Name: Diagnostica di romanzo in artroplastica di Revisione: sonicazione e reazione a catena multipla della polimerasi dellimpianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Scopri la diagnostica differenziale nelle infezioni periprotesiche con aspirazione articolare, PCR multiplex e sonicazione. Questi metodi forniscono risultati microbiologici rapidi per chirurghi ortopedici, migliorando la gestione clinica.

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Gli autori vorrei ringraziare Curetis GmbH per sostenere questo studio.

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (046/09, Rev. 3). Consenso informato e informativa sulla privacy sono stati ottenuti da tutti i pazienti inclusi.
1. comune aspirazione
Nota: La procedura deve essere eseguita in un teatro chirurgico o un intervento con condizioni asettiche comparabili. Assistenza da un infermiere o assistenza di medico è utile ma non obbligatorio.
<ol><li>Posizionare il paziente in posizione supina su un letto di esame. Assicurarsi che il giunto di interesse sia privo di abbigliamento. Accorciare il corpo denso o lunghi capelli usando tagliatori elettrici. Non rimuovere i peli con un rasoio. Se l'articolazione dell'anca è quello di essere perforato, posizionare un fluoroscopio in direzione antero-posteriore. Se il ginocchio deve essere perforato, posizionare una bobina di ginocchio sotto al ginocchio del paziente, tale che il ginocchio si riposa in una posizione leggermente flessa13.</li>
	<li>Preparare un tavolo per strumenti con la seguente attrezzatura sterile: tamponi sterili, un telino fenestrato telo sterile, un bisturi sterile monouso, lama chirurgica appuntita (tipo #11) e siringa sterile da 10 mL con cannula sterile (20 gauge, 80 mm). Stabiliti separatamente disinfettante alcolico pelle, prelievo di sangue e un matraccio di cultura del sangue pediatrici.</li>
	<li>Vestito in un abito chirurgico, il cappuccio e la maschera e indossare guanti sterili.</li>
	<li>Lavare accuratamente la pelle del paziente presso il sito di puntura (p.e. superior recessus14 per l'area del portale anterolateral e del ginocchio per l'anca) con un disinfettante della pelle. Nota: Mente il tempo di esposizione necessario per il disinfettante usato (solitamente 90 s al ginocchio, 120 s all'anca per disinfettanti alcolici).</li>
	<li>
Coprire il sito di puntura con un telo di copertura sterile fenestrato. Identificare il sito di puntura. Nota: Per il ginocchio, il sito corretto è 2 cm sopra il polo superiore della rotula e laterale di 2 cm al faccetta laterale. Per l'anca, trovare la spina dorsale iliaca superiore anteriore e spostare caudalmente fino a quando non è in linea con la sinfisi superiore. Assicurarsi che il sito sia laterale all'arteria femorale (circa 4 cm), che può sempre essere palpato15.<ol>
<li>Fare una piccola incisione attraverso la pelle (3-4 mm largo e profondo) con la lama del bisturi aguzzo presso il sito di puntura. Non applicare anestetici locali in quanto possono causare falsi negativi nella coltura microbiologica, dovuto il loro effetto batteriostatico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collegare la cannula allo slip Luer della siringa. Inserire la cannula attraverso l'incisione lo stab. Al vano superiore dell'articolazione del ginocchio, mirare a un angolo di 45° dorsale e mediale, verso l'incavo sotto il polo superiore della rotula e inserire l'ago ad una profondità di circa 5 cm. aspirato il liquido articolare disegnando su pistone della siringa.
	<ol>
<li>Utilizzare informazioni aggiuntive fluoroscopio quando perforando un giunto di anca. Inserire l'ago nel sito di puntura, mirando medialmente ad un angolo di 60°. Nel fluoroscopio, assicurarsi che la punta dell'ago è puntata al collo di protesi. Fare avanzare la cannula ad una profondità di circa 8 cm (più profondo in pazienti adiposi) mentre ad aspirazione, fino a quando il liquido sinoviale è raggiunto. Tenere l'ago in posizione durante l'aspirazione, per evitare di raschiare la superficie della protesi. Nota: Contatto della punta dell'ago con la protesi garantisce un posizionamento intra-articolare. Di solito, non più di 5 mL di liquido può essere aspirato forma un giunto di anca, un giunto di ginocchio produrrà più di 10 mL.</li>
		<li>Dopo la rimozione della cannula, applicare una medicazione sterile per l'incisione. Per evitare la formazione di ematoma, applicare una benda alla gamba con leggera compressione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire l'aspirato congiunto raccolto nei contenitori del campione. Garantire sterili tecniche di lavorazione in tutto.
