Name: Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Impara a produrre anticorpi terapeutici su scala di laboratorio utilizzando cellule HEK-293 in coltura senza siero. Questo metodo include trasfezione stabile, adattamento al siero e purificazione per cromatografia di affinità.

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La ricerca è stata supportata dall'Università di Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ è stato un dono di Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). Ringraziamo Tihomir S. Dodev per le utili discussioni riguardanti pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

Nota: un adeguato mammiferi vettore di espressione deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui, viene utilizzato un singolo costrutto contenente due cassette di espressione (cioè espressione catena pesante e leggera è guidato dai promotori separate). Trastuzumab catene pesanti e leggere sono stati precedentemente clonati nel vettore. Questo vettore è stato un regalo da Andrew Beavil, ottenuta attraverso un repository plasmide profitto non-per-13. 1. Il recupero e scale-up di vettore DNA NOTA: Vector DNA è stato ricevuto come una cultura pugnalata soft agar in Escherichia coli XL-1 Blue ceppo; vettore trasporta resistenza Hygromycin. <ol><li> Inserire una pugnalata inoculo sterile o ad anello in agar morbido della cultura coltellata poi si depositano su una Luria Bertani (LB) piastra di agar preparata con 75 mg / ml Hygromycin per colonie isolate. Incubare la piastra a 37 ° C per 18-24 ore. </li><li> Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo Terrific (TB) contenente 75 mg / ml Hygromycin. Incubate la cultura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li><li> Utilizzare la cultura durante la notte per preparare uno stock di glicerolo di DNA vettore mescolando delicatamente 800 ml di cultura con 200 ml 80% glicerolo in una provetta Microbank ™ e congelamento a -80 ° C. <ol><li> Aggiungere 100 ml di coltura durante la notte a 100 ml TB contenente 75 ug / ml in un pallone Hygromycin agitatore confuso (cioè 1 / 1.000 diluizione). Incubare la coltura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li></ol></li><li> Dopo cultura durante la notte, estrarre e purificare il DNA in base alle istruzioni del kit di preparazione midi / maxi con la seguente eccezione del fabbricante; durante la fase, eluire o risospendere finale del DNA con acqua (pH 7,0-8,5). </li><li> Controllare la concentrazione e la purezza di DNA da letture di assorbanza a 260 e 280 nm quindi memorizzare DNA a -20 ° C. NOTA: opzionale (altamente consigliato): la sequenza DNA utilizzando primer specifici vettore per confermare l&#39;identità. </li></ol> 2. Trasfezione stabile di cellule HEK-293 <ol><li> Crescere e mantenere HEK-293 cellule (cellule sospensioni) secondo protocolli standard in mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici in beute. Mantenere a 2 x 10 5 cellule / ml e sottocultura ogni quarto giorno. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. NOTA: Le cellule avrebbero dovuto essere in coltura per non meno di 4 giorni e non più di 4 settimane prima della trasfezione. HEK-293 cellule cresciute in monostrati in mezzi di siero contenenti possono anche essere utilizzati per questa procedura. </li><li> Il giorno prima della trasfezione, seme cellule HEK-293 a 3 x 10 5 cellule / ml in pozzetti di una piastra 12 pozzetti in 2 ml di Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) supplementato con siero fetale bovino inattivato al calore 10% ( FBS). Il giorno della trasfezione, controllare che le cellule hanno raggiunto 80-90% di confluenza </li><li> Diluire il DNA e polietilenimmina (PEI) separatamente nel supporto di transfezione poi mescolare insieme.