Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An In Vitro Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Questo protocollo descrive un test per misurare la funzione CFTR e le risposte del modulatore CFTR in tessuti coltivati da soggetti con fibrosi cistica (FC). Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia si gonfiano in modo guidato dal cAMP, una risposta che è difettosa (o fortemente ridotta) negli organoidi FC e può essere ripristinata dall'esposizione ai modulatori CFTR.

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione individuale del CFTR in un'efficacia dei trattamenti di modulazione del CFTR utilizzando un test di gonfiore indotto dalla forskolina, o FIS, in organoidi intestinali generati da pazienti con fibrosi cistica. Questo metodo affronta le questioni chiave nel campo della fibrosi cistica. In particolare, aiuta l'identificazione dei pazienti che possono trarre beneficio a lungo termine da farmaci esistenti o sperimentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto facilmente accessibile può essere utilizzato per generare organoidi da qualsiasi paziente con FC indipendentemente dall'età. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'ortoterapia della fibrosi cistica e rispondono all'urgente necessità attuale di testare l'efficacia dei farmaci in modo economico e individuale. A dimostrare la procedura saranno Marvin Statia di Hubrecht Organoid Technology e Annelot Vonk del gruppo Jeffrey Beekman.

Per ottenere dati ottimali sul saggio di rigonfiamento indotto dalla forskolina, è essenziale lavorare con una coltura contenente organoidi di grandi dimensioni con gemmazioni multiple. Dopo aver identificato tale coltura, etichettare una provetta conica da 15 millilitri con il nome del campione e una provetta come lavata. Quindi, utilizzare una pipetta p1000 per aspirare con cura il terreno dai pozzetti di coltura degli organoidi senza disturbare le gocce della matrice della membrana basale.

E aggiungi un millilitro di terreno basale a ciascun pozzetto. Ora usa la pipetta per rompere le gocce della matrice della membrana basale in ogni pozzetto e trasferisci le sospensioni di organoidi risultanti nella provetta da 15 millilitri con il nome del campione. Sciacquare ogni pozzetto con un altro millimetro di terreno basale e tirare i lavaggi nella provetta del campione.

Quando tutti i campioni sono stati raccolti, riempire la provetta del campione fino a un volume finale di 12 millilitri con terreno basale e utilizzare una pipetta da cinque millilitri pre-bagnata per miscelare la soluzione. Successivamente, centrafugare gli organoidi, rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di terreno basale fresco. Coprire lo stesso puntale della pipetta p1000 con un puntale p10 senza filtro e provare a valutare la sospensione 20 volte.

Quindi scartare entrambi i puntali e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per aggiungere quattro millilitri di terreno basale fresco al campione. Inclinare la provetta di circa 70 gradi e mescolare energicamente la soluzione due o tre volte con il nuovo puntale per pipetta p1000 pre-bagnato. Tenere il tubo in posizione inclinata per 10 secondi.

Quindi utilizzare la stessa pipetta p1000 per trasferire quattro volte il millilitro superiore del campione nelle provette lavate. Dopo che l'ultimo campione è stato raccolto, raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 120 microlitri di matrice a membrana basale al 50%. Quindi posizionare una gocciolina da tre microlitri su un vetrino da microscopio e confermare la presenza di almeno 30-50 organoidi all'interno della gocciolina al microscopio ottico.

Quindi, piastrate tre goccioline di organoidi da microlitri al centro di ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e posizionate la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti per solidificare la matrice della membrana basale. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno per il colon completo più VX809, o un solo terreno per il colon completo nei pozzetti degli organoidi appropriati e rimettere la piastra nell'incubatore per 18-24 ore. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta a ripetizione per aggiungere 10 microlitri di soluzione di calcio a ciascun pozzetto, ri-sospendendo i pozzetti una volta con una pipetta multicanale per assicurarsi che si stiano mescolando, e rimettere la piastra nell'incubatore per altri 30 minuti.

Durante la colorazione delle cellule, preimpostare lo strumento di imaging dal vivo sul microscopio confocale per l'imaging di cellule vive a 37 gradi e al cinque percento di anidride carbonica per pre-incubare la camera di imaging. Al termine dell'incubazione, trasferire la piastra nel supporto della piastra sul microscopio confocale e utilizzare l'opzione di configurazione intelligente per selezionare la traccia Alexa floor 488. Quindi, imposta le cinque lenti ex e l'area di scansione su 0,6x per ridurre lo zoom e catturare l'intero pozzo.

Regolare la potenza del laser e la sensibilità del rivelatore per consentire il rilevamento ottimale degli organoidi marcati con verde calcio sullo sfondo. E imposta la profondità di bit su otto e la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel. Utilizzare l'opzione serie temporale per impostare il tempo, la frequenza e gli intervalli di misurazione.

E l'opzione piastrella per determinare manualmente le singole posizioni dei pozzetti. Ora aggiungi 100 microlitri di forskolina appena preparata e/o VX770 ai pozzetti corrispondenti, iniziando dal primo pozzetto da riprendere, e inizia la misurazione. A causa della disfunzione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR, la maggior parte degli organoidi della fibrosi cistica del colon sono di dimensioni compatte e non si gonfiano o mostrano un rigonfiamento molto piccolo 60 minuti dopo la stimolazione con forskola, a seconda del loro genotipo.

Tuttavia, quando gli organoidi CF vengono trattati con modulatori CFTR prima della stimolazione con forskolina , gli organoidi mostrano un aumento del gonfiore. Per quantificare il rigonfiamento, le aree superficiali totali del verde calcio possono essere misurate in ogni punto temporale. Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere completate in tre o quattro ore se eseguite correttamente.

Prima di tentare questa procedura, il passo più importante è l'ottimizzazione delle condizioni di coltura per gli organoidi intestinali, poiché colture di buona qualità determineranno le prestazioni ottimali del test FIS. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come lavorare con le colture di organoidi intestinali e successivamente misurare l'attività del CFTR e la risposta dei modulatori CFDR utilizzando un test di gonfiore indotto dalla forskolina.