	<ol>
<li>Per inoculazione del matraccio di cultura del sangue pediatrici con il liquido aspirato congiunto, disinfettare la membrana del matraccio di cultura del sangue pediatrici con disinfettante alcolico. Mettere una cannula fresca sulla siringa e iniettare 1 a 3 mL di liquido aspirato congiunta il matraccio di cultura del sangue. Mescolare di agitazione o rotazione dolce16.</li>
		<li>Per la preparazione di un esemplare aspirato comune nativo, è necessario rimuovere la cannula dalla siringa. Aprire una provetta senza additivi e iniettare 1 mL di aspirato in questo tubo di raccolta. Riposizionare e fissare il coperchio per l'analisi di PCR. Nota: Spedire il campione al laboratorio di microbiologia senza indugio per l'analisi di PCR. Dallo stesso campione, colture microbiologiche convenzionali di aerobiche ed anaerobiche possono anche istituire17.</li>
		<li>Trasferimento da 1 a 4 mL di aspirato congiunto in una provetta contenente EDTA per conteggio e la differenziazione di cellula2. Spedire il campione ad un laboratorio di biochimica senza alcun ritardo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PCR diagnostica
<ol><li>Assicurarsi che tutti e tre i dispositivi (il lysator, l'analizzatore e il cockpit; Vedi la tabella materiali) sono installato e funzionante correttamente. Indicate tutte le forniture necessarie per l'esecuzione del test (la cartuccia PCR, un tubo di mix master, la provetta con il campione e cappuccio del tubo di campione, uno 0 - 200 micropipetta µ l e Puntali sterili) sul banco di lavoro.</li>
	<li>Scongelare il tubo mix master prima di iniziare la procedura, fissando a temperatura ambiente. Tutti i consumabili (provetta master mix, cartuccia e provetta) sono già prelabeled con un codice a barre.</li>
	<li>Rimuovere il tappo della provetta del campione. Prendere 180 µ l di campione raccolto (congiunta aspirato, vedere la sezione 1; o fluido di sonicazione, vedere la sezione 4) con una pipetta e trasferimento nel campione di tubo. Chiudere la provetta con il tappo del tubo di campione contenente proteine chinasi K e un gene di controllo interno per il controllo di qualità di tutto il workflow.</li>
	<li>Presso il cockpit, aprire il software operativo toccando il "nuovo test" pulsante in basso a sinistra. Immettere i dati del paziente o un ID campione tramite il touchscreen. Per selezionare il campione, prima scegli "ITI-cartuccia" dal menu a discesa, quindi "ortopedia" come modalità di applicazione e infine selezionare "liquido sinoviale" o "sonicazione fluido" come tipo di campione. Premere il pulsante start.</li>
	<li>Eseguire la scansione del codice a barre sul fondo della provetta del campione. Inserire la provetta con il campione del lysator. Nota: Il processo di lisi verrà avviato automaticamente e vorranno circa 30 minuti alla fine. Conto alla rovescia del timer sullo schermo lysator indicherà quando è terminata la lisi.</li>
	<li>Selezionare il campione sullo schermo di pozzetto per sbloccare la provetta con il campione dalla lysator. Rimuovere il tubo di campionamento dalla lysator e chiudere il coperchio superiore di lysator. Trasferimento nella provetta nello slot campione tubo della cartuccia PCR. Inserire il tubo di mastermix scongelati nello slot mastermix della cartuccia PCR.</li>
	<li>Seguire le istruzioni sul monitor del pozzetto, la cartuccia PCR con tubo mastermix e campione di scansione.</li>
	<li>Inserire la cartuccia PCR cartuccia indicata nello slot dell'analizzatore. Al termine dell'operazione, l'analizzatore rilascia la cartuccia. Nota: Le condizioni PCR sono preimpostate dal costruttore e non possono essere modificate dall'utente. Per ulteriori informazioni vedere Guida all'applicazione del produttore. Il processo PCR inizierà automaticamente e prendere circa 4 h e 10 min.</li>
	<li>Rimuovere e scartare la cartuccia. Il touchscreen di pozzetto, a scegliere "attuale test" in basso a sinistra, quindi scegliere l'ID corretto campione per visualizzare i risultati del test. Salvare i risultati sulla memoria della macchina e stampare o esportare (tramite drive USB) per ulteriore riferimento. Nota: Riportare il risultato della PCR, compreso l'identificazione dell'agente patogeno e individuazione di marcatori di resistenza, al chirurgo senza indugio. Un pannello con 114 acido deossiribonucleico (DNA) target di patogeni batterici e fungini trovato tipicamente in infezioni di protesi e infezioni dei tessuti molli, insieme con i marcatori di resistenza agli antibiotici più comuni sono analizzati.</li>
</ol>3. intervento chirurgico: Intraoperative campionario
Nota: Intervento di artroplastica di revisione richiede un livello di esperti di abilità e competenze; per una panoramica completa delle procedure chirurgiche, fare riferimento al libri di testo18 di chirurgo. Una descrizione completa e dettagliata della procedura chirurgica sarebbe ben oltre la portata di questo articolo. Qui il focus è sui dettagli della raccolta del campione e pre-analisi. Nell'intervento di artroplastica di revisione, astenersi dalla somministrazione di una profilassi antibiotica colpo singola, come non a compromettere i risultati dei campioni microbiologici ottenuti durante la chirurgia. Aderendo a questa regola è consigliato, anche se questa pratica è discutibile19,20. Utilizzare il metodo chirurgico esistente per il giunto quando possibile. Gli approcci chirurgici supplementari saranno danneggiare tessuti molli e aumentare la formazione della cicatrice.