<ol><li> Diluire 1,25 mg vettore DNA per bene (15 mg per 12 pozzi) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Diluire 2,5 ml di 1 mg / ml soluzione PEI (30 microlitri per 12 pozzi, cioè rapporto 1: 2 del DNA a PEI) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere DNA diluito al diluito PEI, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml di DNA / PEI miscela goccia a goccia a ciascun pozzetto della piastra. Oscillare delicatamente la piastra per distribuire la miscela di trasfezione quindi posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. </li><li> Aggiungere 50 ug / ml Hygromycin B per pozzetto e riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 giorni. NOTA: Giorno 10, le cellule non-trasfettate saranno morte e distaccata dalla superficie della piastra, mentre le cellule stabilmente transfettate saranno vitale e attaccato alla piastra. </li><li> Sostituire i supporti in pozzi con1/4 media liberi-siero volume e 3/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 0,5 ml mezzi privi di siero + 1,5 ml DMEM = 7,5% concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 1/2 mezzi privi di siero volume e 1/2 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè mezzi privi di siero 1 ml + 1 ml di DMEM = concentrazione sierica finale 5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 3/4 mezzi privi di siero volume e 1/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 1,5 ml mezzi privi di siero + 0,5 ml DMEM = concentrazione sierica di finale 2,5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 2 ml di mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici (cioè concentrazione sierica di finale 0%) e incubare per 4 giorni. NOTA: Mantenere 50 mg / igromicina B pressione selettiva ml su cellule durante l&#39;adattamento privo di siero. Le cellule adattate ai mezzi privi di siero si staccano dalla superficie dei pozzi e possono raggruppare iSospensione n. Fare riferimento al punto 2.1 per condizioni di coltura con il supplemento aggiuntivo di 50 mg / ml igromicina B. </li><li> Usando una pipetta, delicatamente mescolare le colture in sospensione nelle cellule piastra e piscina da 12 pozzetti in un tubo separato. <ol><li> Utilizzando un emocitometro, enumerare cellule pool e sementi in 30 ml mezzi privo di siero in una beuta a 2 x 10 5 cellule / ml. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. Subculture ed espandere ogni quarto giorno. </li></ol></li><li> Continuare a espandere dimensioni coltura a densità cellulare richiesto per ottenere 10 fiale a 1 x 10 7 cellule / fiale per la crioconservazione in azoto liquido. Congelare le cellule in mezzi privi di siero contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO). NOTA: condizionata supporti contenenti anticorpi possono essere raccolte ad ogni sottocultura di confermare la produzione di proteine ​​o utilizzati per ottimizzare le condizioni di purificazione. Per raccogliere i media condizionata e mantenere le cellule di sottocultura, centrifugare la coltura a300 xg per 5 minuti poi filtrare-sterilizzare surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron. surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C per 1-2 settimane o -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. Large Scale produzione di anticorpi da lotto Erbaiuto Cultura NOTA: La produzione di anticorpi può essere seguita su dal punto 2.11 dove le cellule esistenti vengono espanse per la densità cellulare desiderato in base al volume della cultura overgrow batch per essere messa a punto. Altrimenti, le cellule che sono stati scongelati da crioconservazione iniziano in questa fase, una volta espanso ad una densità cellulare appropriata e volume. Vari supplementi di coltura possono essere utilizzate per ottimizzare la produzione di anticorpi; l&#39;uso di triptone per aumentare la resa degli anticorpi è dimostrato in questo protocollo. <ol><li> Cellule Seed a 2 x 10 5 cellule / ml in 100 ml di mezzi senza siero in due beute (per confrontare i rendimenti di anticorpi provenienti da culture non-integrato e nutrienti integrazioni). Culture a 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt; e 120 giri al minuto. </li><li> Dopo 24 ore, aggiungere triptone ad una concentrazione finale di 0,5% alla cultura nutrienti integrato. Pareggiare il volume della cultura non-integrato con mezzi senza siero. </li><li> Dal giorno 8, eseguire la conta delle cellule delle culture quotidiane utilizzando un emocitometro per monitorare la vitalità cellulare. Raccogliere le sovranatanti una volta la vitalità cellulare è inferiore al 80%. <ol><li> Harvest surnatante mediante centrifugazione delle colture a 3.000 xg per 15 min quindi