Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di svelare le strategie di virulenza e i sistemi ospite-patogeno identificando l'interazione tra una proteina effettrice di Candidatus Phytoplasma malefactor e le proteine dell'ospite provenienti da Malus domestica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi settori della ricerca biologica ed è qui applicato alla ricerca vegetale per chiarire i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo della Malattia della Proliferazione del Melo. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di analizzare un singolo effettore del patogeno contro migliaia di potenziali interattori, rendendo questo approccio un punto di partenza facilmente realizzabile nella ricerca sulle infezioni.

Per iniziare, identificare gli alberi infetti che presentano sintomi specifici della Proliferazione del Melo e alberi di controllo privi di sintomi. Utilizzando forbici da potatura pulite, prelevare campioni di radice da tre siti diversi del sistema radicale con un diametro compreso tra 0,5 e 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. Collocare i campioni di radice in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati.

Quindi posizionare i campioni in una scatola fredda con pacchetti termici refrigerati e conservarli a quattro gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione. Sciacquare i campioni di radice con acqua per rimuovere il terreno. Successivamente, trasferire i campioni in una piastra di Petri sterile e utilizzare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide e il cortex radicale.

Con un fazzoletto pulito e privo di pelucchi, pulire il bisturi. Quindi immergere lo strumento in etanolo al 70% e sterilizzarlo a fiamma libera. Utilizzare il bisturi per graffiare il floema.

Tagliare il campione in piccoli pezzi e aliquotare da 30 a 100 milligrammi dei pezzi in una provetta sterile da due millilitri. Conservare i campioni a 80 gradi Celsius oppure utilizzarli immediatamente per isolare il DNA, che funge da stampo per l'amplificazione del gene effettore e il successivo clonaggio dell'effettore nel vettore esca. Dopo aver isolato il DNA polispecifico del fitoplasma da alberi infetti, clonarlo nei vettori esca e verificarne l'autoattivazione e l'espressione secondo il protocollo descritto nel testo.

Streakare il ceppo effettore plex A ATP 00189 trasformato NMY51 su una piastra SD-trp fresca e coltivarlo a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino a quando compaiono colonie rosse. Utilizzare una colonia rossa dalla piastra di agar per inoculare tre millilitri di mezzo SD-trp in un piccolo flacone da agitazione e incubare la coltura tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 120-150 giri al minuto. Il giorno seguente, con un millilitro della coltura notturna, inoculare 20 millilitri di SD-trp in un flacone da agitazione e lasciar crescere per otto ore.

Utilizzare mezzo SD-trp per aggiustare la coltura a un OD600 di 0,2 e inoculare due beute contenenti ciascuna 100 millilitri di mezzo SD-trp con dieci millilitri della coltura. Incubare le colture a 30 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Successivamente, misurare l'OD600 della coltura e pellettizzare 120 unità di OD600.

Ad esempio, se si misura un OD600 di 1,2, centrifugare 100 millilitri di campione, scartare il soprannatante ed usare 800 millilitri di 2xYPAD preriscaldato per risospendere il pellet in due fiaschi da agitazione, quindi incubare a 30 gradi Celsius. Incubare la coltura di lievito a 30 gradi Celsius e 120-150 rotazioni al minuto. Misurare l'OD600 ogni circa 1,5 ore seguendo il protocollo indicato nel testo fino a quando non si raggiunge un OD600 di 0,6.

Dopo aver preparato il DNA di sperma di salmone, Te Lithium OAc e PEG Lithium OAc secondo il protocollo descritto nel testo, centrifugare 800 millilitri di coltura di lievito a 700 x G per cinque minuti per ottenere il pellet cellulare. Rimuovere il soprannatante e risospendere i pellet in un totale di 200 millilitri di acqua sterile doppia distillata. Successivamente, pellettare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante.

Risospendere il pellet in 16 millilitri di miscela Te Lithium OAc e centrifugare nuovamente il campione. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet in 9,6 millilitri di Te Lithium OAc. In idonei contenitori per reazione, preparare dodici viali contenenti sette microgrammi del vettore della libreria di DNA Add HAC in picco, 100 microlitri di DNA di sperma di salmone al 2% e 2,5 millilitri di miscela PEG Lithium OAc.

Aggiungere 600 microlitri della sospensione di cellule di lievito precedentemente preparata a ciascuno dei dodici vial e mescolare energeticamente per un minuto. Successivamente, incubare le reazioni in un bagno termostatato a 30 gradi Celsius per 45 minuti, mescolando ogni 15 minuti. Poi, aggiungere 160 microlitri di DMSO a ogni vial e mescolare vigorosamente.

