Name: Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Scopri come identificare interazioni proteiche tra un effector batterico e proteine ospiti di Malus domestica utilizzando lo screening doppio ibrido in lievito. Questo metodo rivela i meccanismi molecolari della patogenicità.

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Ringraziamo Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner dal Centro Ricerche Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer da Dualsystems Biotech AG per il supporto tecnico e Julia Strobl per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato svolto come parte del progetto APPL2.0 ed è stato parzialmente finanziato dalla Provincia Autonoma di Bolzano / Bolzano, l&#39;Italia e il Consorzio Mela Alto Adige.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nella schermata Y2H, il potenziale di proteine ​​effettrici è co-espresso con diverse proteine ​​che interagiscono ipotetici (passo 7). Ogni crescita del lievito clone contiene l&#39;esca, ma una (potenzialmente) Interactiano diverso. Le proteine ​​che interagiscono sono codificati in una libreria di cDNA che viene clonato in plasmidi preda. L&#39;esca e la preda plasmidi ciascun codice co-cistronically per una parte di un fattore di trascrizione di lievito. In caso di interazione fisica tra l&#39;esca (effettori) e un interattore plasmidica preda, le due parti del fattore di trascrizione (il dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione) sono uniti, e l&#39;espressione del gene reporter è indotta. Il lievito è in grado di crescere su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Il tipo di libreria di cDNA preda dipende dalla effettore schermati e deve essere scelta di conseguenza. La preda ed esca vettore, così come il ceppo di lievito, devono essere compatibili. In questa schermata, un DNA LexA dominio di legame e l&#39;attivazione di GAL4 Domain sono stati utilizzati come unità di fattore di trascrizione del lievito compatibili. La libreria di cDNA può essere costruito individualmente, su misura, o commercialmente ottenuti. La preparazione della libreria cDNA preda non è parte di questo protocollo. In questo protocollo, un auto-costruito, libreria di cDNA normalizzata dalla RNA di Malus x domestica foglie è stato utilizzato e clonato in PGAD-HA 41. Il effettrici (esca) esprimente il ceppo di lievito è stato trasformato con la libreria preda, e cloni sono stati selezionati su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Per estrarre DNA plasmidico dalle colonie di lievito, un mini kit plasmide DNA basata su colonne per i batteri è raccomandato in combinazione con un passo rottura meccanica con perline di vetro per migliorare lievito lisi (fase 8). In questa purificazione plasmide, l&#39;esca e il vettore preda saranno purificati simultaneamente in concentrazioni relativamente basse. Tuttavia, la quantità di DNA plasmide è sufficiente per identificare il partner di interazione attraverso il sequenziamento ingegnoHout propagazione plasmide prima (fase 8.4). In alternativa, il DNA purificato nel passaggio 8.4 può essere trasformato in competente E. coli e selezionato con la preda resistenza agli antibiotici vettore-mediata (ad esempio, ampicillina l&#39;in caso di PGAD-HA). Il E. coli selezionato colonie portano solo la libreria plasmide PGAD-HA, e ad alto rendimento purificazione plasmide può essere eseguita con questi cloni. La trasformazione di successo di PLEXA-N e PGAD-HA costrutti completa il triptofano e leucina auxotrofia di NMY51. Un&#39;interazione tra l&#39;effettore e una proteina (codificati sulla PGAD-HA) porta all&#39;attivazione del sistema reporter in NMY51 ceppi. Nel caso di auto-attivazione, NMY51 trasformato con l&#39;effettore esprimere Plexa-N in combinazione con il vettore libreria vuota PGAD-HA cresce su piastre selettive privi trp-leu-his-ade, causa l&#39;attivazione indesiderata del sistema reporter NMY51 40. L&#39;auto-attivazione può essere weak e può verificarsi in assenza di trp-leu-la, o l&#39;attivazione può essere forte e caratterizzato da una crescita su piastre trp-Leu-la-ade 41. Auto-attivazione può causare uno sfondo massiccia di cloni falsi positivi nella schermata Y2H vero e proprio. Per evitare questo, deve essere condotto un test di auto-attivazione con l&#39;esca, in cui il vettore effettore esprimente è co-trasformato con il vettore libreria vuota. In questa impostazione sperimentale, l&#39;espressione genica giornalista non deve essere indotta. Se auto-attivazione (cioè, la crescita su piastre selettive) è visibile nella prova, il mezzo può essere integrata con differenti concentrazioni di 3-ammino-1,2,4-triazolo 45 (3-AT). 3-AT è un inibitore della dehydratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), un enzima importante durante istidina biosintesi 46. La supplementazione con 3-AT può ridurre gli effetti deboli di auto-attivazione durante schermi Y2H 47,48. Differenti concentrazioni di 3-AT devono essere testati. In questo protocollo, 1 - 40 mm 3-AT sono stati utilizzati. La concentrazione più bassa che porta alla repressione di auto-attivazione dovrebbe successivamente essere utilizzato nella schermata Y2H. Le piastre selettive del saggio autoattivazione possono essere valutati solo se le piastre SD-trp-leu del co-trasformazione contengono un numero sufficiente di cloni. Come ≥ un&#39;indicazione 500 colonie per 90 mm (diametro) Petri sono sufficienti. Per determinare l&#39;esatto efficienza di trasfezione, si consiglia di preparare diluizioni seriali del lievito co-trasformato e di diffonderli su piastre SD-TRP-Leu. Per ridurre autoattivazione, l&#39;effettore può essere clonato in PLEXA-C, un vettore di espressione esca che fonde il tag LexA al C-terminale della proteina. L&#39;orientamento della Lex-Un tag può attenuare auto-attivazione 24. Tuttavia, non è possibile in ogni caso per ridurre