filtrata-sterilizzare il surnatante (contenente anticorpi) attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare il surnatante a 4 ° C (a breve termine) o congelare a -20 ° C (a lungo termine). </li></ol></li></ol> 4. Anticorpo Purificazione per affinità e cromatografia utilizzo di un cromatografia liquida automatica veloce Protein (FPLC) Sistema NOTA: La seguente procedura può essere generalmente applicata a sistemi più automatizzati. La purificazione può essere eseguita a temperatura ambiente oa 4 ° C (se il sistema FPLC è conservato in una camera fredda).Una serie di test di scouting può essere eseguita per individuare le condizioni ottimali di depurazione tra cui matrice colonna appropriata, tampone, tampone di eluizione e pH vincolante per garantire il massimo recupero di anticorpo purificato dai media condizionati (fare riferimento alla sezione Risultati). Le condizioni ottimali dipendono anticorpi o proteine ​​di essere purificati. Purificazioni sono stati eseguiti su un sistema FPLC automatizzato. Purificazioni state eseguite a temperatura ambiente usando una proteina 5 ml Una colonna. <ol><li> Preparare i seguenti tamponi con acqua ultrapura e regolare il pH consigliato poi filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. <ol><li> Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4 (tampone di legame) mescolando il seguente: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 e 0,001 M KH 2 PO 4. Aggiustare il pH se necessario prima di filtrare il buffer. </li><li> Preparare 500 ml di 0,1 M glicina-HCl pH 2.7 (tampone di eluizione). Regolare il pH prima di filtrare il buffER. </li><li> Preparare 50 ml di 1 M Tris pH (tampone di neutralizzazione) 9.0. </li></ol></li><li> Assicurarsi che tutti i collegamenti di alimentazione e di comunicazione del sistema con il computer sono fatti. I dispositivi devono essere visibili nel modulo &#39;di controllo del sistema&#39; software. Assicurarsi cella UV è impostata a 280 nm di lunghezza d&#39;onda. Opzionale: Calibrare pH-metro se collegato e da utilizzare. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura per lavare il sistema. Spurgare le pompe con una siringa se c&#39;è aria nella tubazione o sospetto di aria nel sistema. Lavare il sistema con acqua mediante operazione manuale tramite il controllore di sistema o tramite un metodo automatizzato. Si osservi che la pressione, conducibilità, tracciamento UV280 e pH rimane costante e che il limite di pressione per la colonna non sia superato secondo le specifiche del produttore. NOTA: Le anomalie possono indicare l&#39;aria o il blocco del sistema che dovrebbe essere affrontato prima di procedere. </li><li> Nel modulo di controllo del sistema, avviare la portata a 1ml / min manualmente tramite pompa A sia carico (bypassando loop del campione) o iniezione (attraverso il campione loop) grado di iniziare a collegare la colonna. tubing sistema Disconnect all&#39;ingresso posizione di colonna e rimuovere il tappo collegato all&#39;ingresso colonna. <ol><li> Permettere all&#39;acqua di fluire dal tubo a gocce sistema superiore della colonna quindi fissare il tubo di sistema alla colonna. Avendo l&#39;ingresso della colonna e raccordo di ingresso traboccante di gocce d&#39;acqua garantisce un collegamento privo di bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Collegare l&#39;uscita della colonna in uscita a valle e verificare tutti i raccordi siano ben fissati. Con la colonna ora collegata al sistema, non superare i limiti di massima pressione e portata come descritto nelle specifiche di colonna. </li><li> Lavare colonna con 5 volumi di colonna (CV) di acqua. Se necessario, continuare a lavare colonna fino a UV280 tracciato si è stabilizzata. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A in Binding Buffer, B in tampone di eluizione e pompa di campionamento in Binding Buffer to riequilibrare il sistema nei buffer corrette. Riempire i tubi di ingresso con il tampone usando PumpWash per il funzionamento manuale. </li><li> Nel modulo del software &#39;Method Editor&#39;, utilizzare il metodo guidata per impostare un metodo di cromatografia di affinità per la colonna che è destinato ad essere utilizzato. NOTA: e sistemi automatizzati di FPLC sono dotati di metodi di pre-riempita con le impostazioni consigliate (cioè della portata e della pressione limite) ed eseguire operazioni in base alla colonna (produttore, matrice e dimensione) selezionati per la purificazione. <ol><li> Utilizzare i seguenti passi di esecuzione per proteina A cromatografia di affinità: <ol><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li><li> campione di carico nella colonna (volume da caricare viene specificato manualmente nel metodo) e raccogliere eluato in un contenitore separato. </li><li> Sistema di lavaggio con 5 CV di tampone Binding raccogli eluato in un contenitore separato. </li><li> colonna eluire con 5 CV isocratic frazionamento con tampone di eluizione e raccogliere campioni anticorpo purificato come frazioni di raccoglitore di frazioni. </li><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li></ol></li></ol></li><li> Una volta che il metodo è stato impostato, specificare il volume di mezzi condizionati da applicare alla colonna e salvare il metodo. NOTA: Il volume specificato nel metodo dovrebbe essere 5-10 ml inferiore al volume reale per evitare l&#39;introduzione di aria durante la corsa del campione. Il volume specificato utilizzato in questo protocollo è 90-120 ml. </li><li> Immergere il tubo della pompa campione nel recipiente contenente il supporto condizionata. </li><li> Preparare un contenitore separato per raccogliere eluato campione attraverso il tubo di uscita specificato. NOTA: E &#39;importante raccogliere l&#39;eluato, nel caso si verifichi un errore durante la corsa o la capacità di legame della colonna viene superata richiede l&#39;eluato per essere riapplicata alla colonna o la purificazione repeated. </li><li> Preparare tubi di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Aggiungere 100 ml di tampone di neutralizzazione per 1 ml volume della frazione. Il sistema FPLC si eluire automaticamente le frazioni nei tubi di raccolta. </li><li> Nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39; del software, aprire il metodo da eseguire. NOTA: Il metodo run è iniziata in una serie di pagine che comprende il controllo delle variabili del metodo, impostazione raccoglitore di frazioni e che definiscono il nome del file risultato e posizione di memorizzazione. </li><li> Fare clic su Start per avviare la corsa. La corsa può essere monitorata nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39;. </li><li> Al completamento della corsa di purificazione, controlla il cromatogramma risultante nel modulo &#39;Evaluation&#39; nel software di sistema. </li><li> Unire tutte le frazioni contenenti proteine ​​in un tubo, lo scambio buffer separato e concentrarsi in PBS utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo con 30 kDa peso molecolare tagliare. Eseguire le fasi di centrifugazione secondo il fornitore diistruzioni. </li><li> Misurare la concentrazione di anticorpi con test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Se un&#39;altra corsa di purificazione deve essere eseguito, il primo il tubo della pompa di campionamento a tampone di legame e ripetere i passaggi 4,9-4,14. </li><li> Al completamento di piste di depurazione, immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura e lavare il sistema e la colonna interpretato nel passaggio 3. </li><li> Immergere A, B e tubo della pompa campione in etanolo e ripetere la procedura di lavaggio 20% per la memorizzazione del sistema e colonna. </li><li> Scollegare la colonna dalla presa a valle e sostituire colonna tappo, quindi scollegare colonna in ingresso e sostituire tappo, ricollegare tubo al sistema. Conservare la colonna a 4 ° C. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Dettagli Questo protocollo transfezione, espressione stabile e la purificazione di un anticorpo terapeutico in cellule HEK-293. espressione stabile di geni anticorpali è il primo passo nel generare una linea cellulare anticorpo-producendo per lo sviluppo e la fabbricazione di un anticorpo terapeutico. Mentre ovariche di criceto cinese (CHO) cellule rimangono la piattaforma espressione di scelta per le proteine ​​terapeutiche, la linea di cellule HEK-293 sta guadagnando importanza con la consapevolezza che le proteine ​​...