Quindi incubare le provette a 42 gradi Celsius per ulteriori 20 minuti. Dopo la centrifugazione delle cellule, eliminare il soprannatante e utilizzare tre millilitri di 2xYPAD per risospendere ogni pellet. Riunire le cellule provenienti da tutte e dodici le provette in un matraccio da 100 millilitri e incubare il lievito per 90 minuti a 30 gradi Celsius e 120 rotazioni al minuto.

Al termine dell'incubazione, dopo aver centrifugato le cellule e aver eliminato il sopranatante, utilizzare una pipetta sierologica da dieci millilitri e 4,5 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per risospendere completamente il pellet, aspirando e dispensando con attenzione più volte. Prelievo di 50 microlitri della sospensione e utilizzo del cloruro di sodio allo 0,9% per preparare diluizioni decrescenti da 1:10 fino a 1:1000. Successivamente, piastrare 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di Petri da 90 millimetri contenenti agar SD-trp-leu.

Spargere il resto della sospensione di lievito non diluita su piastre di Petri di diametro 16x150 millimetri contenenti agar SD-trp-leu-His-ade. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni per le piastre SD-trp-leu e per quattro giorni per le piastre SD-trp-leu-his-ade. Determinare l'efficienza di trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre selettive SD-trp-leu.

Trasferire ogni clone utilizzando una punta sterile di pipetta per prelevare e seminare la colonia su piastre selettive fresche di SD-trp-leu-his-ade. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore. Ripetere il trasferimento dei cloni ogni giorno fino a quando non si raggiunge un totale di cinque passaggi.

Per analizzare le linee cellulari, in condizioni sterili, preparare un tubo da reazione sterile da due millilitri contenente un millilitro di terreno SD-trp-leu-his-ade per ogni linea. Utilizzare un ago caldo per praticare un foro su ciascun tubo e coprirlo con un sigillante permeabile ai gas. Inoculare ogni provetta con materiale fresco di colonia proveniente da una singola linea e incubare le provette a 30 gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto per 24 ore.

Dopo aver centrifugato le cellule e aver scartato il soprannatante, risospendere il pellet nel tampone appropriato e trasferirlo in una nuova provetta da due millilitri. Aggiungere 100 microlitri di perle di vetro lavate con acido alla sospensione e agitare vigorosamente la provetta per cinque minuti. Infine, purificare il DNA plasmidico secondo il protocollo descritto nel testo.

Una sintesi dei risultati previsti del saggio di autoattivazione e della loro interpretazione è fornita in questa tabella e figura. Un'autoattivazione debole determina crescita su piastre selettive trp-leu-his, ma non su piastre selettive trp-leu-his-ade. Mentre lieviti trasformati con un esca fortemente autoattivante crescerebbero in un mezzo privo di trp-leu-his-ade.

Una cotrasformazione riuscita tra esca e preda è caratterizzata dalla crescita su piastre selettive prive di trp e leu. L'interazione tra l'esca e una proteina preda porta al complemento della auxotrofia per his e ade di NMY51. Qui viene mostrato un esempio di interazione tra esca e preda in un esperimento di Two-Hybrid nel Lievito. I partner di interazione dell'ospite malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25, sono stati identificati e l'interazione è stata confermata mediante trasformazione de novo con l'effettore.

Una volta padroneggiato, il test del doppio ibrido in lievito può essere eseguito in un solo giorno, a condizione che tutta l'attrezzatura e i materiali necessari, in particolare il lievito, siano stati adeguatamente preparati in anticipo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale evitare contaminazioni e lavorare sempre in condizioni sterili. Dopo aver seguito questo protocollo, è necessario effettuare un ulteriore metodo indipendente, ad esempio la complementazione bimolecolare della fluorescenza, per confermare le interazioni proteina-proteina individuate.

Questo è particolarmente importante poiché il lievito o l'ibrido di per sé è relativamente incline a generare risultati falsi positivi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in molti diversi settori di ricerca per comprendere meglio i principi molecolari coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, specialmente nelle interazioni ospite-patogeno, e in molti altri campi della ricerca biologica. Inoltre, comprenderai che l'esecuzione di questo metodo è facilmente realizzabile in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare adeguatamente attrezzato.

Non dimenticare che lavorare con determinati prodotti chimici, bisturi e fiamme libere può essere estremamente pericoloso; pertanto, quando si esegue questa procedura, è sempre necessario considerare alcune precauzioni. Ciò significa utilizzare l'equipaggiamento personale di sicurezza, come guanti e occhiali protettivi, e usare l'equipaggiamento generale di sicurezza del laboratorio.