Name: Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An In Vitro Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara a valutare la funzione CFTR in organoidi intestinali derivati da pazienti con fibrosi cistica mediante l'assay di gonfiore indotto da forskolina. Questo metodo supporta strategie di medicina personalizzata.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal programma HIT-CF della olandese CF fondazione (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Fondo di ricerca dell&#39;ospedale dei bambini di Wilhelmina e CZ, e Zilverenkruis / Achmea. Vorremmo ringraziare S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, e G. Berkers (Dipartimento di Pneumologia Pediatrica, Ospedale Wilhelmina bambini, UMC Utrecht), e RHJ Houwen (Dipartimento di Gastroenterologia Pediatrica, Wilhelmina Ospedale pediatrico, UMC Utrecht) per avvicinare i pazienti e ottenere le biopsie per la generazione di un CF Biobank.

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Hans Clevers è un inventore di brevetti per la coltura di organoidi e il saggio di rigonfiamento indotto da Forskolina. Jeffrey M Beekman è un inventore di un brevetto per il test di rigonfiamento indotto da Forskolina. Sylvia F Boj e Robert Vries lavorano presso la Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), che detiene la licenza esclusiva per la Organoid Technology. Per il resto, gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, forniamo un protocollo completo per la generazione, l&#39;espansione, il congelamento, lo scongelamento e di organoidi colorettali umani. Mentre abbiamo stabilito le culture umane organoide qualche tempo fa 17, è a volte dimostrato difficile stabilire la tecnologia in altri laboratori, senza una formazione pratica. Prevediamo che questi protocolli sostituiranno tale formazione. Wnt-3A-condizionata mezzo è uno dei reagenti più importanti al fine di riuscire a stab...