<ol><li>Sezionare il tessuto fino a quando la capsula articolare è ben esposta. Eseguire l'artrotomia con una siringa a portata di mano, così ulteriormente sinoviale possa essere raccolti nella siringa sterile per ulteriori analisi come indicato in precedenza (punti 1.7.1-1.7.3). Nota: Nessun fluidi di lavaggio antisettico devono essere utilizzati fino a quando l'impianto viene rimosso e sono stati prelevati campioni di tessuto.</li>
	<li>Rimuovere la protesi articolari. Immediatamente dopo la rimozione, è possibile trasferire le parti di impianto in un contenitore sterile di plastica con un coperchio a tenuta d'aria e acqua. Nota: Istruzioni dettagliate per la rimozione dell'impianto possono essere trovate nella letteratura libro libro di testo (ginocchio, per esempio: Wirtz et al., capitolo 16.421; Anca, per esempio: Claes et al., capitolo 14.5.122). Strumenti specifici possono essere necessari, come indicato dalle istruzioni dei costruttori. La tecnica di rimozione dell'impianto varia considerevolmente tra impianto diversi tipi e metodi di fissazione. Un set di scalpelli e punte, un martello scorrevole e un set di rimozione del chiodo intramidollare universale sono utile nella rimozione di impianti integrati ossuta23,24.</li>
	<li>Utilizzare un curette tagliente sterili, pinze e Pinza ossivora per rimuovere i tessuti a membrana dall'interfaccia osso-impianto. Trasferire un campione rappresentativo del tessuto in un contenitore sterile di plastica con coperchio a vite, come campioni per microbiologia e l'istologia. Nota: Un alesatore può essere utilizzato per cancellare il canale midollare di tutti i tessuti molli. Inoltre, prendere il tessuto sinoviale e capsula articolari campioni per esami e conservarli in contenitori sterili. Almeno quattro esemplari in totale devono essere raccolti.</li>
	<li>Inviare istantaneamente tutte le parti espiantati e i campioni al laboratorio di microbiologia. Nota: Gli antibiotici quindi possono essere dato. La scelta degli antibiotici corretti è essenziale e deve essere una decisione individuale25,26. Concetti terapeutici devono essere decisa da un gruppo interdisciplinare di chirurghi e microbiologi in anticipo.</li>
	<li>Completare lo sbrigliamento del sito implantare ex rimuovendo qualsiasi tessuto che mostra segni di detriti (ad esempio usura del polietilene, metallo o particelle di cemento) o infezione e necrosi (tessuti purulenti, avascolare, rivestite con fibrina, membranosi o "sludge metal"). Rimuovere qualsiasi osso morto o osteitic. Rimuovere tutti i materiali estranei come viti, fili, cerchiaggi, detriti di cemento osseo o suture non riassorbibili (vedi Claes et al., capitolo 14.5.322).</li>
	<li>Irrigare il sito chirurgico utilizzando un disinfettante di ferita di scelta utilizzando una siringa da 50 mL. Irrigare con abbondanti quantità (almeno 3 L) di soluzione di ringer con un sistema di lavaggio pulsato. Un distanziatore può essere necessario per stabilizzare il comune27.</li>
	<li>Chiudere la ferita usando rivestite con antimicrobico suture riassorbibili profonde per la capsula o la gronda (polyglactin intrecciato suture, rivestite con triclosan, USP 2) e il tessuto sottocutaneo (suture polyglactin intrecciato, rivestite con triclosan, USP 0). Chiudere la pelle usando i suturare interrotti non-resorbing (monofilic polipropilene, USP 0 o USP 2-0).</li>
</ol>4. sonicazione
Nota: Fare attenzione a lavorare strettamente asetticamente. Utilizzare una panchina di sicurezza biologica di classe II con flusso d'aria laminare per l'ulteriore elaborazione del materiale espiantato.
<ol><li>Aprire il contenitore di plastica che tiene la protesi explanted dalla sala operatoria (Vedi punto 3.2) sotto un banco di lavoro di flusso d'aria laminare e aggiungere soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% fino a quando il corpo estraneo explanted è coperto almeno 80% (circa 500-800 mL).</li>
	<li>Chiudere il contenitore di plastica. Agitare accuratamente o agitare il contenitore di plastica usando un miscelatore vortex su ad alta intensità per 30 s. trasferimento del contenitore in plastica nel bagno di sonicazione. Controllare il livello del liquido nel bagno di sonicazione. Nota: Il livello del liquido bagno sonicazione deve essere lo stesso all'interno del contenitore di plastica. Assicurarsi che il contenitore di plastica non può essere allagato e se necessario, aggiunta o rimuovere il liquido dal bagno di sonicazione.</li>
	<li>Sonicare il campione per 5 minuti con una frequenza di 40 ± 2 kHz e potenza densità 0.22 ± 0,04 W/cm2. Frullato o vortice il campione accuratamente per 30 s. Nota: Tempi di sonicazione tra 1-5 min sono migliori per la dissoluzione del biofilm, senza alcuna influenza su vitalità batterica28.</li>
	<li>All'interno del banco di flusso laminare, raccogliere 50 mL del fluido sonicazione e trasferirlo in una provetta sterile, ermeticamente chiusi.</li>
	<li>Per creare un fluido concentrato sonicazione, centrifugare la provetta per 10 min a 4.200 g. x lasciando un volume residuo di 10 mL, scartare il surnatante con una pipetta rimanente. Risospendere il pellet di pipettaggio e Vortex.</li>
	<li>Inoculare idonei terreni di coltura (per esempio agar sangue, agar cioccolato, Sabouraud agar, agar di Schaedler, agar kanamicina-vancomicina o brodo tioglicolato) con 0,5 mL di sonicazione concentrato fluido ogni. Inoculare il matraccio di cultura del sangue pediatrici con 2 mL come descritto in precedenza (Vedi punto 1.7.1). Trasferire 1 mL di fluido concentrato sonicazione in una provetta senza additivi per l'analisi di PCR.</li>
	<li>Trasferire i terreni di coltura inoculato nell'incubatore (35 ° C, 5% CO2). Incubare le colture per 14 giorni e controllare la crescita ogni giorno.</li>
	<li>Dopo 14 giorni, scartare le culture senza crescita e relazione come negativo. Se viene rilevata la crescita, eseguire l'identificazione dell'agente patogeno utilizzando tecniche standard d'identificazione ed antibiogramma. Segnalare il risultato al chirurgo senza indugio. Nota: Qui, identificazione di patogeni è stato effettuato utilizzando Matrix-assisted LASER detezione/ionizzazione - time della spettroscopia di volo (MALDI-TOF). Test di suscettibilità antimicrobica è stata eseguita con un analizzatore semiautomatica29,30,31.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Corpo estraneo l'infezione è un problema emergente in Ortopedia e traumatologia con trattamento costoso, lungo ricovero in ospedale e deficit funzionale delle articolazioni colpite. La diagnostica differenziale è impegnativa. Molti ricercatori e clinici stanno dando attenzione a questo argomento, cercando di trovare più precisi e metodi affidabili per la diagnosi di corpo estraneo infezioni nosocomiali. Fin qui, molti strumenti diagnostici diversi vengono attuate nella diagnostica percorso32.