Il successo di anticorpi terapeutici continua a guidare notevoli investimenti nello sviluppo di anticorpi come un&#39;onda di terapie di nuova generazione ha inizio. Il mercato degli anticorpi dovrebbe essere rimodellato da frammenti di anticorpi 1, anticorpo-farmaco coniugati 2, anticorpi bispecifici 3 e anticorpi ingegnerizzati con proprietà favorevoli 4. Un&#39;altra classe guadagnando interesse farmaceutico sono biosimilari. Gli anticorpi biosimilari sono &#39;molto simile&#39; replicare i prodotti di un anticorpo terapeutico che ha già ricevuto l&#39;approvazione normativa. Un biosimilare proposto deve essere comparabile con l&#39;anticorpo creatore rispetto alla sua struttura, la funzione, la tossicità animale, la sicurezza e l&#39;efficacia clinica, la farmacocinetica umani (PK), farmacodinamica (PD) e l&#39;immunogenicità 5, 6. L&#39;approvazione RAtes di anticorpi biosimilari sono stati lenti a causa dei rigidi vincoli sulla qualità finale del prodotto. I processi di produzione esatte, come linee cellulari e condizioni di coltura specifici attraverso le fasi di lavorazione finali possono rimanere proprietaria. Inoltre, la produzione di anticorpi comporta intrinsecamente una certa variabilità che può aggiungere alla sfida di produrre un prodotto altamente simile. Una caratterizzazione fisico-chimiche e biofisica completa e il confronto è abbastanza difficile, ma una serie di studi che dimostrano le caratteristiche di anticorpi biosimilari stanno emergendo nella letteratura 7, 8, 9. Generazione di un anticorpo terapeutico inizia con la trasfezione di cellule ospiti di mammifero con un vettore che trasporta i geni per il rispettivo anticorpo. disegno vettoriale, condizioni della linea e di coltura cellulare sono considerazioni chiave per la creazione di exsistema di pressione. Le sequenze di DNA di anticorpi possono essere di provenienza da Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o pubblicazioni di ricerca, tra cui brevetti. Ad esempio, la sequenza di trastuzumab è disponibile attraverso Drug Bank (DB ID: DB00072). La sequenza aminoacidica delle regioni variabili può subire Gene design e di ottimizzazione per la sintesi nella specie ospite desiderati. E &#39;importante per un anticorpo biosimilare che nessuna modifica è finalizzata sequenza amminoacidica. Una volta sintetizzato, geni anticorpali possono essere subclonate nel caso vettore di scelta. anticorpi IgG umane sono costituite da due catene pesanti identiche e due catene leggere identici. Espressione strettamente regolata entrambe le catene è essenziale per la produzione ottimale di proteine IgG eterologa in cellule di mammifero 10. Intra nonché legami disolfuro inter-catena deve essere formato e una serie di modificazioni post-traduzionali devono essere introdotti durante biosintesi delle proteine. Un certo numero di vettori sono disponibili che sono stati progettati specificamente per esprimere geni anticorpali (fare riferimento alla tabella dei materiali). Questi vettori specifici anticorpi di solito esprimono le regioni costanti per catene sia pesanti e leggere in modo che solo le regioni variabili di ogni catena richiedono clonazione. Trasfezione delle cellule con due costrutti indipendenti (co-trasfezione) è l&#39;approccio più comune per la distribuzione di geni pesanti e leggeri a catena-codifica. Cioè, ogni gene è azionato da un proprio promotore e trascritto come catene anticorpali separati prima di essere assemblato nel reticolo endoplasmatico. D&#39;altra parte, vettori multi-cistronic hanno elementi interni voce sito ribosoma (IRES) incorporate che consentono l&#39;espressione di geni multipli come un singolo mRNA trascritto con traduzione consentita dalle regioni interne del mRNA 11. In questo esempio, i geni pesanti e leggere catena codificanti sono accoppiati in un arrangement per ottenere co-espressione di entrambe le catene di anticorpi 10, 12. Mentre le cellule trasfettate producono proteine ​​sufficiente per eseguire un numero limitato di esperimenti, linee cellulari stabilmente transfettate che sono sottoposti a selezione per l&#39;integrazione del genoma possono fornire rese più elevate. Importi proteico superiore consentono sviluppo di saggi relativi alla caratterizzazione in vitro e possono fornire un&#39;indicazione della qualità anticorpi in considerazione per applicazioni a valle come linea cellulare clonale e selezione dei candidati piombo. L&#39;obiettivo di questo articolo è descrivere l&#39;espressione stabile e purificazione di un anticorpo terapeutico prodotta in un sistema di espressione di mammifero. Infatti, questo metodo può essere applicato per l&#39;espressione di un anticorpo biosimilare. Il metodo può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale di anticorpi prima di procedere alla critica, seppur ste tempops di identificare un clone auspicabile per ingrandire fabbricazione scala. Inoltre, questo metodo può essere usato per esprimere altre proteine ​​e non solo anticorpi. Il seguente protocollo dettagliato descrive l&#39;espressione di terapeutica trastuzumab anticorpi. Questa consiste nella preparazione del DNA vettoriale seguita da trasfezione stabile in cellule HEK-293 e purificazione di proteine ​​anticorpi con un metodo cromatografico automatizzato.