o abolire autoattivazione. La formazione dicolonie rosse o rossastre indica una interazione debole o falso-positivo. Il gene reporter ADE2 di NMY51 viene attivato solo quando si tratta di un&#39;interazione proteina-proteina, che a sua volta blocca l&#39;accumulo di un colorante rosso in questo ceppo di lievito 40. In assenza di una interazione, NMY51 sono rossastra, mentre le colonie trasportano interactors forti sono bianchi. L&#39;osservazione del colore delle colonie sulle piastre di selezione prevede quindi un ulteriore importante suggerimento per giudicare se le rispettive colonie sono interattori TrueType o falsi-positivi. È eventualmente necessario adattare o modificare alcune impostazioni del test rispetto alla natura dell&#39;esca e le caratteristiche di interazione. Ormai, sono stati stabiliti una serie di miglioramenti e di tecniche derivate del Y2H comuni per consentire l&#39;analisi di piuttosto difficili interazioni proteina in diversi sistemi host. Una revisione da Stynen et al. 49 indirizzi di unND descrive i diversi aspetti della Y2H, i suoi miglioramenti e adattamenti, e, quindi, fornisce informazioni utili su come scegliere il saggio di interazione appropriata. schermi Y2H e tecniche derivate si sono ampiamente utilizzati in diversi campi di ricerca, laddove è richiesta l&#39;identificazione di interazioni proteina binari. Anche se i controlli vengono eseguiti critici, come ad esempio i test di auto-attivazione della esca e one-to-one ri-trasformazione delle proteine che interagiscono identificate, il Y2H è incline a produrre falsi risultati 26, 50, 51. Il lievito come modello non è adatto per tutti gli studi di interazione. Lievito non costituisce necessariamente un ambiente cellulare che supporta la modificazione post-traslazionale appropriato e pieghevole per ogni proteina 24. Inoltre, nel contesto Y2H, le proteine ​​sono sovra-espressi, e la loro espressione non è il controlloguidati dal loro promotore naturale. Il Y2H costringe i partner di interazione proteici al nucleo, che non è necessariamente la loro destinazione naturale subcellulare. Le circostanze nativi cellulari di interazione, quindi, non possono essere riflesse dal lievito e possono portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. La maggior parte Y2H si basano sui lieviti auxotrofia complementazione come principio selettivo. Questa selezione nutrizionale è caratterizzato da un&#39;elevata sensibilità, ma a costo di una ridotta selettività rispetto ad altri (ad esempio, cromogenico giornalista) Saggi 49. Se unreducible auto-attivazione (vedi sopra) o altre limitazioni si verificano per un certo effettori, il Y2H non è un test adeguato 25. In Tabella 1 e Figura 1, i risultati attesi del test di auto-attivazione sono dati. L&#39;assenza di interazioni reali (vale a dire, i falsi negativi) può essere causato dalla tossicità della proteina, la proteina traslazionale erratoelaborazione, impedimento sterico dell&#39;interazione, partner di interazione sottorappresentati nella libreria preda, localizzazione di membrana dell&#39;esca, o mancanti componenti necessari per l&#39;interazione 24. Si raccomanda di de novo amplificare il gene intera lunghezza della proteina interagente identificato dal cDNA, subclone in PGAD-HA, ed eseguire un test interazione uno-a-uno, trasformando l&#39;generata PGAD-HA costrutto nel esca esprimono ceppo NMY51. Ciò è necessario in quanto l&#39;interagente osservata presente nella libreria preda potrebbe essere solo un frammento di una proteina più grande. Tuttavia, le informazioni per il rispettivo gene full-length è accessibile solo se considerevole di dati sequenza genomica e trascrittomica è disponibile. Il protocollo di trasformazione per il saggio autoattivazione qui descritto può essere applicato per un tale test uno-a-uno, e l&#39;interazione tra l&#39;esca e l&#39;interagente deve essere riproducibile. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interazioni identificate in una schermata Y2H deve sempre essere confermata da un&#39;altra tecnica indipendente. Questa tecnica indipendente deve essere più vicino alla natura delle interazioni proteina-proteina reale. Nel caso del ATP_00189 phytoplasmal effettrici, l&#39;interazione con i fattori di trascrizione TCP di Malus x domestica è stata verificata in planta con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasti 28 (non fa parte di questo protocollo). Il ATP_00189 proteine ​​effettrici è stato derivato dalla pianta patogeno P. mali. In planta BiFC è stato quindi deciso di verificare le interazioni ATP_00189 con i x domestica fattori di trascrizione Malus precedentemente identificati nel Y2H 28. BiFC è un saggio di interazione proteina-proteina che non richiede la traslocazione subcellulare delle proteine ​​interagenti al nucleo per attivare il sistema reporter &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Inoltre, i in planta di espressione e macchinari modifica imita l&#39;ambiente di interazione naturale tra la effettori batterica impianto nella sua pianta ospite. Tuttavia, uno schermo globale utilizzando BiFC non è fattibile. Ci sono diversi passaggi del protocollo che deve essere affrontato con attenzione. Quando amplificando il gene di interesse (step 4), è importante escludere che i primer si legano al DNA vegetale. Pertanto, il DNA da piante non infette deve essere incluso come controllo negativo. La sequenza del gene di interesse non deve contenere i siti di restrizione EcoRI e SalI che vengono utilizzati per la clonazione direzionale dell&#39;inserto. Se la sequenza contiene questi siti, diversi enzimi di restrizione per la clonazione devono essere scelti. Lievito trasformazione è un metodo centrale durante questo protocollo. efficienza di trasfezione dipende dalla competenza delle cellule di lievito, la vitalità, lo stato di crescita, e la qualità del REAG trasfezioneent 53, 