Name: Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri la sintesi di 1,2-azaborine e la preparazione dei complessi proteici con mutanti di lisozima T4. Questo metodo offre una sintesi affidabile di composti contenenti boro per applicazioni biomediche.

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Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti in questo manoscritto.

Nella prima parte di questo protocollo, abbiamo descritto una sintesi modificata del 1,2-azaborines basate su metodi precedentemente riportati 12, 13. Triallylborane 22 è stato utilizzato come sostituto per le rotte che utilizzano allyltriphenyl stagno o di potassio allyltrifluoroborate per preparare N -allyl- N -TBS- B -allyl cloruro addotto (1). Questo metodo consente un approccio più atomi-ec...

Boro-contenenti azoto eterocicli (vale a dire 1,2-azaborines) hanno recentemente attirato notevole attenzione come isosteri di areni. Questo isosteria può portare alla diversificazione dei motivi strutturali esistenti per ampliare lo spazio chimica 2, 3, 4. Azaborines hanno potenziale utilità per l&#39;applicazione nella ricerca biomedica 5, 6, 7, 8, in particolare nel campo della chimica medicinale che i chimici svolgono sintesi di librerie di molecole strutturalmente e funzionalmente pertinenti. Significativamente, tuttavia, mentre ci sono numerose vie sintetiche ben sviluppati a molecole contenenti arene disponibili, sono stati riportati solo un numero limitato di metodi per la sintesi di azaborines 9, 10, </sup&gt; 11, 12, 13. Ciò è dovuto principalmente ad un numero limitato di opzioni per la sorgente di boro e l&#39;aria e la natura all&#39;umidità sensibile della molecola nella fase iniziale della sequenza sintetica. Nella prima parte di questo articolo, descriveremo una sintesi multi-scala grammo di N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizzando tecniche senza aria standard. Questo composto serve come intermedio versatile che può essere ulteriormente funzionalizzati al strutturalmente più complesse molecole 14, 15. Partendo da 3, verranno descritte la sintesi e la purificazione di N -H- B etil-1,2-azaborine (5) per l&#39;uso in studi di legame proteico. Data la volatilità del 5, il suo isolamento efficace richiede un controllo preciso della temperatura di reazione, tempo e distillation condizioni. Nella seconda parte, protocolli per l&#39;espressione della proteina e l&#39;isolamento di mutanti T4 lisozima (L99A L99A e / M102Q) 17, 18, 19, saranno presentati 20, seguita da cristallizzazione delle proteine e la preparazione di complessi di cristallo proteina-ligando. Mutanti T4 lisozima L99A L99A e / M102Q sono stati scelti come sistemi modello biologico per esaminare la capacità di idrogeno incollaggio di NH contenente molecole azaborine 17. Utilizzando un protocollo standard di biologia molecolare, la proteina è espressa in ceppo Escherichia coli RR1 e indotta con isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Purificazione di proteine ​​viene effettuata utilizzando scambio ionico cromatografia su colonna. Protein cristallizzazione viene effettuata con soluzione altamente concentrata purificata proteine ​​(&gt; 95% di purezza mediante elettroforesi su gel) usando l&#39;attaccaturacadere metodo diffusione del vapore. A causa della sensibilità dei ligandi di questo studio all&#39;ossigeno, i complessi proteina-ligando sono preparati sotto condizioni di assenza di aria.

<table><tbody><tr><td>Tetraidrofurano (THF), senza inibitori, per HPLC, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico (Et2O), per HPLC, &ge; 99,9%, senza inibitori</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di metilene&nbsp; (CH2Cl2), (ACS stabilizzato/certificato)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentano, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Idruro di calcio (CaH2), grado reagente, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Palladio piroforico</td></tr><tr><td>su carbone attivo (Pd/C), 10% in peso Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Soluzione di tricloruro di boro in esano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td> Trietilammina <td>altamente tossico/piroforico</td></tr><tr><td>, &ge; 99,5%</td><td>Catalizzatore di generazione Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-butanolo, anidro, 99,8%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di etillitio, 0,5&nbsp; M in benzene/cicloesano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td> Soluzione HCl <td>altamente tossica/piroforica</td></tr><tr><td>, 2,0 M in Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano, anidro, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima T4 WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>isopropil-beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico anidro</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Thermo scientifico pierce DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Terreni di scambio cationico a flusso rapido di sefarosio</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aziduro di sodio</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td></td> altamente tossico <td>Fisher ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Concentratori centrifughi Vivaspin 20</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-idrossietildisolfuro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 tubi a membrana per dialisi RC da 12.000 a 14.000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo</td> criogenico CryoLoop <td>Hampton Research</td><td></td><td>a forma di anello</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>pinza criogenica</td></tr><tr><td>Folaga</td><td></td><td></td> Le <td>immagini della densità elettronica sono generate dal software</td></tr></tbody></table>

sintesi di 1,2-azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con t4 lisozima mutants