<table><tbody><tr><td>Serie di vettori pFUSE</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Geni di anticorpi pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione.</td></tr><tr><td>serie vettoriale mAbXpress</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Geni anticorpali pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione. Fare riferimento a: Jones, M. L. et al. Un metodo per la riformattazione rapida e indipendente dalla legatura di anticorpi monoclonali ricombinanti. J Metodi immunol. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>Vettore pVITRO1</td><td>N/A</td><td>N/A I</td><td>geni degli anticorpi pesanti e leggeri sono guidati ciascuno da un promotore separato in un singolo vettore. Fare riferimento a: Dodev, T. S. et al. Un kit di strumenti per la clonazione rapida e l'espressione di anticorpi ricombinanti. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>Serie di vettori GS</td><td>Lonza</td><td></td><td>Vettore multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto.</td></tr><tr><td>Serie di vettori multi-cistronici 1</td><td>N/A</td><td>N/A Vettore</td><td>multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Li, J. et al. Uno studio comparativo di diversi disegni di vettori per l'espressione nei mammiferi di anticorpi IgG ricombinanti. J Metodi immunol. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Serie di vettori multi-cistronici 2</td><td>N/A</td><td>N/A Vettore</td><td>multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Ho, S. C. et al. Vettori tricistronici mediati da IRES per migliorare la generazione di linee cellulari CHO ad alto contenuto di anticorpi monoclonali. J Biotecnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Vettore di espressione dei mammiferi contenente geni anticorpali trastuzumab con gene di resistenza all'igromicina; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa; è stato un dono di Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Utilizzato per preparare agar LB a basso contenuto di sale contenente 75 &micro; g/ml di igromicina.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Utilizzato per preparare brodo TB a basso contenuto di sale contenente 75 &micro; g/ml di igromicina.</td></tr><tr><td>Glicerolo, BioXtra, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Preparare all'80% con acqua e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep; eluire o risospendere il DNA in acqua (pH 7,0-8,5).</td></tr><tr><td>Linea cellulare FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 adattata alla coltura in sospensione in terreni privi di siero.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Terreni privi di siero appositamente formulati per il mantenimento della linea cellulare 293-F e un'elevata espressione proteica.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Tensioattivo non ionico; pluronico F-68; preparare al 10% in acqua e filtrare-sterilizzare utilizzando 0,22 &mu; m filtro. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale inattivato termicamente</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, MW 25.000&nbsp;</td><td>Poliscienze, Inc.</td><td>23966</td><td>Preparare a 1 mg/ml in acqua. Regolare a pH 7,0 con 1 M di HCl (la soluzione diventa limpida) e sterilizzare con filtro a 0,22 &mu; m filtro. Conservare a -80 C fino all'uso.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Terreno di comunicazione formulato per trasfezione senza siero</td></tr><tr><td>Soluzione di igromicina B</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Triptone (peptone di caseina)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Preparare al 20% in PBS e sterilizzare con filtro utilizzando 0,22 &mu; m filtro. Negozio a 4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 colonna da 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Sistema FPLC automatizzato, che può includere una pompa di campionamento P-960 e un collettore di frazioni Frac-920.</td></tr><tr><td>Glicina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico, monoidrato</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio, sale trisodico diidrato</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Soluzione di Tris-HCl pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Filtri Ultra Centrifughi Amicon (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Utilizzato per tamponare, scambiare e concentrare proteine purificate.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio dell'acido bicinconninico (BCA) Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Sistema BLItz</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>45-5000</td><td>Strumento utilizzato per misure di interferometria a biostrato (BLI).</td></tr><tr><td>Biosensori di proteina A</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide/Bisacrilammide (37,5:1), soluzione al 40%</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Proteina a doppio colore </td><td>Bio-Rad</td><td>standard 1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Garantire il successo della produzione di un anticorpo terapeutico inizia all'inizio del processo di sviluppo. La prima fase è l'espressione vettoriale dei geni anticorpali seguita dalla trasfezione stabile in una linea cellulare adatta. I cloni stabili vengono sottoposti a screening al fine di selezionare quei cloni con le caratteristiche di produzione e crescita desiderate. Si tratta di una fase fondamentale, anche se dispendiosa in termini di tempo. Questo protocollo considera la selezione del vettore e l'approvvigionamento di sequenze anticorpali per l'espressione di un anticorpo terapeutico. I metodi descrivono la preparazione del DNA vettore per la trasfezione stabile di una variante in sospensione della linea cellulare di rene embrionale umano 293 (HEK-293), utilizzando polietilenimmina (PEI). Le cellule vengono trasfettate come cellule aderenti in terreni contenenti siero per massimizzare l'efficienza della trasfezione e successivamente adattate a condizioni prive di siero. La produzione su larga scala, configurata come colture batch overgrow, viene utilizzata per produrre proteine anticorpali che vengono purificate mediante cromatografia di affinità utilizzando uno strumento automatizzato di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC). Le rese di anticorpi prodotte con questo metodo possono fornire proteine sufficienti per iniziare la caratterizzazione iniziale dell'anticorpo. Ciò può includere lo sviluppo di saggi in vitro o la caratterizzazione fisico-chimica per aiutare nel lungo compito di screening clonale per i candidati principali. Questo metodo può essere trasferito allo sviluppo di un sistema di espressione per la produzione di anticorpi biosimilari.