CF è causata da mutazioni nel gene della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), che codifica per un canale anionico epiteliale. CF colpisce circa 85.000 persone in tutto il mondo 1. Oltre 2.000 mutazioni CFTR sono state identificate ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Questa diversità spiega in parte un ampio spettro di fenotipi della malattia osservati ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Sei classi di mutazioni CFTR sono definiti in base alla loro effetto sulla espressione della proteina CFTR e la funzione: (I) N. sintesi, (II) il traffico compromessa, (III) del canale difettoso gating, (IV) la conduttanza alterato, (V) i livelli di norma ridotta funzionamento CFTR, e (VI) cellula compromessa la stabilità della superficie 4. Anche se le mutazioni CFTR comuni sono ben studiati, la funzione CFTR e relazione con lo stato clinico rimangono poorly inteso a livello del singolo, in particolare per il grande gruppo di rare &quot;orfani&quot; mutazioni ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Recentemente, i farmaci sono stati sviluppati che hanno come bersaglio la proteina CFTR in maniera specifica per la mutazione. Due classi di farmaci proteici CFTR-targeting sono attualmente in uso clinico e hanno distinte modalità di azione. Potenziatori, come il VX-770, migliorano l&#39;open-probabilità di CFTR mutata direzione apicale-localizzata e agiscono direttamente sulla loro aggiunta a cellule 5. Correttori, come il VX-809, ripristinare il traffico di reticolo endoplasmatico-localizzato misfolded CFTR e richiedono pre-incubazione con si osservano cellule prima che gli effetti 6. Il potenziatore CFTR, VX-770, è stato registrato per i soggetti con la mutazione G551D 7, 8, così come per altri ottoCFTR gating mutazioni, tra cui S1251N 9; insieme, queste mutazioni sono trasportati da 5% di tutti i soggetti CF. Altri studi clinici hanno indicato che VX-770, in combinazione con il correttore VX-809, ha effetti limitati ma significativi sulla funzione polmonare e provoca una diminuzione della frequenza di esacerbazioni nei soggetti omozigoti per la mutazione F508del portato da 45-50% dei pazienti 10, 11. studi clinici convenzionali per identificare i soggetti farmaco-sensibile all&#39;interno del restante 50% dei pazienti affetti da FC sono costosi e che richiede tempo e non sono realizzabili per gli individui con genotipo CFTR estremamente rari. Novel, metodi personalizzati di costo-efficacia sono cruciali per soddisfare il crescente numero di modulatori CFTR a individui portatori di qualsiasi tipo di CFTR mutazione. Fino ad ora, l&#39;inclusione di prova di gruppi di pazienti che trasportano specifiche mutazioni CFTR è stata guidata da studi che utilizzano mutante trasfezione del gene CFTR in hsistemi cellulari eterologous, seguiti da studi elettrofisiologici in Camera di Ussing 5, 6, 12. A causa della mancanza di modelli animali CF adeguate, studi di efficacia del farmaco nelle cellule epiteliali bronchiali aria-liquido-interfaccia dissociati derivati da CF polmonari materiali espianti sono stati utilizzati per lo sviluppo di farmaci 13, 14, 15. Tuttavia, la limitata disponibilità di tessuti espianto polmonari e le procedure invasive per ottenere cellule bronchiali da soggetti senza malattia allo stadio terminale ostacolare l&#39;analisi delle mutazioni CFTR meno comuni e prevenire test anti-droga in un modo personalizzato. Per superare queste limitazioni, i tessuti &quot;easy access&quot;, come organoidi del colon-retto, cellule delle vie aeree nasali, e le cellule delle vie aeree derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, sono attualmente oggetto di studio per trattamenti farmacologici personalizzati. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; In precedenza, abbiamo stabilito i protocolli per le cellule staminali epiteliali cultura da qualsiasi organo gastrointestinale in forma di 3D organoidi 16, 17. fattori di crescita per il colon / retto umana, le condizioni di coltura comportano definiti (fattore di crescita epiteliale (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-spondina 3 (Rspo3), e Noggin) in combinazione con piccole molecole (nicotinamide, A83-01, e SB202190) in una matrice membrana basale. In queste condizioni, le cellule staminali singoli o piccoli frammenti di tessuto crescono in chiusi, cistica, strutture 3D formate da epitelio altamente polarizzata con il lato basale orientato verso l&#39;esterno. Tutti i tipi di cellule compaiono tipicamente nei loro rapporti normali e posizioni. Organoidi possono essere espanse per periodi di tempo lunghi per rottura meccanica settimanale e ri-placcatura. Sono geneticamente e fenotipicamente stabili e possono essere memorizzati, permettendo l&#39;espansione a lungo termine e bio-banking 17. Esse sono suscettibili ditutte le manipolazioni standard di cellulari-biologici / genetici e tecniche analitiche sviluppate per linee cellulari 2D 18. Abbiamo recentemente dimostrato che la funzione CFTR può essere facilmente misurato in organoidi del colon-retto in un saggio forskolin indotta gonfiore (FIS) 19, 20. Se esposto a forskolin (FSK) o, in alternativa, tossina del colera, organoidi rapidamente aumentano la loro adenosina monofosfato ciclico livelli (cAMP), che a sua volta provoca l&#39;apertura del canale CFTR 19. Organoidi da individui sani o da pazienti con CFTR mutazioni associate alla funzione residua, saranno successivamente gonfiarsi come conseguenza di trasporto di ioni e acqua al lume organoide, l&#39;equivalente in vitro di diarrea secretoria. La risposta FIS di organoidi del colon-retto è stato precedentemente dimostrato di essere pienamente CFTR-dipendente, come indicato dalla organoidi derivati ​​da individui CFTR-udenti and mediante l&#39;uso di specifici inibitori farmacologici CFTR 19. Grandi insiemi di dati specifici per soggetti possono essere derivate entro alcune settimane dopo l&#39;assunzione di una biopsia. Per il saggio FIS descritto in dettaglio qui, organoidi sono coltivati da biopsie rettali ottenibili a qualsiasi età e con solo disagio limitata 21. Organoidi sono diversi passaggi ogni settimana dalla rottura meccanica in singoli cripte che facilmente richiudere e formano nuove organoidi. Per l&#39;esecuzione del test FIS, ~ 30-80 di queste piccole organoidi perturbato sono placcati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti 19. Al giorno del test, i organoidi sono colorate con calceina verde, un colorante cellula-permeabile fluorescente che viene trattenuto all&#39;interno delle cellule viventi, facilitando l&#39;imaging dal vivo. Poi, FSK, che solleva cAMP intracellulare e quindi attiva CFTR, viene aggiunto per stimolare gonfiore organoide. Potenziatori che agiscono su CFTR apicale sono aggiunti contemporaneamente won la forskolina, mentre correttori che ripristinano il traffico di CFTR si aggiungono 24 ore prima dell&#39;aggiunta di Fsk. Il gonfiore organoide viene quantificato un&#39;analisi automatica delle immagini che calcola il relativo aumento della superficie totale di tutti gli oggetti fluorescenti per ogni punto di tempo dopo l&#39;aggiunta forskolin. 