La procedura di sonicazione è un metodo prezioso, che mostrano una sensibilità migliore rispetto le colture convenzionali da campioni di tessuto6. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che le colture del liquido sonicazione hanno una sensibilità di 88,9% con una specificità pari al 61,5%. Le colture convenzionali da campioni di tessuto e misto aspira entrambi ha avuto una sensibilità di 66,7% con una specificità di 82,3% e 84,6%, rispettivamente. Altri ricercatori mostrano risultati simili per queste procedure microbiologiche convenzionali6,33,34,35. Si è spesso criticato che procedura di sonicazione è incline alla contaminazione, quindi dovrà prestare particolare attenzione nella manipolazione dei campioni.
La possibilità di rilevare il DNA di un agente patogeno causativo in campioni di tessuto o liquidi è intrigante. NAT è una procedura rapida che può fornire risultati entro un paio d'ore, rispetto ad i metodi di coltura microbiologica che richiede tempo. Senza dubbio, NAT ha una buona sensibilità nel rilevare gli agenti patogeni, ma tenere il rischio di rilevare contaminanti, così carente di specificità36. Il grande vantaggio di questa tecnica PCR nella diagnosi di PJI è stato documentato soprattutto in pazienti che hanno ricevuto terapia antibiotica vicino alla chirurgia o per un più lungo periodo7,8. Gli studi suggeriscono che NAT del fluido di sonicazione può aumentare ulteriormente la sensibilità e specificità37. Purtroppo, questa tecnica non è normalmente disponibile nei laboratori, a causa del suo flusso di lavoro che richiede tempo.
Ci sono alcune limitazioni per la tecnica PCR in generale: NAT rileva DNA senza differenziazione tra batteri vitali e non vitali, rendendo difficile l'interpretazione dei risultati. Vasto-gamma PCR rileverà solo acido ribonucleico ribosomiale 16S (16S rRNA), non distinguendo tra agenti patogeni37. Più specifici sistemi ordinariamente non rilevare marcatori di resistenza antibiotica codificata dal gene. Una terapia antibiotica mirata può quindi essere limitata senza ulteriore test di suscettibilità.
Il sistema applicato in questo studio supera alcune di queste limitazioni, differenziando tra batteri specifici e identificazione di marcatori di resistenza gene-codificati. Nel complesso, saggi di NAT possono essere considerati come una complementazione veloce e utile per confermare PJI7,8,9,38.
È necessario pianificare in anticipo in aspirazione comune ed in chirurgia: contenitori per campioni devono essere sterile e pronto, e trasporto richiesta campione devono essere disponibile. I chirurghi dovrebbero breve loro microbiologi su previste procedure e cosa materiale aspettarsi campione. Quando eseguire l'aspirazione comune, condizioni rigorosamente sterile deve essere assicurata, per prevenire l'infezione iatrogenica del giunto. In pazienti adiposi, puntura congiunta può essere impegnativa e guida fluoroscopica può essere utile. Intervento di artroplastica di revisione richiede un altissimo livello di competenza e deve essere eseguita solo da un chirurgo esperto. Explanted materiale non dovrebbe essere tenuto nella sala operatoria più del necessario, ma essere inviato per il microbiologo appena possibile. Una parte molto critica all'interno di questo protocollo è il potenziale rischio di contaminazione. Non solo durante la raccolta dei campioni, ma anche durante la manipolazione dei campioni al laboratorio di microbiologia, tutto il personale coinvolto (chirurgo ortopedico, infermieri, tecnici, microbiologi) devono lavorare rapidamente e con precisione e avere una formazione adeguata nelle procedure.
Sonicazione e NAT sono strumenti importanti nella diagnosi di infezioni associate all'impianto. Tuttavia, i risultati dovrebbero essere interrogati sempre con attenzione. Si consiglia di discutere i risultati in una tavola rotonda di chirurghi ortopedici, microbiologi e specialisti in malattie infettive e patologi per concordare la strategia terapeutica individualizzata.
Per implementare questa tecnica della diagnostica percorso di PJI può avere diversi vantaggi. È una diagnosi rapida con un risultato entro ore. A causa l'analisi di diversi marcatori di resistenza gene codificato, una terapia antibiotica mirata può avvenire in una fase molto precoce nel decorso clinico. Come effetto collaterale, gli antibiotici di vasto-gamma possono essere salvati per le indicazioni di cui sono veramente necessari. Altri tipi di campioni (ad es. gli esemplari del tessuto, tamponi, ematoma, ecc.) possono anche essere studiati secondo il nostro protocollo. Poiché la cartuccia PCR è un sistema chiuso, non risoluzione dei problemi è necessario o possibile sul lato utente. Qualsiasi adattamento del protocollo deve essere implementata dal produttore. Cambiamenti nel software e hardware (cartuccia) sono continuamente fatti dal produttore per migliorare il sistema, tuttavia nessuna informazione sono resi pubblica nelle modifiche esatte nelle versioni più recenti.

Arthroplasties doloroso sono una sfida diagnostica in chirurgia ortopedica. Dopo mobilizzazione asettica, PJI è il secondo maggior motivo per fallimento dell'impianto e presenta una complicazione devastante dopo l'intervento di artroplastica. PJI è difficile da diagnosticare e difficile da trattare. Mancata diagnosi di un risultato probabile di volontà PJI nell'infezione ricorrente, con morbilità maggiore, perdita della funzione e la perdita della qualità di vita. Pertanto, infezione dovrebbe essere esclusa in tutti i pazienti che presentano con arthroplasty doloroso, prima vengono avviate misure terapeutiche.