54. Per il protocollo proposto, si consiglia vivamente di utilizzare il lievito dai piatti freschi, non più di due settimane (conservate a 4 ° C) durante l&#39;esecuzione delle trasformazioni. Spesso, la crescita del lievito trasformato è in ritardo quando colture liquide selettivi vengono inoculate con le colonie da vecchie piastre di agar. E &#39;anche utile usare una coltura starter liquido come inoculo per gli esperimenti reali e non utilizzare il lievito direttamente dalla piastra. Bassa efficienza quando transfecting la preda nel lievito esca esprimono può portare alla sottorappresentazione di alcune proteine ​​preda (potenziali Interactiani) e può quindi inclinare l&#39;intero schermo. In questo protocollo, una efficienza di trasfezione di lievito di ~ 150.000 ufc / mg di DNA trasfettato in Y2H ha funzionato bene. Conoscere i difetti e gli svantaggi della tecnica Y2H e interpretare i risultati in modo critico e adeguato è indispensabile per disegnare la correct conclusioni. saggi Y2H ei derivati ​​sono stati utilizzati per molti anni e hanno subito molti miglioramenti e adattamenti in relazione alle differenti caratteristiche esca, la localizzazione subcellulare dell&#39;interazione, i partner di legame attesi, e altri fattori che possono essere richiesti per l&#39;interazione (vedi Y3H 55, 56, 57). Recentemente, sono stati sviluppati schermi Y2H basate su array che consentono l&#39;analisi automatizzata, ad alta produttività di numerose esche contro milioni di prede 58. Il futuro più probabile sta nella automazione e high throughput approcci per questo test per consentire la delucidazione delle vie di segnalazione complessi e interactomi in diversi campi di ricerca.

<html> Lievito schermi a due ibridi (Y2H) sono stati sviluppati circa 27 anni fa 1 e da allora sono stati ampiamente utilizzati in vari campi di determinare specifiche interazioni proteina-proteina 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L&#39;interazione fisica di un effettore batterica con una proteina bersaglio host è spesso il presupposto per la manipolazione funzionale di questo proteina bersaglio. Analizzando queste interazioni si è spostato al centro di molti diversi settori della biologia delle infezioni 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Il principio della schermata Y2H è che l&#39;interazione di due proteine porta alla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale che guida l&#39;espressione di geni reporter. L&#39;effettore noto (la&quot; esca &quot;) è traduzionali fuso al dominio di legame al DNA (DBD) del fattore di trascrizione, e le potenziali partner di interazione (il &quot;preda&quot;) vengono fuse al dominio di attivazione (aD) del rispettivo fattore di trascrizione. Poiché il partner interagenti è noto, una libreria di potenziale interattori è clonati nel cosiddetto &quot;preda-library.&quot; Normalmente, questa libreria è fatta da clonazione cDNA in un apposito preda vettore di espressione plasmidico codificante l&#39;AD che è compatibile con l&#39;esca vettore codificato DBD. Nel caso di una interazione, la fattori di trascrizione ricostituiti inducono l&#39;espressione di geni reporter, che generalmente consentono la selezione crescita del lievito. ilidentificazione di interattori si ottiene sequenziamento del plasmide preda con primer specifici plasmide. I batteri hanno sviluppato diverse strategie per manipolare e sfruttare il metabolismo del loro ospite o di eludere i meccanismi di difesa e secernere molecole effettrici tramite diversi sistemi di secrezione batterici 19, 20, 21. Determinare i partner di legame di questi effettori batterici è dunque il primo passo per identificare il percorso manipolato nell&#39;ospite. Questo porta ad una migliore comprensione dei meccanismi specifici di patogenicità. Schermi Y2H vengono eseguiti per identificare interazioni effettori batterica durante fitoplasmosi, e spesso, Y2H è un primo esperimento cruciale per l&#39;ulteriore caratterizzazione dei meccanismi molecolari di patogenicità nella ricerca fitoplasmi 22, 23. Tuttavia, il riunitoDescrizione hod nella maggior parte delle pubblicazioni è piuttosto scarsa, e queste tecniche sono spesso in outsourcing alle aziende biotech. Per attirare l&#39;attenzione sulla fattibilità di questo metodo, questo protocollo fornisce informazioni passo-passo per identificare i partner di interazione di una molecola effettore batterica nel suo ospite naturale. Nonostante l&#39;ampio uso e l&#39;approccio avanzamento veloce di schermi Y2H, non si deve dimenticare che alcune interazioni non potrebbero verificarsi nel sistema lievito. Ciò è dovuto al fatto che la cellula di lievito viene utilizzato come una sorta di &quot;recipiente di reazione in vivo&quot; con alcune limitazioni biologiche. Diversi autori hanno affrontato i vantaggi e gli svantaggi di Y2H e suoi derivati 11, 24, 25, 26, 27. Considerazioni generali sono, per esempio, che la cellula di lievito potrebbe non fornire la appropriatal&#39;espressione genica, (post) traslazionale, o le condizioni translocational per le rispettive proteine ​​in fase di studio. Questo può portare a risultati falsi negativi nella schermata. Interazioni positive possono a loro volta essere artefatti e potrebbero non verificarsi nella situazione fisica (cioè, nel caso di effettori nell&#39;ospite appropriato). È quindi indispensabile confermare le interazioni del sistema di espressione di lievito eterologa con una prova di interazione indipendente in un sistema biologico più strettamente correlati. In questo studio, sono stati individuati i partner vincolanti del ATP_00189 effettori del patogeno per le piante non coltivabili Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). I risultati forniscono importanti informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dei sintomi della proliferazione mela 28, una malattia che provoca elevate perdite economiche nelle regioni melicoltura colpite in Europa 29.