3D organoide gonfiore offre vantaggi e svantaggi sopra letture CFTR elettrofisiologici esistenti in cellule in coltura delle vie aeree 2D in Camera di Ussing. Un importante vantaggio è la velocità del test gonfiore. Le cellule sono coltivate e analizzati utilizzando un unico tipo di terreno di coltura, e un tecnico esperto può cultura fino a 25 campioni organoide su base settimanale, mentre la quantificazione circa 1.200 punti dati a settimana in 12 campioni di pazienti. Abbiamo convenzionalmente digitare una singola condizione sperimentale da misure doppio o triplo, per piastra e ripetere tali misurazioni in tre punti di tempo di incubazione indipendenti. In totale, circa 300-500 single organoide strutture sono poi misurati per ogni condizione sperimentale, che porta a misure molto precise della funzione CFTR con variabilità tecnico limitato. Questa precisione ci permette di definire in modo chiaro le differenze nella funzione residua e la risposta a modulatori CFTR e ci permette di raccogliere facilmente fino effetti di sfondo genetiche tra i pazienti portatori di mutazioni CFTR identici 19, 22, 23, 24, 25. La qualità dei dati può essere facilmente valutata da immagini al microscopio. Mentre FIS è completamente CFTR-dipendente, è una misura di esito indiretto per la funzione CFTR, la sua out lettura causata dall&#39;accoppiamento di trasporto ionico per il trasporto di fluidi. Questo contrasta con le misurazioni della funzione CFTR dirette in camere ussing, che misurano correnti ioniche transepiteliali 26. camere ussing permettono di selezione stimolazione apicale del o basolaterale compartments (che il test organoide non permette); da permeabilizzante membrane basolaterale, il apicale CFTR-dipendente la secrezione di anione può essere selettivamente misurato 27.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' avanzato s Medium Modified Eagles con miscela di nutrienti F-12 Prosciutti (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>memorizzato a 4 gradi </td></tr><tr><td>C Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>conservato a -20 gradi Piastra</td></tr> di <tr><td>coltura C 96 pozzetti</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 24 pozzetti</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 6 pozzetti</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>conservato a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquile modificate medie (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Per la produzione media condizionata Wnt-3A. Immagazzinato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOT # 11113</td><td>per la produzione di mezzi condizionati Wnt-3A. Immagazzinato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>L Wnt3A linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>Per la produzione di mezzi di trattamento Wnt-3A.</td></tr><tr><td>Plasmidi TOP/FOP</td><td>Millipore</td><td>#17-285</td><td>Per misurare l'attività Wnt</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Per misurare l'attività Wnt</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Per misurare l'attività Wnt</td></tr> Sistema di <tr><td>saggio reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Per misurare l'attività Wnt</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td> Per l'integratore B27 per <td>la selezione della linea cellulare Wnt-3A</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epiteliale umano (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Inibitore del recettore del TGFb tipo I (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>p38 Inibitore MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>stoccato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-spondina umana 3 (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>immagazzinato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>conservato a -80 gradi C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>per organoidi tripsinizzanti per il congelamento</td></tr><tr><td>Congelamento di colture cellulari di recupero Medium</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>per il congelamento</td></tr><tr><td>di Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>conservato a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>conservato a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>immagazzinato a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Nome dei reagenti/Materiale</td><td>Solvent</td><td>Concentrazione stock</td><td>Concentrazione finale</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro; g/ml</td><td>100 U/ml 100 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>di zeocina&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml</td><td>125 & micro; g/ml</td></tr><tr><td>di integratore di B27&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10</td></tr><tr><td>mM Fattore di crescita epiteliale umano (hEGF)</td><td>DPBS 0,1% BSA</td><td>0,5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>DPBS</td><td>100 &; M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb tipo I Inibitore del recettore (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>p38 Inibitore di MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp;</td><td>100 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Noggin umano (hNoggin)</td><td>DPBS 0,1%BSA</td><td>100 &micro; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>R-spondina umana 3 (hRspo-3)</td><td></td> <td>varia per lotto</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calceina</td><td>DMSO</td><td>10 &; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>variabile</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20</td><td>mM variabile</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20</td><td>mM variabile</td></tr></tbody></table>