Storia del paziente, esame clinico, l'esame del sangue per CRP e numero di globuli bianchi, così come radiografia o szintigraphy dell'articolazione colpita costituiscono la diagnostica di base1. La routine preoperatoria dovrebbe includere anche un'aspirazione comune in condizioni sterili, ove possibile. L'aspirato ha acquisito è un materiale molto prezioso nella ulteriore diagnostica.
Oltre al conteggio delle cellule e differenziazione cellulare in comune aspirato come analisi consolidata2, l'individuazione di biomarcatori di proteina può aiutare nella diagnostica differenziale3,4,5. Coltura microbiologica convenzionale resta il gold standard nel rilevamento del patogeno. Biofilm, causate da batteri Gram-positivi e Gram-negativi sia aderente alle superfici dell'impianto, sono un importante fattore patogeno in PJI. Pertanto, nel 2007, la procedura di sonicazione è stata implementata nel sistema diagnostico di stranieri associata al corpo infezioni in chirurgia ortopedica, interrompendo il biofilm su impianti rimossi per consentire il rilevamento del patogeno. I batteri sono quindi ripresi dalla loro forma che riposa alla forma attiva, rendendo l'individuazione nella cultura possibili. Sonicazione di impianti rimossi ha mostrato una sensibilità maggiore rispetto culture da tessuto esemplari (78,5% vs 60,8%)6.
Test di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), come la PCR, si è recentemente trasferita nella portata dei clinici ed i microbiologi per diagnosticare PJI. Particolarmente in pazienti che hanno ricevuto terapia antibiotica prima dell'intervento, è stato indicato che la PCR diagnostica è utile nell'identificare gli organismi causativi7,8,9. Ultimamente, è stato introdotto un nuovo sistema multiplex PCR, appositamente progettato per infezioni dell'impianto e dei tessuti (ITI). Questo sistema basato su cartuccia offre una varietà di marcatori genomici per l'identificazione di agenti patogeni e marcatori di resistenza agli antibiotici. Tra la sua gamma di applicazione sono numerose indicazioni (infezioni protesiche articolari, infezioni del sito chirurgico, infezioni correlate a cardiology, infezioni catetere-associate, infezioni del piede diabetico, profonda della pelle e infezioni dei tessuti molli, impiantare infezioni, e ferita da ustione infezioni), e un ampio panel di materiale campione può essere utilizzato per questa tecnica (sonicazione liquido, liquido sinoviale, tamponi, tessuto, pus, aspirato/essudato e biofilm)10,11,12.
È il più grande vantaggio della procedura, rispetto ai convenzionale microbiologia, velocità: l'agente patogeno causativo possa essere identificato entro ore. Inoltre, questo sistema PCR rileva un ampio panel di marcatori di resistenza gene-codificati, permettendo l'inizio della terapia antibiotica mirata all'inizio. Con l'assistenza di PCR, i chirurghi possono essere in grado di distinguere tra pazienti infetti e non infetti in una fase molto precoce nella procedura diagnostica11. Qui, presentiamo il protocollo per eseguire questo multiplex PCR, diagnosticare rapidamente PJI da aspirato congiunta e fluido di sonicazione.

<table><tbody><tr><td>contenitore di plastica sterile&nbsp;</td><td>Blocca & Serratura, Distributore ISI GmbH, Solingen, Germania</td><td>EAN 8803733184403</td><td>Contenitore di trasporto per impianti</td></tr><tr><td>Bactosonic 14.2&nbsp;</td><td>Bactosonic, Bandelin, Berlino, Germania</td><td>3290</td> <td>"Macchina per la sonicazione"</td></tr> <tr><td>Provette Falcon da 50 ml</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per emocoltura media PEDS per centrifugazione&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>442194</td><td>terreno di coltura</td></tr><tr><td>Columbia agar con il 5% di sangue di pecora</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254071</td><td>cultura medium</td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254078</td><td>cultura medio</td></tr><tr><td>cioccolato agar&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254089</td><td>cultura media</td></tr><tr><td>sabouraud agar</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254096</td><td>brodo</td></tr> di <tr><td>tioglicolato</td> in coltura<td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>221788</td><td>coltura medium</td></tr><tr><td>Schaedler agar</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254084</td><td>coltura terreno</td></tr><tr><td>kanamicina/vancomicina agar</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>254077</td><td>terreno di</td></tr><tr><td>coltura Sistema di coltura del sangue Bactec FX</td><td>Becton & Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>441386/441385</td><td>terreno di coltura</td></tr><tr><td>Unyvero A50 Analyzer</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germania</td><td>60001</td><td>Macchina PCR</td></tr><tr><td>Unyvero L4 Lysator</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germania</td><td>60002</td><td>Macchina PCR</td></tr><tr><td>Unyvero C8 Cockpit</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germania</td><td>60003</td><td>Macchina PCR</td></tr><tr><td>Unyvero M1 Masterix Tube</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germania</td><td>10002</td><td>materiali di consumo PCR</td></tr><tr><td>Unyvero i60 ITI Cartuccia</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germania</td><td>10040</td><td>materiali di consumo PCR</td></tr><tr><td>Unyvero Sample Tube Cap</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10004</td><td>materiali di consumo PCR</td></tr><tr><td>Unyvero Sample Tube</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10003</td><td>materiali di consumo PCR</td></tr><tr><td>S-Monovette 2.7ml</td><td>Sarstedt AG, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>05.1729.001&nbsp;</td><td>Contenitore per il trasporto (aspirare)</td></tr><tr><td>bisturi tipo 11</td><td>pfm medical, Colonia, Germania</td><td></td><td>200130011 bisturi per incisione a pugnalata</td></tr><tr><td>PP Contenitore 70mL 55x45mm</td><td>Sarstedt AG, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>759.922.721</td><td>Contenitore di trasporto (campione di tessuto)</td></tr><tr><td>Vicryl Plus</td><td>Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germania</td><td>VCP247H</td><td>materiale per suture chirurgiche</td></tr><tr><td>Prolene 0</td><td>Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germania</td><td>EH7920H</td><td>materiale per sutura chirurgica</td></tr><tr><td>Prolene 2/0</td><td>Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Germania, Norderstedt, Germania</td><td>EH7697H</td><td>materiale di sutura chirurgica</td></tr><tr><td>Kodan&nbsp; Tinktur forte farblos</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH, Norderstedt, Germania</td><td>104005</td><td>disinfettante alcolico per la pelle</td></tr></tbody></table>

diagnostica di romanzo in artroplastica di revisione: sonicazione e reazione a catena multipla della polimerasi dell'impianto

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Nei pazienti ortopedici, straniere associata al corpo infezioni, infezioni articolari soprattutto periprosthetic (PJIs), sono una complicazione devastante di arthroplasty. L'infezione richiede un trattamento complesso, può comportare costi notevoli lungo ricovero in ospedale e le cause. Revisioni chirurgiche multiple possono essere necessarie in questi pazienti, con una perdita in funzione così come nella qualità della vita.
