un neurone piramidale elettroporato con GFP che è stato osservato in campi luminosi e in condizioni di fluorescenza verde.

Ecco una tipica risposta di picco regolare di un neurone di controllo elettroporato CAG-GFP allo strato 2/3. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per le elettroporazioni in utero e mezza giornata per la registrazione del patch clamp se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire l'intervento il più velocemente possibile per ridurre lo stress della madre e aumentare le possibilità di sopravvivenza dei cuccioli.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'espressione per rispondere a ulteriori domande, come la relazione tra l'espressione di geni specifici e la loro influenza nello sviluppo del surrogato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze dello sviluppo per esplorare la connettività e la morfologia dei neuroni nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'operazione in utero per descrivere la struttura e la connettività dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni marcati in fluorescenza.