Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere un metodo generale per la sintesi di 1,2-azaborine e le sue potenziali applicazioni nella ricerca biomedica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una sintesi certa di composti 1,2-azaborinici, che rappresentano isosteri contenenti boro del diffusissimo motivo benzenico. Il precursore descritto può essere ulteriormente funzionalizzato per ottenere molecole potenzialmente più complesse.

La preparazione di complessi proteici con 1,2-azaborina fornirà alcune indicazioni sulle future applicazioni nella ricerca biomedica. Per iniziare questa procedura, preparare il prodotto ciclizzato come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 14 grammi di palladio su carbonio a questo prodotto preparato in toluene.

Quindi, rimuovere il pallone dalla scatola. Equipaggiare il pallone con un condensatore a riflusso 24/40 essiccato in stufa e preriscaldato con azoto, collegato all'acqua refrigerata. Posizionare il pallone in un bagno d'olio e riscaldare la reazione fino a un riflusso vigoroso a 135 gradi Celsius, sotto agitazione.

Mantenere la reazione in riflusso per 16 ore. Al termine, rimuovere il pallone dal bagno d'olio per far raffreddare la reazione a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, sostituire il condensatore a riflusso con un setto sul pallone di reazione.

Utilizzando una siringa munita di un ago Luer Lock essiccato in stufa, prelevare un'aliquote di 5 millilitri. Trasferire l'aliquote in un tubo NMR con tappo a vite. Analizzare il campione mediante NMR del Boro-11.

Se la reazione è incompleta, trasferire il pallone della reazione in una camera a guanti. Quindi, aggiungere ulteriori tre grammi di palladio su carbonio. Successivamente, rimuovere il pallone dalla camera a guanti.

Montare il pallone con un condensatore di riflusso 24/40 che sia stato purgato con azoto e collegato all'acqua refrigerante. Riscaldare la reazione fino a un riflusso vigoroso a 135 gradi Celsius utilizzando un bagno d'olio, sotto agitazione per 24 ore. Mediante risonanza magnetica nucleare del boro-11, analizzare un'altra aliquota per verificare che la reazione sia completa.

Successivamente, trasferire il pallone della reazione all'interno della camera a guanti. Far passare la miscela di reazione attraverso una colonna per cromatografia flash riempita con salviette di carta. Quindi, raccogliere il filtrato in un pallone da un litro a fondo rotondo dotato di barretta d'agitazione.

Lavare la colonna con 50 millilitri di toluene. Rimuovere il recipiente del filtrato dalla camera a gas inerte e collegarlo a un manifold per vuoto dotato di linea per azoto. Posizionare un bagno ad acqua sotto il pallone e un dewar contenente azoto liquido per trattenere il solvente.

Aprire la valvola del vuoto elevato per iniziare la rimozione di tutti i composti volatili dal filtrato. Successivamente, riportare la miscela di reazione nella camera a gas inerte. Trasferire la miscela in un pallone da 250 millilitri, collo 24/40, precedentemente essiccato in stufa e munito di barretta magnetica.

Risciacquare il residuo della miscela di reazione con diclorometano e trasferirlo nel pallone. Chiudere il pallone con un settum. Trasferire il pallone dalla camera a guanti al manifold sotto vuoto e collegarlo.

Aprire la valvola del vuoto spinto per rimuovere il solvente residuo. Successivamente, rimuovere rapidamente il settimo e aggiungere idruro di calcio utilizzando una spatola. Collegare il pallone a fondo tondo all'apparato di distillazione descritto nel protocollo testuale e impostare la temperatura del bagno d'olio a 100 gradi Celsius.

Al termine della distillazione, rimuovere la fonte di calore e far raffreddare l'apparato a temperatura ambiente. Riportare l'apparato raffreddato alla pressione atmosferica con azoto e chiudere ermeticamente la valvola a spina sulla fiala di conservazione in atmosfera inerte. Dopo aver trasferito il prodotto isolato dalla fiala a un contenitore in una camera a guanti, conservare il contenitore nel congelatore della camera a guanti.

Dopo aver purificato la proteina, trasferire la soluzione purificata in una membrana dialitica. Posizionare la membrana dialitica in un contenitore contenente quattro litri di soluzione di fosfato di sodio 100 millimolari, cloruro di sodio 550 millimolari e azoturo di sodio 0,2%. Mescolare tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, aggiungere 2-mercaptoetanolo al campione dializzato in modo che la concentrazione finale sia di cinque millimoli. Quindi, utilizzare un concentratore centrifugo per concentrare la soluzione fino a 40 milligrammi per millilitro. Centrifugare il campione a 5.000 giri al minuto e a sei gradi Celsius ed eliminare qualsiasi precipitato dopo la concentrazione.

Successivamente, in una piastra a 24 pozzetti, preparare diverse condizioni con la soluzione serbatoio, come indicato nel protocollo testuale. Utilizzare del grasso per sigillare ermeticamente applicandolo sul bordo di ogni pozzetto. Mescolare cinque microlitri della soluzione proteica concentrata con cinque microlitri di soluzione serbatoio su un'ampolla di vetro silanizzata.

Posizionare il coprioggetto capovolto sulle pozzette contenenti la soluzione serbatoio. Conservare la piastra a 4 gradi Celsius per la crescita dei cristalli. Utilizzando un'ansa di tubo criogenico, raccogliere i cristalli formati e posizionarli in un tubo microcentrifuga da 6 millilitri.

Aggiungere 50 microlitri di liquor madre. Successivamente, trasferire il tubo in una camera a gas inerte. Trasferire cinque microlitri del ligando azaborinico preparato all'interno del tappo a vite del tubo.

Chiudere il tubo e conservarlo in frigorifero all'interno della camera a guanti per due-sette giorni per l'equilibrazione mediante diffusione di vapore. Trascorso questo periodo, depositare una goccia di olio N Paratone su un vetrino. Utilizzando una micropipetta, trasferire un cristallo sul vetrino.

Successivamente, utilizzare un anello di tubo criogenico per raccogliere il cristallo e trasferirlo dalla soluzione acquosa nel N Paratone. Immergere il cristallo protetto con N Paratone in un contenitore criogenico contenente azoto liquido. Utilizzando pinze criogeniche, montare il cristallo congelato rapidamente sull'anello.

Quindi, analizzare i dati cristallini raccolti come descritto nel protocollo del testo. In questo studio, viene presentata una sintesi modificata di 1,2-azaborine basata su metodi precedentemente riportati. Il tri-allo borina viene utilizzato per preparare l'addotto cloruro di N-allo NTBSB-allo.

Viene impiegata una sequenza one pot in due passaggi per la sintesi di NTBS BCl 1,2-azaborina, che consente un rendimento isolato superiore rispetto ai metodi precedenti. La sintesi di N-H-B-etil-1,2-azaborina è realizzata in due passaggi, utilizzando etillitio al posto del complesso di cromo impiegato nei metodi precedentemente descritti. La proteina viene purificata utilizzando un sistema di cromatografia a bassa pressione.

Un cromatogramma eseguito a 280 nanometri mostra un picco compatibile con la variante della T4 lisozima, L99am102q. La proteina viene quindi cristallizzata e complessata con ligandi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la sintesi dell'azaborina richiede condizioni prive di aria, come una camera a guanti e un manifold per vuoto-gas, per prevenire la decomposizione dei composti.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione delle proprietà chimiche e fisiche uniche degli azaborini rispetto agli aromatici carboniosi nei classici siti biologici di recupero areale.