La routine diagnostica preoperative include l'esame del sangue per proteina C - reattiva (CRP) e altri biomarcatori, nonché analisi congiunta aspirato per conteggio delle cellule, la differenziazione e la cultura. Intraoperative esemplari per istologia e microbiologia sono anche procedura standard. L'esame microbiologico di impianti rimossi con sonicazione, in combinazione con l'implementazione di tecniche di biologia molecolare in microbiologia, rappresentano due nuove tecniche attualmente impiegate per migliorare la diagnostica differenziale di PJI.
Presentiamo qui la procedura graduale di analisi congiunta aspirato e fluido di sonicazione, utilizzando un sistema di reazione a catena (PCR) basati su cartuccia multipla della polimerasi. Risultati sono stati confrontati con le colture convenzionali e criteri di consenso per PJI. Le colture microbiologiche convenzionali da biopsie dei tessuti, comune aspirato e fluido di sonicazione ha mostrato una sensibilità di 66,7%, 66,7% e 88,9%, rispettivamente e una specificità di 82,3%, 54,6% e 61,5%, rispettivamente. La PCR diagnostica del liquido sonicazione e il liquido sinoviale ha mostrato una sensibilità del 50,0% e 55,6%, rispettivamente e sia una specificità di 100.0%. Sia la diagnostica PCR combinata ha avuto una sensibilità di 66,7% e una specificità di 100.0%. La PCR multiplex rappresenta pertanto uno strumento diagnostico rapido con sensibilità moderata ma alta specificità nella diagnosi di PJI.

Presenza di un PJI, come definito dalla riunione di consenso di società l'infezione osteomuscolare (MSIS), è stata considerata provata quando un criteri maggiori o almeno tre su cinque criteri minori erano presenti. Criteri maggiori includono la presenza di una fistola o l'individuazione di un agente patogeno in due campioni microbiologici separati. Criteri minori comprendono il conteggio delle cellule positive (> 3.000 leucociti / µ l) o differenziazione delle cellule positive (> 85% granulociti neutrofili) in comune aspirato, tasso positivo di CRP e sedimentazione nel sangue campioni, l'istologia positiva in campioni di tessuto o rilevamento di un agente patogeno in un solo campione microbiologico19. Sensibilità e specificità sono state calcolate per test di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), rispetto ai MSIS gold standard. Dati del paziente, compresi i patogeni rilevati, sono riportati nella tabella 1.
Nostri risultati hanno mostrato una moderata sensibilità per la PCR diagnostica di sonicazione fluido e congiunta aspirato (50,0% e 55,6%) ma una specificità molto forte di 100%11. Ogni volta che PCR diagnostica (Totale n = 62 test) ha mostrato un risultato positivo in aspirato congiunto (n = 31) o il fluido di sonicazione (n = 31), l'agente patogeno stesso è stato rilevato più successivamente in una delle colture microbiologiche convenzionali. La PCR dei campioni differenti di casi di infezione non ha mostrati nessun falso positivo risultato (Vedi Figura 1).
