Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido
20 gennaio 2017
proteine effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di svelare le strategie virulente e i sistemi patogeni dell'ospite identificando l'interazione di una proteina del malefattore del fitoplasma candidatus con le proteine dell'ospite del malus domestica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in molti campi di ricerca biologica ed è qui utilizzato nella ricerca sulle piante per chiarire i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo della malattia della proliferazione delle mele. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un singolo effettore patogeno può essere sottoposto a screening rispetto a migliaia di potenziali interattori, rendendo questo metodo un punto di partenza facilmente fattibile nella ricerca sulle infezioni.
Per iniziare, identifica gli alberi infetti con sintomi specifici della proliferazione delle mele e controlla gli alberi privi di sintomi. Usando cesoie pulite, tagliare campioni di radice da tre diversi siti dell'apparato radicale che hanno un diametro di 0,5 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. Posizionare i campioni di radice in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati.
Quindi posizionare i campioni in una scatola fredda con impacchi termici refrigerati e conservarli a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Sciacquare i campioni di radice con acqua per rimuovere il terreno. Quindi trasferire i campioni in una capsula di Petri sterile e utilizzare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide della radice e la corteccia.
Con un fazzoletto pulito e privo di lanugine, pulisci il bisturi. Quindi immergere lo strumento in etanolo al 70% e sterilizzarlo a caldo su una fiamma libera. Usa il bisturi per graffiare il floema.
Tagliare il campione in piccoli pezzi e aliquotare 30-100 milligrammi di pezzi in una provetta di reazione sterile da due millilitri. Conservare i campioni a 80 gradi Celsius o utilizzarli immediatamente per isolare il DNA, che funge da modello per l'amplificazione del gene effettore e la successiva clonazione dell'effettore nel vettore esca. Dopo aver isolato il DNA polispecifico del fitoplasma da alberi infetti, la clonazione in vettori esca e il test per l'autoattivazione e l'espressione secondo il protocollo di testo.
L'effettore Streak plex A ATP 00189 ha trasformato NMY51 su una piastra SD-trp fresca e lo ha coltivato a 30 gradi Celsius per due o tre giorni fino alla comparsa di colonie rosse. Utilizzare una colonia rossa dalla piastra di agar per inoculare tre millilitri di terreno SD-trp in un piccolo pallone di agitazione e incubare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 120-150 rotazioni al minuto. Il giorno seguente, con un millilitro di coltura notturna, inoculare 20 millilitri di SD-trp in un pallone agitatore e lasciarlo crescere per otto ore.
Utilizzare il terreno SD-trp per regolare la coltura su un OD600 di 0,2 e, con dieci millilitri di coltura, inoculare due fiasche contenenti 100 millilitri ciascuna di terreno SD-trp. Incubare le colture a 30 gradi Celsius agitando durante la notte. Quindi, misurare l'OD600 della coltura e pellettare 120 unità OD600.
Ad esempio, se viene misurato un OD600 di 1,2, ridurre 100 millilitri di campione, scartare il surnatante e utilizzare 800 millilitri di 2xYPAD preriscaldato per risospendere il pellet in due fiasche di agitazione e incubare a 30 gradi Celsius. Incubare la coltura del lievito a 30 gradi Celsius e 120-150 rotazioni al minuto. Misurare l'OD600 circa ogni 1,5 ore secondo il protocollo di testo fino a raggiungere un OD600 di 0,6.
Dopo aver preparato il DNA dello sperma di salmone, il Te Lithium OAc e il PEG Lithium OAc secondo il protocollo di testo, centrifugare 800 millilitri di coltura di lievito a 700 x G per cinque minuti per pellettare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in un totale di 200 millilitri di acqua sterile a doppia distillazione. Quindi pellettare nuovamente le celle e scartare il surnatante.
Risospendere il pellet in 16 millilitri di miscela di Te Lithium OAc e far girare nuovamente il campione. Quindi, dopo aver scartato il surnatante, utilizzare 9,6 millilitri di Te Lithium OAc per risospendere il pellet. In recipienti di reazione di dimensioni adeguate, preparare dodici fiale con sette microgrammi di vettore della libreria di DNA Add HAC di picco, 100 microlitri di DNA spermatico di salmone al 2% e 2,5 millilitri di miscela PEG Lithium OAc.
Aggiungere 600 microlitri della sospensione di cellule di lievito precedentemente preparata a ciascuna delle dodici fiale e mescolare energicamente per un minuto. Quindi incubare le reazioni in un bagnomaria a 30 gradi Celsius per 45 minuti, mescolando ogni 15 minuti. Quindi, aggiungere 160 microlitri di DMSO a ogni fiala e mescolare energicamente.