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Descriviamo una sintesi generale di 1,2-azaborine utilizzando tecniche standard air-free e preparazione di complessi proteici con mutanti del lisozima T4 mediante diffusione del vapore. I composti sensibili all'ossigeno e all'umidità vengono preparati e isolati in atmosfera inerte (N2) utilizzando un collettore di gas sotto vuoto o una scatola a guanti. Come esempio di sintesi dell'azaborina, dimostriamo la sintesi e la purificazione del volatile N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una sequenza in cinque fasi che coinvolge la distillazione e la cromatografia su colonna per l'isolamento dei prodotti. I mutanti del lisozima T4 L99A e L99A/M102Q sono espressi con il ceppo RR1 di Escherichia coli. I protocolli standard per la lisi chimica delle cellule, seguita dalla purificazione mediante colonna a scambio ionico carbossimetilico, consentono di ottenere proteine di purezza sufficientemente elevata per la cristallizzazione. La cristallizzazione delle proteine viene eseguita in varie concentrazioni di precipitante a diversi intervalli di pH utilizzando il metodo di diffusione del vapore a goccia sospesa. La preparazione complessa con le piccole molecole viene effettuata con il metodo della diffusione del vapore in atmosfera inerte. L'analisi della diffrazione a raggi X del complesso cristallino fornisce prove strutturali inequivocabili delle interazioni di legame tra il sito di legame della proteina e le 1,2-azaborine.

La via sintetica schema per 1,2-azaborines è mostrato in Figura 1. Questo protocollo si applica alla sintesi di cinque diverse molecole boro contenenti azoto. Figura 2 rappresenta 11 B NMR spettri misurati nel corso del passo 1.3 per monitorare la formazione del prodotto desiderato (3). Purificazione di proteine è stata effettuata utilizzando il sistema di cromatografia a bassa pressione ed un cromatogramma rappresentativo è m...

Viene presentato un protocollo per la sintesi di 1,2-azaborine e la preparazione dei loro complessi proteici con mutanti del lisozima T4.

Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere un metodo generale per la sintesi di 1,2-azaborine e le sue potenziali applicazioni nella ricerca biomedica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una sintesi certa di composti 1,2-azaborinici, che rappresentano isosteri contenenti boro del diffusissimo motivo benzenico. Il precursore descritto può essere ulteriormente funzionalizzato per ottenere molecole potenzialmente più complesse.La preparazione di complessi proteici con 1,2-azaborina fornirà alcune indicazioni sulle future applicazioni nella ricerca biomedica. Per iniziare questa procedura, preparare il prodotto ciclizzato come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 14 grammi di palladio su carbonio a questo prodotto preparato in toluene.Quindi, rimuovere il pallone dalla scatola. Equipaggiare il pallone con un condensatore a riflusso 24/40 essiccato in stufa e preriscaldato con azoto, collegato all'acqua refrigerata. Posizionare il pallone in un bagno d'olio e riscaldare la reazione fino a un riflusso vigoroso a 135 gradi Celsius, sotto agitazione.Mantenere la reazione in riflusso per 16 ore. Al termine, rimuovere il pallone dal bagno d'olio per far raffreddare la reazione a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, sostituire il condensatore a riflusso con un setto sul pallone di reazione.Utilizzando una siringa munita di un ago Luer Lock essiccato in stufa, prelevare un'aliquote di 5 millilitri. Trasferire l'aliquote in un tubo NMR con tappo a vite. Analizzare il campione mediante NMR del Boro-11.Se la reazione è incompleta, trasferire il pallone della reazione in una camera a guanti. Quindi, aggiungere ulteriori tre grammi di palladio su carbonio. Successivamente, rimuovere il pallone dalla camera a guanti.Montare il pallone con un condensatore di riflusso 24/40 che sia stato purgato con azoto e collegato all'acqua refrigerante. Riscaldare la reazione fino a un riflusso vigoroso a 135 gradi Celsius utilizzando un bagno d'olio, sotto agitazione per 24 ore. Mediante risonanza magnetica nucleare del boro-11, analizzare un'altra aliquota per verificare che la reazione sia completa.Successivamente, trasferire il pallone della reazione all'interno della camera a guanti. Far passare la miscela di reazione attraverso una colonna per cromatografia flash riempita con salviette di carta. Quindi, raccogliere il filtrato in un pallone da un litro a fondo rotondo dotato di barretta d'agitazione.Lavare la colonna con 50 millilitri di toluene. Rimuovere il recipiente del filtrato dalla camera a gas inerte e collegarlo a un manifold per vuoto dotato di linea per azoto. Posizionare un bagno ad acqua sotto il pallone e un dewar contenente azoto liquido per trattenere il solvente.Aprire la valvola del vuoto elevato per iniziare la rimozione di tutti i composti volatili dal filtrato. Successivamente, riportare la miscela di reazione nella camera a gas inerte. Trasferire la miscela in un pallone da 250 millilitri, collo 24/40, precedentemente essiccato in stufa e munito di barretta magnetica.Risciacquare il residuo della miscela di reazione con diclorometano e trasferirlo nel pallone. Chiudere il pallone con un settum. Trasferire il pallone dalla camera a guanti al manifold sotto vuoto e collegarlo.Aprire la valvola del vuoto spinto per rimuovere il solvente residuo. Successivamente, rimuovere rapidamente il settimo e aggiungere idruro di calcio utilizzando una spatola. Collegare il pallone a fondo tondo all'apparato di distillazione descritto nel protocollo testuale e impostare la temperatura del bagno d'olio a 100 gradi Celsius.Al termine della distillazione, rimuovere la fonte di calore e far raffreddare l'apparato a temperatura ambiente. Riportare l'apparato raffreddato alla pressione atmosferica con azoto e chiudere ermeticamente la valvola a spina sulla fiala di conservazione in atmosfera inerte. Dopo aver trasferito il prodotto isolato dalla fiala a un contenitore in una camera a guanti, conservare il contenitore nel congelatore della camera a guanti.Dopo aver purificato la proteina, trasferire la soluzione purificata in una membrana dialitica. Posizionare la membrana dialitica in un contenitore contenente quattro litri di soluzione di fosfato di sodio 100 millimolari, cloruro di sodio 550 millimolari e azoturo di sodio 0,2%. Mescolare tutta la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, aggiungere 2-mercaptoetanolo al campione dializzato in modo che la concentrazione finale sia di cinque millimoli. Quindi, utilizzare un concentratore centrifugo per concentrare la soluzione fino a 40 milligrammi per millilitro. Centrifugare il campione a 5.000 giri al minuto e a sei gradi Celsius ed eliminare qualsiasi precipitato dopo la concentrazione.Successivamente, in una piastra a 24 pozzetti, preparare diverse condizioni con la soluzione serbatoio, come indicato nel protocollo testuale. Utilizzare del grasso per sigillare ermeticamente applicandolo sul bordo di ogni pozzetto. Mescolare cinque microlitri della soluzione proteica concentrata con cinque microlitri di soluzione serbatoio su un'ampolla di vetro silanizzata.Posizionare il coprioggetto capovolto sulle pozzette contenenti la soluzione serbatoio. Conservare la piastra a 4 gradi Celsius per la crescita dei cristalli. Utilizzando un'ansa di tubo criogenico, raccogliere i cristalli formati e posizionarli in un tubo microcentrifuga da 6 millilitri.Aggiungere 50 microlitri di liquor madre. Successivamente, trasferire il tubo in una camera a gas inerte. Trasferire cinque microlitri del ligando azaborinico preparato all'interno del tappo a vite del tubo.Chiudere il tubo e conservarlo in frigorifero all'interno della camera a guanti per due-sette giorni per l'equilibrazione mediante diffusione di vapore. Trascorso questo periodo, depositare una goccia di olio N Paratone su un vetrino. Utilizzando una micropipetta, trasferire un cristallo sul vetrino.Successivamente, utilizzare un anello di tubo criogenico per raccogliere il cristallo e trasferirlo dalla soluzione acquosa nel N Paratone. Immergere il cristallo protetto con N Paratone in un contenitore criogenico contenente azoto liquido. Utilizzando pinze criogeniche, montare il cristallo congelato rapidamente sull'anello.Quindi, analizzare i dati cristallini raccolti come descritto nel protocollo del testo. In questo studio, viene presentata una sintesi modificata di 1,2-azaborine basata su metodi precedentemente riportati. Il tri-allo borina viene utilizzato per preparare l'addotto cloruro di N-allo NTBSB-allo.Viene impiegata una sequenza one pot in due passaggi per la sintesi di NTBS BCl 1,2-azaborina, che consente un rendimento isolato superiore rispetto ai metodi precedenti. La sintesi di N-H-B-etil-1,2-azaborina è realizzata in due passaggi, utilizzando etillitio al posto del complesso di cromo impiegato nei metodi precedentemente descritti. La proteina viene purificata utilizzando un sistema di cromatografia a bassa pressione.Un cromatogramma eseguito a 280 nanometri mostra un picco compatibile con la variante della T4 lisozima, L99am102q. La proteina viene quindi cristallizzata e complessata con ligandi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la sintesi dell'azaborina richiede condizioni prive di aria, come una camera a guanti e un manifold per vuoto-gas, per prevenire la decomposizione dei composti.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione delle proprietà chimiche e fisiche uniche degli azaborini rispetto agli aromatici carboniosi nei classici siti biologici di recupero areale.