La PCR diagnostica non è riuscito a rilevare alcuni agenti patogeni che sono state dimostrate con metodi di coltura microbiologica convenzionale. agenti patogeni vero 6 su 16 (37,0%) in campioni di liquido di sonicazione e 5 su 13 (38,0%) patogeni dalla comune cultura fluido sono stati mancati tramite rilevazione di PCR. Principalmente, la diagnostica PCR mancato rilevamento di stafilococchi coagulasi-negativi (8 su 11). La diagnostica PCR combinata di entrambi i materiali (liquido articolare aspirato e sonicazione, "pool PCR") identificato correttamente 12 su 18 casi di infezione (sensibilità 66,7%, 95% CI: 41,0% a 86,7%, Vedi tabella 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55147/55147fig1.jpg"> Figura 1: Risultati di riepilogo di NAT. Il grafico mostra i risultati riassunti dei campioni collettivi. Sul lato destro è il gruppo di pazienti PJI coincidenti, sul lato sinistro è il gruppo che non ha fatto. Le barre rappresentano i metodi di amplificazione dell'acido nucleico. Falsi positivi e falsi negativi sono mostrati in rosso come percentuale del totale. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55147/55147fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Giunto</td>
			<td>Causa di Revisione</td>
			<td>Partite MSIS criteri?</td>
			<td>Precedente trattamento antibiotico?</td>
			<td>Coltura fluida sonicazione</td>
			<td>Cultura comune aspirato</td>
			<td>Cultura di sonicazione NAT</td>
			<td>Aspirato congiunta NAT</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>Dermabacter hominis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>Xyli Aquatica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>instabilità</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>lussazione cronica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>Stafilococco haemolyticus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>mobilizzazione asettica</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>instabilità</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td></td>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Corynebakterium spp.</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td>Stafilococco aureus</td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Streptococco agalacticae</td>
			<td>Streptococco agalacticae</td>
			<td>Streptococco agalacticae</td>
			<td>Streptococco agalacticae</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td></td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Staphlococcu epidermidis</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td></td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione acuta</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td></td>
			<td>Linfonodi epidermidis</td>
			<td>Stafilococchi coagulasi-negativi Stafilococchi</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td>Stafilococco aureo</td>
			<td></td>
			<td>Stafilococco aureus</td>
		</tr><tr><td>Anca</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>Enterococcus faecialis</td>
			<td>Enterococcus faecialis</td>
			<td>Enterococcus spp.</td>
			<td>Enterococcus spp.</td>
		</tr><tr><td>Al ginocchio</td>
			<td>infezione cronica</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Enterocuccus faecalis</td>
			<td>Enterocuccus faecalis</td>
			<td>Enterococcus spp.</td>
			<td>Enterococcus spp.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: dati del paziente e agenti patogeni rilevati. Risultati tabulari dei dettagli pazienti, compresa la causa dell'intervento di revisione, i criteri MSIS corrispondenti e gli agenti patogeni rilevati in microbiologia convenzionale e analisi NAAT.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Criteri</td>
			<td>PCR Sonicare</td>
			<td>Aspirato PCR</td>
			<td>PCR in pool</td>
		</tr>
<tr>
<td>Valore di P</td>
			<td>0.0036</td>
			<td>0,0013</td>
			<td>0,0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità</td>
			<td>50.0%</td>
			<td>55,6%</td>
			<td>66,7%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Specificità</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Valore predittivo positivo</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Valore predittivo negativo</td>
			<td>59,1%</td>
			<td>61,9%</td>
			<td>68,4%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: risultati di metodi microbiologici. Tabulare risultati della valutazione della PCR diagnostica del fluido di sonicazione, congiunta aspirato e PCR in pool. N = 31 esemplare per aspirare e sonicazione, rispettivamente, n = 62 per i dati aggregati di PCR.

La diagnostica differenziale in arthroplasty doloroso è cruciale per il successo del trattamento. L'aspirazione unita è effettuata ordinariamente preoperatively. Reazione a catena multipla della polimerasi di aspirato congiunto e il fluido di sonicazione, uno strumento fattibile per il rilevamento rapido agente patogeno da questi campioni è descritto.

Diagnostica di romanzo in artroplastica di Revisione: sonicazione e reazione a catena multipla della polimerasi dell'impianto

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

L'obiettivo generale delle procedure descritte, che includono l'aspirazione articolare, la reazione a catena della polimerasi multiplex e la sonicazione, è fornire risultati microbiologici rapidi e affidabili ai chirurghi ortopedici nei casi di sospetta infezione peri-protesica dell'articolazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo diagnostico e terapeutico dell'infezione peri-protesica dell'articolazione, come l'individuazione precoce dei patogeni e, di conseguenza, l'avvio tempestivo di un trattamento mirato. Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nella rapidità di ottenimento dei risultati.È in grado di accelerare la diagnosi differenziale nei casi di sospetta infezione articolare peri-protesica. Posizionare il paziente in posizione supina su un lettino di visita. Se si deve effettuare una puntura al ginocchio, posizionare un rullo sotto il ginocchio del paziente in modo che il ginocchio si trovi in una posizione leggermente flessa.Utilizzare forbici elettriche per accorciare i peli corporali folti o lunghi. Quindi preparare il tavolo degli strumenti e indossare la tenuta chirurgica secondo il protocollo descritto nel testo. Successivamente, utilizzare un disinfettante per la pelle per lavare accuratamente la cute del paziente nel sito di puntura.Con un telo sterile forato, coprire il sito di puntura. Identificare quindi il sito di puntura attraverso il telo. Utilizzando una lama appuntita di bisturi, praticare una piccola incisione a punta attraverso la cute nel sito di incisione.Collegare la cannula al connettore luer-slip della siringa. Inserire quindi la cannula attraverso l'incisione a punta. Nella cavità superiore dell'articolazione del ginocchio, puntare con un angolo di 45 gradi in direzione dorsale e mediale verso la cavità, al