<table><tbody><tr><td>Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>per preparazione di DNA</td></tr><tr><td>Trisidrossimetilamminometano (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>per terreni e tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>per terreni e tampone</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico Sale disodico (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>per terreni e tampone</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina sale sodico</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>acetato di ammonio.</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Isopropanolo (2-Propanolo)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>RNAsi</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>per la preparazione</td></tr> <tr><td>del DNACloroformio: Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Correzione di bozze Polimerasi (es. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>per la clonazione</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>per la clonazione</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA basato su colonna (es. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>per la clonazione</td></tr> di <tr><td>Kanamicina Solfato</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>per la selezione microbiologica</td></tr><tr><td>3-Ammino-1,2,4-Triazolo (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>per il saggio di autoattivazione</td></tr><tr><td>L-Arginina Monocloridrato&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>L-Isoleucina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-lisina monoidrato</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Metionina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-treonina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Tirosina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-valina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-adenina emisulfato sale&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro poro</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>per filtrazione sterile</td></tr><tr><td>L-istidina monocloridrato</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Leucina&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>L-Triptofano&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>Base di azoto per lieviti&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>D-glucosio monoidrato</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>per colture di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>per la trasformazione dei lieviti</td></tr><tr><td>Acetato di litio diidrato (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>per la trasformazione dei lieviti</td></tr><tr><td>DNA sperma di salmone&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>per la trasformazione del lievito</td></tr><tr><td>Anticorpo contro il tag Lex-A (es. regione di legame del DNA anti-LexA)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>per Western blot</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep kit (es. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>per la purificazione dei plasmidi da lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Perle di vetro lavate con acido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>per la purificazione di plasmidi dal lievito</td></tr><tr><td>Ampicillina Sale sodico</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>per la selezione microbiologica</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>Centrifuga concentratore sottovuoto (es. Concentratore 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>per preparazione DNA</td></tr><tr><td>Vettore esca (es. pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>per Y2H</td></tr><tr><td>Prey vector (es. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>per Y2H</td></tr><tr><td>Control prey vector (es. pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>per Y2H</td></tr><tr><td>Control bait vector (es. pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>per Y2H</td></tr><tr><td>Elettrocompetente E. coli (es. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>per la clonazione</td></tr><tr><td>Ceppo reporter di lievito (NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, es. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>per</td></tr><tr><td>film plastico di paraffina Y2H (es. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>per coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Sigillante permeabile ai gas (es.g. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>per coltura di lieviti</td></tr><tr><td>PCR Cycler (es. T100 Thermal Cycler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>quantitativa PCR Cycler (es.es. CFX96 Touch Real-Time Detection System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td> per microcentrifuga <td>PCR quantitativa</td></tr><tr><td>(es. Centrifuga 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>attrezzatura</td></tr> <tr><td>generale da laboratorioCentrifuga (es. Centrifuga 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>attrezzatura generale di laboratorio</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (priva di DNAsi, RNAsi, proteasi)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>per lavori di PCR e DNA</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Filtro sterile (0,22 &; m; Polietersulfone)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (numero di catalogo europeo)</td><td>per coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Piastre di Petri &Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>per lieviti e colture batteriche</td></tr><tr><td>piastre di Petri &Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>Fotometro (es. Biofotometro)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>Fotometro Cuvette</td><td>di marca</td><td>759015</td><td>per coltura di lievito</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua (es. Bagno d'acqua Memmert WB7</td>)<td>Memmert</td><td>WB7</td><td>per la trasformazione del lievito</td></tr><tr><td>Western Blot Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>diverse</td><td>per la rilevazione</td></tr><tr><td>di proteine dNTP</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>per la clonazione</td></tr><tr><td>di palloni shaker (Erlenmeyer) (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) e tappi in cotone traspirante (es. Duran Erlenmeyer a collo stretto)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>per colture di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento (es GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>per coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Legante per incubatori</td><td></td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>per coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Fabbricatore di ghiaccio (es. Ice Maker IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>attrezzature generali da laboratorio</td></tr><tr><td>0,2 mL, 1,5 mL e 2,0 mL Fiale di reazione (polipropilene)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>attrezzature generali da laboratorio</td></tr><tr><td>Pipette e puntali per pipette monouso (diverse volumine: 10 - 1.000 &; L)</td><td>Eppendorf</td><td>diverse</td><td>attrezzature generali da laboratorio</td></tr><tr><td>Spandiconcime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>per la coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Agitatore a vortice (ad es. MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>attrezzatura generale da laboratorio</td></tr><tr><td>T4-Ligasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>per clonazione</td></tr><tr><td>Frigorifero (4 &deg; C) (es. Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>attrezzature generali da laboratorio</td></tr><tr><td>Congelatore (-20 &deg; C) (es. Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>attrezzatura generale da laboratorio</td></tr><tr><td>Cilindro graduato (es. Marca)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Attrezzature generali di laboratorio</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (es. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>per la coltura di lieviti e batteri</td></tr><tr><td>Pipettatore meccanico (es.es. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>attrezzature da laboratorio</td></tr><tr><td>generiche Cuvette per elettroporazione (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>per la trasformazione</td></tr> <tr><td>dei batteriElectroporator (es. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>per la trasformazione dei batteri</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Gel e Blot (es. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>attrezzature generali</td></tr><tr><td>da laboratorio Provette da centrifuga coniche (polipropilene) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (numero di catalogo europeo)</td>apparecchiature <td>generali</td></tr><tr><td>da laboratorio Provette da centrifuga coniche (polipropilene) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>apparecchiature generali da laboratorio</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>per legatura</td></tr><tr><td>adenosina trifosfato (ATP, ad es. Soluzione ATP (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G (distribuito da Thermo Scientific)</td><td>per la legatura</td></tr><tr><td>Mix di dropout senza istidina, leucina, triptofano e adenina (DO, es. Integratori di terreni sintetici per drop-out di lievito)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>per coltura di lieviti (miscela pronta)</td></tr></tbody></table>

svelare la funzione di un batterica effector da un non-coltivabili fitopatogeni utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Svelare i meccanismi molecolari di manifestazioni della malattia è importante per capire le patologie e lo sviluppo dei sintomi in scienza delle piante. I batteri si sono evoluti diverse strategie per manipolare il loro metabolismo ospite a proprio vantaggio. Questa manipolazione batterica è spesso accoppiato con sviluppo sintomo grave o la morte delle piante colpite. Determinare le molecole batteriche specifici responsabili della manipolazione ospite è diventato un settore importante nella ricerca microbiologica. Dopo l&#39;identificazione di tali molecole batteriche, chiamati &quot;effettori&quot;, è importante chiarire la loro funzione. Un approccio semplice per determinare la funzione di un effettore è individuare partner proteico obbligatorio in ogni suo ospite naturale tramite uno schermo di lievito doppio ibrido (Y2H). Normalmente l&#39;ospite ospita numerosi potenziali partner di legame che non possono essere previsti in misura sufficiente dagli qualsiasi algoritmo in silico. E &#39;quindi la scelta migliore per Perform a schermo con l&#39;ipotetico effettrici contro un&#39;intera biblioteca di proteine ​​ospite espresse. E &#39;particolarmente difficile se l&#39;agente eziologico è incoltivabile come fitoplasmi. Questo protocollo fornisce istruzioni passo-passo per la purificazione del DNA da un impianto di fitoplasma-infettati ospite legnoso, l&#39;amplificazione delle potenzialità effettori, e la successiva identificazione di partner di interazione molecolare della pianta con uno schermo Y2H. Anche se gli schermi Y2H sono comunemente usati, vi è una tendenza a esternalizzare questa tecnica per le aziende biotecnologiche che offrono il servizio Y2H ad un costo. Questo protocollo fornisce istruzioni su come eseguire un Y2H in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare decentemente attrezzata con tecniche di laboratorio standard.