Produzione stabile di trastuzumab per trasfettate cellule HEK-293 è stata confermata mediante interferometria bio-layer (BLI), come illustrato nella figura 1. Una curva standard IgG è stato generato misurando il tasso di legame tra un anticorpo standard di IgG e proteina A biosensore (Figura 1A). Il campione supernatante grezzo viene misurata analogamente, quindi la sua concentrazione interpolati dalla curva standard (Figura 1B). La conc...

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

L'obiettivo generale di questo metodo è sviluppare un sistema di espressione privo di siero ad alto rendimento per la produzione su scala di laboratorio di un anticorpo terapeutico. Questo metodo può affrontare aspetti fondamentali nella progettazione di un sistema di espressione di anticorpi, come la produzione di una linea cellulare stabile, l'aggiunta di supplementi e l'ottimizzazione delle strategie di purificazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la produzione di una linea cellulare stabile adattata a un mezzo privo di siero consentirà di ottenere quantità robuste e riproducibili di anticorpo terapeutico.Per iniziare, coltivare le cellule HEK-293 secondo protocolli standard in un mezzo privo di siero integrato con 0,1% di tensioattivo non ionico, in fiaschi Erlenmeyer. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica a 120 rotazioni al minuto. Mantenere la coltura a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro e sottocoltivare ogni quattro giorni.Il giorno precedente alla trasfezione, seminare le cellule HEK-293 a una concentrazione di tre volte 10 alla quinta cellule per millilitro in pozzetti di una piastra a 12 pozzetti, utilizzando due