di sotto del polo superiore della rotula, e inserire l'ago a una profondità di circa 5 cm.Aspirare il liquido articolare tirando indietro il pistone della siringa. Per prevenire la formazione di ematomi, applicare una medicazione, seguita da una benda, sull'incisione da puntura. Utilizzare un disinfettante alcolico per disinfettare la membrana di un flacone per emocoltura pediatrica.Quindi applicare una nuova cannula sulla siringa ed iniettare da 1 a 3 mL del liquido articolare aspirato nel flacone. Mescolare con un'agitazione delicata o una rotazione. Per preparare un campione nativo di aspirato articolare, rimuovere la cannula dalla siringa.Quindi aprire un tubo per la raccolta del sangue senza additivi ed iniettare 1 mL di aspirato nel tubo di raccolta. Richiudere e fissare il coperchio per l'analisi PCR. Trasferire da 1 a 4 mL di aspirato articolare in un tubo per la raccolta del sangue contenente EDTA per il conteggio cellulare e la differenziazione.Scongelare il tubo del master mix lasciandolo a temperatura ambiente. Trasferire 180 mcL del campione raccolto nel tubo del campione. Chiudere il tubo del campione con il tappo che contiene la proteina chinasi K e un gene di controllo interno per il controllo di qualità dell'intero flusso di lavoro.Nella postazione di controllo, aprire il software di funzionamento toccando il pulsante Nuovo Test nell'angolo in basso a sinistra. Utilizzare lo schermo tattile per inserire i dati del paziente o un identificativo del campione. Per selezionare il campione dal menu a discesa, scegliere prima ITI Cartridge, quindi Ortopedia come modalità applicativa e infine selezionare Liquido Sinoviale o Liquido di Sonificazione come tipo di campione. Quindi premere il pulsante Avvia.Scansionare il codice a barre situato sul fondo del tubo del campione. Quindi inserire il tubo del campione nel Lysator. Successivamente, selezionare il campione sullo schermo della postazione per sbloccare il tubo del campione dal Lysator.Quindi rimuovere il tubo del campione dal Lysator e chiudere il coperchio superiore del Lysator. Trasferire il tubo del campione nello slot per il tubo del campione della cartuccia PCR. Inserire quindi il tubo del master mix scongelato nello slot del master mix della cartuccia PCR.Seguire le istruzioni sul monitor della strumentazione per scansionare la cartuccia PCR con la miscela master e la provetta del campione. Inserire la cartuccia PCR nello slot per cartucce indicato dell'analizzatore. Sullo schermo tattile della strumentazione, nell'angolo in basso a sinistra, selezionare Test Attivi, quindi scegliere l'ID del campione corretto per visualizzare i risultati del test.Salvare i risultati nella memoria della macchina e stamparli o esportarli per ulteriori riferimenti. Consultare il microbiologo e informarlo sui dettagli del caso, in modo che sia pronto ad analizzare i campioni tempestivamente. Sotto una cappa a flusso laminare, aprire il contenitore di plastica contenente la protesi asportata dalla sala operatoria e aggiungere soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% fino a coprire almeno l'80% del corpo estraneo asportato. Chiudere il contenitore di plastica.Quindi agitare energicamente o mescolare il contenitore di plastica per 30 secondi. Trasferire il contenitore di plastica nel bagno a ultrasuoni. Successivamente, verificare il livello del liquido nel bagno.Sonicare il campione per cinque minuti, con una frequenza di 40 ± 2 chilohertz e una densità di potenza di 0,22 ± 0,04 watt per centimetro quadrato. Successivamente, agitare o vorticare accuratamente il campione per 30 secondi. All'interno della cappa a flusso laminare, raccogliere 50 mL del liquido di sonicazione e trasferirlo in un tubo sterile prima di sigillare ermeticamente il tubo.Per ottenere un fluido concentrato di sonificazione, centrifugare il tubo a 4200 ×g per 10 minuti, lasciando un volume residuo di 10 mL; utilizzare la pipetta per eliminare il soprannatante rimanente. Risospendere il pellet mediante pipettaggio e vortex. Inoculare ogni flacone di terreno di coltura idoneo con 0,5 mL di fluido concentrato di sonificazione.Inoculare il flacone per emocoltura pediatrica con 2 mL di liquido di sonicazione concentrato, come dimostrato in precedenza in questo video. Successivamente, trasferire 1 mL di liquido di sonicazione concentrato in un tubo sterile senza additivi per l'analisi PCR. Trasferire il terreno di coltura inoculato nell'incubatrice.Incubare le colture per 14 giorni e verificare la crescita quotidianamente. La presenza di un'infezione articolare periprotesica è stata considerata dimostrata quando era presente un criterio maggiore oppure almeno tre criteri minori su cinque. I criteri maggiori includono la presenza di una fistola o il rilevamento di un agente patogeno in due campioni microbiologici distinti.I criteri minori includono un conteggio cellulare positivo o una differenziazione cellulare positiva nel liquido articolare prelevato mediante aspirato, un valore positivo di PCR e velocità di eritrosedimentazione nei campioni ematici, un'istologia positiva nei campioni tissutali oppure il rilevamento di un agente patogeno in un solo campione microbiologico. I risultati ottenuti hanno mostrato una sensibilità moderata per la diagnostica PCR del liquido di sonificazione e dell'aspirato articolare, ma una specificità molto elevata del 100%. Ogniqualvolta la PCR ha evidenziato un risultato positivo nell'aspirato articolare o nel liquido di sonificazione, lo stesso agente patogeno è stato successivamente rilevato in una delle colture microbiologiche convenzionali. La PCR eseguita sui diversi campioni provenienti da casi senza infezione non ha mostrato risultati falsamente positivi.Six su 16 veri agenti patogeni nei campioni di liquido di sonicazione e cinque su 13 agenti patogeni provenienti dalla coltura del liquido articolare sono stati non rilevati dalla rilevazione PCR. La diagnostica PCR combinata di entrambi i materiali, liquido di artrocentesi e liquido di sonicazione, ha identificato correttamente 12 casi su 18 di infezione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come migliorare il vostro percorso diagnostico nell'infezione articolare periprotetica.È possibile osservare quanto sia fondamentale una stretta collaborazione tra microbiologi e chirurghi ortopedici per migliorare al massimo le diagnosi differenziali. Se eseguita correttamente, questa procedura fornirà risultati clinicamente utili entro cinque ore dal prelievo articolare, grazie alla PCR multiplex basata su cartucce. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre condizioni sterili in ogni fase del processo.Non dimenticare che lavorare con campioni di tessuto umano o campioni microbiologici può essere estremamente pericoloso. Tutte le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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