Prima che lo schermo Y2H reale può essere eseguita l&#39;esca deve essere testato per l&#39;auto-attivazione. Questo risultato è ottenuto trasformando il vettore di espressione esca insieme con il vettore libreria preda vuoto e di controllo della crescita su piastre selettive. Per analizzare se la proteina ATP_00189 phytoplasmal è auto-attivazione, il test di auto-attivazione è stata eseguita come descritto nel paragrafo 5. Il plasmide esca è complementare il trp e la preda plasmide il auxotrofia leu di S. cerevisiae NMY51 40. Un successo di co-trasformazione è quindi caratterizzato da una crescita su piastre selettive prive trp e leu. L&#39;interazione dell&#39;esca e una proteina preda porta ad una complementazione del suo e ade auxotrofia di NMY51. Se appare autoattivazione dall&#39;esca in assenza di una interazione, il lievito cresce su piastre selettive prive sua e ade. Forte e debole autoattivazione può verificarsi. Strong autoattivazione dell&#39;esca è caratterizzata da una crescita del lievito co-trasformato on trp-leu-his-ade impoverito piastre di selezione. Debole auto-attivazione porta alla crescita su trp-Leu-la, ma non su TRP-Leu-la-Ade impoverito piastre di selezione. controlli adeguati positivi sono indispensabili per interpretare i risultati del test di auto-attivazione. Una sintesi dei risultati attesi del test di auto-attivazione e la loro interpretazione è fornito nella tabella 1 e visualizzati nella figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di Bait test auto-attivazione di un esca prima di eseguire una schermata Y2H. S. cerevisiae NMY51 è stato co-trasformato con l&#39;interazione esca (PLEX-p53) e prede (PACT-larget) come controllo positivo (pannello di sinistra: ac), una debole auto-attivazione più una preda vuoto library vettore (pannello centrale: df) e un esca non auto-attivazione più un vettore libreria preda vuoto (pannello di destra: gi). Il lievito co-trasformato sono state coltivate su piastre SD prive trp e leu (pannello superiore: a, d, g), trp, leu e il suo (pannello centrale: B, E, H) e trp, leu, la sua e la facciata (in basso pannello: C, F, I). Selezione sul mezzo privo di trp e leu è un controllo positivo per il successo di co-trasformazione, come il vettore esca completa il auxotrofia trp e il vettore preda leu auxotrofia di NMY51 (crescita su SD-TRP-leu). Nel caso di una interazione tra esca e la preda o di un auto-attivazione della esca, l&#39;espressione giornalista di NMY51 sia acceso e completa il suo e ade auxotrofia (crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade). Un debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita su SD-TRP-Leu-suoi piatti (pannello centrale, df). Debole autoattivazione di un&#39;esca deve essere diminuito preventiva per analizzare l&#39;escain una schermata Y2H, ad esempio aggiungendo 3-AT ai mezzi selettivi. esaurimento aminoacidi sono indicate con &quot;-&quot; nel rispettivo nome del supporto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PLEXA-N-atp00189 </td><td> nessuna </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> nessuna </td><td> PGAD-HA </td><td> nessuna crescita </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-N </td><td> nessuna </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-N </td><td> PGAD-HA </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td&gt; colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-p53 </td><td> PACT-larget </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td></tr><tr><td> PLEXA-N-atp00189 </td><td> PGAD-HA </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Risultati attesi in un saggio Self-attivazione esca. La trasformazione di S. cerevisiae NMY51 produce in crescita differenziale su terreni selettivi in base alle caratteristiche di esche co-trasformato e prede. La crescita su piastre selettive stata valutata misurando la trasformazione di diverse combinazioni vettoriali (af) dopo 72 ore di incubazione a 30 ° C. Debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita del lievito su SD-TRP-Leu-la e forte auto-attivazione crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade selezione plates in assenza di un partner di interazione. Il PLEXA-N phytoplasmal codificato effettrici ATP_00189 non presenta auto-attivazione, che si caratterizza per l&#39;incapacità del vettore esca trasformato NMY51 di crescere in assenza del suo e ade. A seconda l&#39;esca, uno schermo Y2H può guadagnare numerosi cloni di lievito che cresce su piastre selettive. Tutti i cloni devono essere analizzati e controllati per eventuali esuberi. Anche se è stata utilizzata una libreria di cDNA normalizzata, è molto probabile che un interactor è rappresentata in molti cloni differenti. A seconda della tecnica di clonazione biblioteca, è anche possibile che solo frammenti del gene completo sono inseriti alcuni vettori preda. È pertanto consigliabile de novo amplificare (da cDNA) e subclone il gene lunghezza della interattore e testare l&#39;interazione in un&#39;analisi Y2H uno-a-uno (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Esempio di una interazione tra Bait and Prey in un esperimento Y2H. Uno schermo lievito doppio ibrido (Y2H) è stata eseguita e plasmidi da cloni Interactiano positivi sono stati purificati. Il vettore preda è stato sequenziato e le Malus domestica x partner di interazione ospite MdTCP24 e MdTCP25 sono stati identificati. Come MdTCP34 controllo negativo (per i quali non è stato identificato interattore nella schermata della libreria Y2H) è stato subclonato in parallelo. I geni di lunghezza completa sono stati amplificati dal cDNA mela, subclonato nel vettore preda (che esprime co-cistronically l&#39;attivazione dominio AD) e de novo co-trasformato con il vettore esca che esprime la ATP_00189 effettori batterica accoppiato al dominio di legame al DNA (BD). Questa figura è presa da 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande</a>versione di questa figura.