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Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero...

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

Un protocollo per la diastereoselettiva preparazione di un piatto di cis - N-TS-iodoaziridines è descritto. La generazione di diiodomethyllithium, oltre a N-Ts aldimines e ciclizzazione della gemma amino-diioduro intermedio iodoaziridines è dimostrata. È incluso anche un protocollo di rapidamente e quantitativamente valutare la fase stazionaria più appropriato per la purificazione mediante cromatografia.

Sintesi e purificazione di Iodoaziridines Coinvolgere quantitativa Selezione del Ottimale fase stazionaria per cromatografia

Qui, presentiamo un protocollo per introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide, e successivamente accoppiando l'azide con una sonda chimica mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC).

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

Dal 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] sono stati generati ioni biciclico aziridinium come 1-azoniabicyclo [4.1.0] eptano tosilato aziridina, che è stata utilizzata per la preparazione di piperidine sostituiti e azepanes via regio - e stereospecifica dilatazione dell'anello con vari nucleofili. Questo protocollo altamente efficiente ci ha permesso di preparare diversi azaheterocycles tra cui prodotti naturali come fagomine, febrifugine analogico e balanol.

Preparazione di stabile biciclico Aziridinium ioni e loro anello-apertura per la sintesi di Azaheterocycles

3-Aroyl-N-idrossio-5-nitroindoles sono stati sintetizzati da cicloaddition di 4-nitronitrosobenzene con un alchinone terminale coniugato in una procedura termica in un solo passaggio. La preparazione del nitrosoarene e degli alchinoni è stata adeguatamente segnalata e rispettivamente attraverso procedure di ossidazione sull'anilina corrispondente e sull'alchinolo.

Una sintesi diretta, regiosesesesese ed economica di 3-Aroyl-N-idrossicco-5-nitroindoles di Cycloaddition di 4-Nitronidobenzee con alchinoni

In questo studio, prepariamo sia enantiomeri di aziridina-2-carbossilato, che vengono utilizzati nella sintesi asimmetrica di alcaloidi, tra cui biemamide B e D, e (-)-epiallo-isomuscarina.

Preparazione di aziridine non attivate enantiopure e sintesi di biemamide B, D ed epiallo-isomuscarina

Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l'isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.

Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante

Le bisaziridine contigue contenenti aziridine non attivate e attivate sono state sintetizzate mediante aziridinazioni organocatalitiche asimmetriche e quindi sottoposte a reazioni chemioselettive di apertura dell'anello in condizioni acide o basiche. L'anello aziridinico non attivato si apre con nucleofili meno reattivi in condizioni acide, mentre l'anello aziridinico attivato si apre con nucleofili più reattivi in condizioni basiche.

Preparazione di bisaziridine contigue per reazioni regioselettive di apertura dell'anello

Questo protocollo descrive un metodo per produrre e valutare l'attività antimicrobica e la citotossicità del peptide cationico Mel4 e del mimetico dei peptidi RK758. Integrando sintesi chimica, espressione ricombinante e saghi funzionali standardizzati, fornisce un flusso di lavoro semplificato per la produzione e il test di peptidi e mimetici di piccole molecole.

Produzione e test di peptidi antimicrobici e dei loro mimetici

Descriviamo le procedure per la preparazione e la consegna di microcristalli proteici di membrana in fase cubica lipidica per la cristallografia seriale su laser a elettroni liberi a raggi X e sorgenti di sincrotrone. Questi protocolli possono essere applicati anche per l'incorporazione e la somministrazione di microcristalli proteici solubili, con conseguente riduzione sostanziale del consumo di campione rispetto all'iniezione di liquidi.

Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

Scopri la sintesi di 1,2-azaborine e la preparazione dei complessi proteici con mutanti di lisozima T4. Questo metodo offre una sintesi affidabile di composti contenenti boro per applicazioni biomediche.

Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

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