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Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

Questo video dimostra una tecnica per studiare la localizzazione in vivo di anticorpi specifici per il tumore in un modello di xenotrapianto tumorale di topo. Dopo l'iniezione sottocutanea di cellule tumorali nei topi per la formazione del tumore, vengono iniettati anticorpi marcati in fluorescenza che si legano ai recettori specifici del tumore, consentendo la valutazione in vivo della localizzazione degli anticorpi tramite imaging.

Una tecnica per valutare la localizzazione in vivo di anticorpi specifici per il tumore

Il video spiega il processo di produzione di anticorpi nelle cellule ospiti dei mammiferi, dall'espressione genica alla secrezione. Coinvolge la trascrizione, la traduzione, il riconoscimento del segnale, il corretto ripiegamento e l'eventuale rilascio nel mezzo extracellulare tramite vescicole secretorie.

Produzione e purificazione di anticorpi ricombinanti da cellule di mammifero

Questo video mostra un test per la purificazione degli anticorpi monoclonali dal fluido di coltura cellulare raccolto da cellule ovariche di criceto cinese. Impiega una resina di vetro porosa con proteina A immobilizzata, che si lega alla regione Fc degli anticorpi nel campione, separandoli efficacemente dai contaminanti. L'uso di un tampone di eluizione a basso pH indebolisce l'interazione, facilitando il recupero degli anticorpi purificati.

Una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali prodotti dalle cellule ovariche di criceto cinese

Il video dimostra un metodo per produrre anticorpi terapeutici utilizzando cellule di mammifero trasfettate stabilmente. L'integrazione di triptone stimola la divisione cellulare, con conseguente crescita eccessiva e sostenendo una maggiore resa anticorpale. Il terreno contenente anticorpi viene raccolto, filtrato e conservato per un ulteriore utilizzo.

Produzione di anticorpi da una coltura di crescita eccessiva in batch di cellule di mammifero trasfettate

Questo video mostra una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante di coltura ottenuto da una coltura cellulare produttrice di anticorpi. Il processo prevede l'utilizzo di una matrice di perle di agarosio reticolate con proteina A coniugata, che immobilizza gli anticorpi nel surnatante sulle perle, consentendo un'efficace separazione dai contaminanti. Applicando un tampone di eluizione a basso pH, l'interazione proteina A-anticorpo viene allentata, facilitando la raccolta...

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

Questo video mostra un metodo per rilevare i ceppi cianobatterici in un campione ambientale utilizzando un chip di microarray di anticorpi. I campioni che trasportano vari batteri interagiscono con gli anticorpi stampati e l'immunocolorazione con anticorpi anti-ceppo cianobatterico marcati con fluorofori rivela la presenza di specifici ceppi cianobatterici attraverso la fluorescenza in punti distinti.

Una tecnica per rilevare i ceppi cianobatterici utilizzando un chip di microarray di anticorpi

La presenza di tossine cianobatteriche nei serbatoi di acqua dolce per il consumo umano è una delle principali preoccupazioni per le autorità di gestione delle acque. Per valutare il rischio di contaminazione dell'acqua, questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione sul campo di ceppi cianobatterici in campioni liquidi e solidi utilizzando un chip di microarray di anticorpi.

Protocollo sperimentale per il rilevamento cianobatteri In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Impara a produrre anticorpi terapeutici su scala di laboratorio utilizzando cellule HEK-293 in coltura senza siero. Questo metodo include trasfezione stabile, adattamento al siero e purificazione per cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

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