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l&#39;identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di svelare le strategie di virulenza e i sistemi ospite-patogeno identificando l'interazione tra una proteina effettrice di Candidatus Phytoplasma malefactor e le proteine dell'ospite provenienti da Malus domestica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi settori della ricerca biologica ed è qui applicato alla ricerca vegetale per chiarire i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo della Malattia della Proliferazione del Melo. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di analizzare un singolo effettore del patogeno contro migliaia di potenziali interattori, rendendo questo approccio un punto di partenza facilmente realizzabile nella ricerca sulle infezioni.Per iniziare, identificare gli alberi infetti che presentano sintomi specifici della Proliferazione del Melo e alberi di controllo privi di sintomi. Utilizzando forbici da potatura pulite, prelevare campioni di radice da tre siti diversi del sistema radicale con un diametro compreso tra 0,5 e 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. Collocare i campioni di radice in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati.Quindi posizionare i campioni in una scatola fredda con pacchetti termici refrigerati e conservarli a quattro gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione. Sciacquare i campioni di radice con acqua per rimuovere il terreno. Successivamente, trasferire i campioni in una piastra di Petri sterile e utilizzare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide e il cortex radicale.Con un fazzoletto pulito e privo di pelucchi, pulire il bisturi. Quindi immergere lo strumento in etanolo al 70% e sterilizzarlo a fiamma libera. Utilizzare il bisturi per graffiare il floema.Tagliare il campione in piccoli pezzi e aliquotare da 30 a 100 milligrammi dei pezzi in una provetta sterile da due millilitri. Conservare i campioni a 80 gradi Celsius oppure utilizzarli immediatamente per isolare il DNA, che funge da stampo per l'amplificazione del gene effettore e il successivo clonaggio dell'effettore nel vettore esca. Dopo aver isolato il DNA polispecifico del fitoplasma da alberi infetti, clonarlo nei vettori esca e verificarne l'autoattivazione e l'espressione secondo il protocollo descritto nel testo.Streakare il ceppo effettore plex A ATP 00189 trasformato NMY51 su una piastra SD-trp fresca e coltivarlo a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino a quando compaiono colonie rosse. Utilizzare una colonia rossa dalla piastra di agar per inoculare tre millilitri di mezzo SD-trp in un piccolo flacone da agitazione e incubare la coltura tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 120-150 giri al minuto. Il giorno seguente, con un millilitro della coltura notturna, inoculare 20 millilitri di SD-trp in un flacone da agitazione e lasciar crescere per otto ore.Utilizzare mezzo SD-trp per aggiustare la coltura a un OD600 di 0,2 e inoculare due beute contenenti ciascuna 100 millilitri di mezzo SD-trp con dieci millilitri della coltura. Incubare le colture a 30 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Successivamente, misurare l'OD600 della coltura e pellettizzare 120 unità di OD600.Ad esempio, se si misura un OD600 di 1,2, centrifugare 100 millilitri di campione, scartare il soprannatante ed usare 800 millilitri di 2xYPAD preriscaldato per risospendere il pellet in due fiaschi da agitazione, quindi incubare a 30 gradi Celsius. Incubare la coltura di lievito a 30 gradi Celsius e 120-150 rotazioni al minuto. Misurare l'OD600 ogni circa 1,5 ore seguendo il protocollo indicato nel testo fino a quando non si raggiunge un OD600 di 0,6.Dopo aver preparato il DNA di sperma di salmone, Te Lithium OAc e PEG Lithium OAc secondo il protocollo descritto nel testo, centrifugare 800 millilitri di coltura di lievito a 700 x G per cinque minuti per ottenere il pellet cellulare. Rimuovere il soprannatante e risospendere i pellet in un totale di 200 millilitri di acqua sterile doppia distillata. Successivamente, pellettare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante.Risospendere il pellet in 16 millilitri di miscela Te Lithium OAc e centrifugare nuovamente il campione. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet in 9,6 millilitri di Te Lithium OAc. In idonei contenitori per reazione, preparare dodici viali contenenti sette microgrammi del vettore della libreria di DNA Add HAC in picco, 100 microlitri di DNA di sperma di salmone al 2% e 2,5 millilitri di miscela PEG Lithium OAc.Aggiungere 600 microlitri della sospensione di cellule di lievito precedentemente preparata a ciascuno dei dodici vial e mescolare energeticamente per un minuto. Successivamente, incubare le reazioni in un bagno termostatato a 30 gradi Celsius per 45 minuti, mescolando ogni 15 minuti. Poi, aggiungere 160 microlitri di DMSO a ogni vial e mescolare vigorosamente.Quindi incubare le provette a 42 gradi Celsius per ulteriori 20 minuti. Dopo la centrifugazione delle cellule, eliminare il soprannatante e utilizzare tre millilitri di 2xYPAD per risospendere ogni pellet. Riunire le cellule provenienti da tutte e dodici le provette in un matraccio da 100 millilitri e incubare il lievito per 90 minuti a 30 gradi Celsius e 120 rotazioni al minuto.Al termine dell'incubazione, dopo aver centrifugato le cellule e aver eliminato il sopranatante, utilizzare una pipetta sierologica da dieci millilitri e 4,5 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per risospendere completamente il pellet, aspirando e dispensando con attenzione più volte. Prelievo di 50 microlitri della sospensione e utilizzo del cloruro di sodio allo 0,9% per preparare diluizioni decrescenti da 1:10 fino a 1:1000. Successivamente, piastrare 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di Petri da 90 millimetri contenenti agar SD-trp-leu.Spargere il resto della sospensione di lievito non diluita su piastre di Petri di diametro 16x150 millimetri contenenti agar SD-trp-leu-His-ade. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni per le piastre SD-trp-leu e per quattro giorni per le piastre SD-trp-leu-his-ade. Determinare l'efficienza di trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre selettive SD-trp-leu.Trasferire ogni clone utilizzando una punta sterile di pipetta per prelevare e seminare la colonia su piastre selettive fresche di SD-trp-leu-his-ade. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore. Ripetere il trasferimento dei cloni ogni giorno fino a quando non si raggiunge un totale di cinque passaggi.Per analizzare le linee cellulari, in condizioni sterili, preparare un tubo da reazione sterile da due millilitri contenente un millilitro di terreno SD-trp-leu-his-ade per ogni linea. Utilizzare un ago caldo per praticare un foro su ciascun tubo e coprirlo con un sigillante permeabile ai gas. Inoculare ogni provetta con materiale fresco di colonia proveniente da una singola linea e incubare le provette a 30 gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto per 24 ore.Dopo aver centrifugato le cellule e aver scartato il soprannatante, risospendere il pellet nel tampone appropriato e trasferirlo in una nuova provetta da due millilitri. Aggiungere 100 microlitri di perle di vetro lavate con acido alla sospensione e agitare vigorosamente la provetta per cinque minuti. Infine, purificare il DNA plasmidico secondo il protocollo descritto nel testo.Una sintesi dei risultati previsti del saggio di autoattivazione e della loro interpretazione è fornita in questa tabella e figura. Un'autoattivazione debole determina crescita su piastre selettive trp-leu-his, ma non su piastre selettive trp-leu-his-ade. Mentre lieviti trasformati con un esca fortemente autoattivante crescerebbero in un mezzo privo di trp-leu-his-ade.Una cotrasformazione riuscita tra esca e preda è caratterizzata dalla crescita su piastre selettive prive di trp e leu. L'interazione tra l'esca e una proteina preda porta al complemento della auxotrofia per his e ade di NMY51. Qui viene mostrato un esempio di interazione tra esca e preda in un esperimento di Two-Hybrid nel Lievito. I partner di interazione dell'ospite malus domestica, MdTCP24 e MdTCP25, sono stati identificati e l'interazione è stata confermata mediante trasformazione de novo con l'effettore.Una volta padroneggiato, il test del doppio ibrido in lievito può essere eseguito in un solo giorno, a condizione che tutta l'attrezzatura e i materiali necessari, in particolare il lievito, siano stati adeguatamente preparati in anticipo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale evitare contaminazioni e lavorare sempre in condizioni sterili. Dopo aver seguito questo protocollo, è necessario effettuare un ulteriore metodo indipendente, ad esempio la complementazione bimolecolare della fluorescenza, per confermare le interazioni proteina-proteina individuate.Questo è particolarmente importante poiché il lievito o l'ibrido di per sé è relativamente incline a generare risultati falsi positivi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in molti diversi settori di ricerca per comprendere meglio i principi molecolari coinvolti nelle interazioni proteina-proteina, specialmente nelle interazioni ospite-patogeno, e in molti altri campi della ricerca biologica. Inoltre, comprenderai che l'esecuzione di questo metodo è facilmente realizzabile in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare adeguatamente attrezzato.Non dimenticare che lavorare con determinati prodotti chimici, bisturi e fiamme libere può essere estremamente pericoloso; pertanto, quando si esegue questa procedura, è sempre necessario considerare alcune precauzioni. Ciò significa utilizzare l'equipaggiamento personale di sicurezza, come guanti e occhiali protettivi, e usare l'equipaggiamento generale di sicurezza del laboratorio.

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