Quindi incubare le fiale a 42 gradi Celsius per altri 20 minuti. Dopo aver pellettato le cellule, scartare il surnatante e utilizzare tre millilitri di 2xYPAD per risospendere ogni pellet. Riunire le cellule di tutte e dodici le fiale in un pallone shaker da 100 millilitri e incubare il lievito per 90 minuti a 30 gradi Celsius e 120 rotazioni al minuto.
Dopo l'incubazione, dopo aver pellettato le cellule e scartato il surnatante, utilizzare una pipetta sierologica da dieci millilitri e 4,5 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per risospendere completamente il pellet pipettando accuratamente su e giù. Prelevare 50 microlitri dalla sospensione e utilizzare cloruro di sodio allo 0,9% per preparare diluizioni decuplicate da 1:10 fino a 1:1000. Quindi impiattare 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di Petri da 90 millimetri contenenti agar SD-trp-leu.
Stendere il resto della sospensione di lievito non diluito su piastre di Petri di diametro 16x150 millimetri con agar SD-trp-leu-His-ade. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni per le piastre SD-trp-leu e per quattro giorni per le piastre SD-trp-leu-his-ade. Determinare l'efficienza della trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre di selezione SD-trp-leu.
Trasferire ogni clone utilizzando una punta di pipetta sterile per prelevare e striare la colonia su piastre selettive SD-trp-leu-his-ade fresche. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore. Ripetere il trasferimento dei cloni ogni giorno fino a raggiungere un totale di cinque passaggi.
Per analizzare i cloni, sotto una cappa sterile, preparare una provetta di reazione sterile da due millilitri con un millilitro di SD-trp-leu-his-ade per ogni clone. Utilizzare un ago caldo per praticare un foro in ciascun tubo e utilizzare un sigillante permeabile al gas per coprire il foro. Inoculare ogni fiala con materiale di colonia fresco da un clone e incubare le fiale a 30 gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto per 24 ore.
Dopo aver pellettato le celle e scartato il surnatante, risospendere il pellet nell'apposito tampone e trasferirlo in una nuova provetta di reazione da due millilitri. Aggiungere 100 microlitri di perle di vetro lavate con acido alla sospensione e mescolare energicamente il tubo per cinque minuti. Infine, purificare il DNA plasmidico secondo il protocollo di testo.
Un riassunto dei risultati attesi del saggio di autoattivazione e la loro interpretazione è fornito in questa tabella e figura. Una debole autoattivazione porta alla crescita su trp-leu-his, ma non su piastre di selezione impoverite trp-leu-his-ade. Mentre il lievito trasformato con una forte esca autoattivante crescerebbe su trp-leu-his-ade privo di medium.
Una riuscita cotrasformazione di esche e prede è caratterizzata dalla crescita su placche selettive prive di trp e leu. L'interazione tra l'esca e una proteina della preda porta ad una complementazione dell'ossitrofia di his e ade di NMY51 Qui è mostrato un esempio di interazione tra esca e preda in un esperimento ibrido di lievito 2. I partner di interazione dell'ospite del malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25 sono stati identificati e l'interazione è stata confermata dalla trasformazione del cono denovo con l'effettore.
Una volta padroneggiato, l'ibrido di lievito 2 può essere eseguito in un giorno se tutte le attrezzature e i materiali necessari, in particolare il lievito, sono adeguatamente preparati in anticipo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare la contaminazione e lavorare sempre in condizioni sterili. Dopo questa procedura, è necessario eseguire un altro metodo indipendente, come ad esempio la complementazione bimolecolare a fluorescenza, per confermare le interazioni proteina-proteina trovate.
Ciò è particolarmente importante poiché il lievito o l'ibrido di per sé è relativamente incline a generare risultati falsi positivi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in molti campi di ricerca diversi per comprendere meglio i principi molecolari che coinvolgono le interazioni proteina-proteina, in particolare nelle interazioni ospite-patogeno, e molti altri campi di ricerca biologica. Inoltre, capirai che l'esecuzione di questo metodo è facilmente fattibile in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare decentemente attrezzato.
Non dimenticare che lavorare con determinati prodotti chimici, bisturi e fiamme libere può essere estremamente pericoloso, quindi quando si esegue questa procedura, è sempre necessario considerare alcune precauzioni. Ciò significa utilizzare l'attrezzatura di sicurezza personale come guanti e occhiali protettivi e utilizzare l'attrezzatura di sicurezza generale del laboratorio.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'identificazione delle interazioni proteiche tra una proteina effettrice batterica e proteine dell'ospite in Malus domestica. Utilizzando schermate con il sistema two-hybrid in lievito, i ricercatori possono esplorare i meccanismi molecolari della patogenicità associati alla Malattia della Proliferazione del Melo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Patologia Vegetale
- Interazioni Microbiche
- Biologia Molecolare
Sfondo
- Le proteine effettrici batteriche svolgono un ruolo cruciale nelle infezioni.
- Comprendere queste interazioni può rivelare strategie di virulenza.
- I saggi con lievito bifasico sono efficaci per identificare interazioni proteiche.
- Questo studio si concentra sulle interazioni in un ospite vegetale naturale.
Scopo dello studio
- Identificare i partner di legame di una proteina effettrice batterica.
- Chiarire i meccanismi molecolari della Malattia della Proliferazione del Melo.
- Fornire un metodo per analizzare gli effettori patogeni contro numerosi interattori.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di campioni di radici da alberi infetti e controlli.
- Isolamento del DNA e clonaggio dei geni effettori in vettori esca.
- Trasformazione e coltura di lievito per lo screening delle interazioni.
- Selezione delle colonie e determinazione dell'efficienza di trasfezione.
Risultati principali
- Identificazione riuscita delle interazioni proteiche.
- Stabilimento di un protocollo per lo screening delle proteine effettrici.
- Approfondimenti sulla base molecolare della patogenicità nelle piante.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo in diversi campi biologici.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro solido per lo studio delle interazioni tra effettori.
- L'identificazione di queste interazioni è fondamentale per comprendere le malattie delle piante.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulle dinamiche pianta-patogeno.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale
L'identificazione delle interazioni tra effettori patogeni e proteine dell'ospite fornisce una fondamentale validazione degli obiettivi per strategie antimicrobiche e anti-virulenza. Questo approccio basato sul two-hybrid in lievito consente una riduzione del rischio meccanicistica, rivelando i determinanti molecolari della manipolazione dell'ospite in patogeni non coltivabili. Il metodo supporta i flussi di lavoro della scoperta precoce generando ipotesi verificabili riguardo alla funzione degli effettori e alla modulazione delle vie dell'ospite.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando le interazioni degli effettori sui percorsi dell'ospite coinvolti nella suscettibilità alle malattie.
- Valore operativo: Fornisce un sistema scalabile per prioritizzare gli effettori in base all'intensità dell'interazione e alla rilevanza biologica.
- Valore predittivo: Supporta la valutazione della fiducia nei bersagli collegando l'attività degli effettori a fenotipi misurabili dell'ospite.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sulle interazioni a partire da proteomi complessi dell'ospite, consentendo la standardizzazione dei saggi per campagne di screening di effettori.
- Valore operativo: Stabilisce flussi di lavoro riproducibili per clonaggio, trasformazione e selezione, compatibili con screening a medio rendimento.
- Prontezza del saggio: Produce librerie di prede validate riutilizzabili in più screening di effettori, riducendo la costruzione ridondante di librerie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Identifica le proteine dell'ospite che possono fungere da biomarcatori traduzionali per la gravità dell'infezione o per la modulazione della risposta dell'ospite.
- Valore operativo: Crea sistemi pertinenti alla malattia che collegano i risultati ottenuti in vitro con gli esiti fenotipici in pianta.
- Contenimento del rischio: Consente un de-risking preclinico, verificando se l'interruzione di specifiche interazioni tra effettori e ospite riduce la patogenicità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nelle fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione del capostazione, in particolare per bersagli per i quali la modificabilità genetica è limitata e la mappatura delle interazioni è necessaria per dedurne la funzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando quali vie dell'ospite vengono bersagliate dagli effettori, fornendo informazioni per studi sui meccanismi d'azione.
- Screening: Fornisce dati sull'interazione pronti per saggi che possono guidare lo screening di composti mirati alle interfacce tra effettori e ospite.
- Analisi: Offre letture binarie e semi-quantitative (crescita su terreni selettivi) che permettono il confronto delle intensità di interazione tra diverse varianti di effettori.
- Ricerca traslazionale: Collega le interazioni molecolari a output fenotipici in Malus domestica, sostenendo la continuità dal bersaglio al fenotipo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma Y2H standardizzata che può essere impiegata per molteplici coppie effettore-bersaglio senza dover ridefinire i flussi di lavoro principali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione delle target riducendo la dipendenza esclusivamente dalle previsioni in silico.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di isolamento del DNA, clonaggio e manipolazione del lievito.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati empirici sull'essenzialità degli effettori e sulla dipendenza dell'ospite.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target antimicrobici aggiustata in base al rischio, basata sulla centralità all'interno della rete di interazioni e sulla conservazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in clonaggio molecolare, manipolazione di lieviti e sistemi di marcatori selettivi.
- È subordinato all'accesso a ceppi di lievito, terreni selettivi e infrastrutture di incubazione in grado di mantenere condizioni a 30°C e 42°C.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai controlli di qualità del DNA e ai parametri di efficienza nel clonaggio degli effettori.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si intenda estendere il sistema ad altri ospiti, a causa della compatibilità delle librerie e della variabilità nell'espressione genica.
- Comprende limitazioni pratiche, come i tassi di falsi positivi che richiedono validazione ortogonale e l'incompatibilità delle proteine di membrana nei comuni sistemi Y2H.