forskolin indotta gonfiore intestinale organoidi: an<em&gt; in vitro</em&gt; test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

I farmaci che modulano il regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) per la fibrosi cistica sviluppati di recente correggono l'espressione superficiale e/o la funzione del canale CFTR mutante in soggetti con fibrosi cistica (FC). L'identificazione dei soggetti che possono beneficiare di questi farmaci è difficile a causa dell'ampia eterogeneità delle mutazioni CFTR, nonché di altri fattori sconosciuti che contribuiscono all'efficacia dei singoli farmaci. Qui, descriviamo un test semplice e relativamente rapido per misurare la funzione e la risposta individuale del CFTR ai modulatori CFTR in vitro. Gli organoidi epiteliali tridimensionali (3D) vengono coltivati da biopsie rettali in terreno organoidico standard. Una volta stabiliti, gli organoidi possono essere biobancarizzati per analisi future. Per il saggio, 30-80 organoidi vengono seminati in piastre a 96 pozzetti nella matrice della membrana basale e vengono quindi esposti a farmaci. Il giorno dopo, gli organoidi vengono colorati con verde calceina e il rigonfiamento indotto dalla forskolina viene monitorato mediante microscopia confocale su cellule vive a 37 °C. Il rigonfiamento indotto dalla forskolina è completamente dipendente dal CFTR ed è sufficientemente sensibile e preciso da consentire la discriminazione tra le risposte ai farmaci di individui con mutazioni CFTR diverse e persino identiche. Le risposte di rigonfiamento in vitro sono correlate alla risposta clinica alla terapia. Questo test fornisce un approccio economicamente vantaggioso per l'identificazione di individui responsivi ai farmaci, indipendentemente dalle loro mutazioni CFTR. Potrebbe anche essere determinante per lo sviluppo di futuri modulatori CFTR.

La figura 1A mostra un isolamento rappresentante fresco di cripte incorporati su BMM. Le cripte sono da una biopsia del colon-retto di un soggetto CF. Di solito, un organoide è generato da ogni cripta (Figura 1A - C). A causa della disfunzione del CFTR, la maggior parte dei organoidi colon CF non sono cistica, ma piuttosto sono compatti e con proiezioni e buddings (Figura 2A - 2B). Tuttavia, alcuni CF or...

Questo protocollo descrive un test per misurare la funzione CFTR e le risposte del modulatore CFTR in tessuti coltivati da soggetti con fibrosi cistica (FC). Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia si gonfiano in modo guidato dal cAMP, una risposta che è difettosa (o fortemente ridotta) negli organoidi FC e può essere ripristinata dall'esposizione ai modulatori CFTR.

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è valutare la funzione individuale del CFTR e l'efficacia dei trattamenti modulatori del CFTR mediante un saggio di gonfiamento indotto da forskolina, o saggio FIS, su organoidi intestinali generati da pazienti affetti da Fibrosi Cistica. Questo metodo affronta domande fondamentali nel campo della Fibrosi Cistica, in particolare contribuendo all'identificazione dei pazienti che possono trarre benefici a lungo termine da farmaci già esistenti o sperimentali.Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzato un tessuto facilmente accessibile per generare organoidi da qualsiasi paziente affetto da fibrosi cistica, indipendentemente dall'età. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia ortologa della fibrosi cistica e rispondono a un'urgente esigenza attuale di testare l'efficacia dei farmaci in modo economico e personalizzato. La procedura sarà dimostrata da Marvin Statia del Hubrecht Organoid Technology e da Annelot Vonk del gruppo di Jeffrey Beekman.Per ottenere dati ottimali dal saggio di rigonfiamento indotto da forskolina, è essenziale lavorare con una coltura contenente organoidi di grandi dimensioni con

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Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

Un protocollo dettagliato è presentato qui per descrivere un modello organoide in vitro da cellule epiteliali nasali umane. Il protocollo ha opzioni per le misurazioni che richiedono apparecchiature di laboratorio standard, con possibilità aggiuntive per attrezzature e software specializzati.

Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la coltura di organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera. Vengono descritti la semina organoide nei supporti permeabili, il mantenimento del monostrato e i successivi esperimenti di permeabilità ai farmaci.

Organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

Questo protocollo descrive l'analisi morfologica degli organoidi rettali (ROMA), un nuovo test diagnostico per la fibrosi cistica (FC). Le caratteristiche morfologiche, vale a dire la rotondità (indice di circolarità, CI) e la presenza di un lume (rapporto di intensità, IR), sono una misura della funzione CFTR. L'analisi di 189 soggetti ha mostrato una perfetta discriminazione tra FC e non CF.

Analisi della morfologia organoide rettale (ROMA): un saggio diagnostico nella fibrosi cistica

Le co-colture organoide-fibroblasti forniscono un modello per studiare la nicchia delle cellule staminali in vivo . Qui viene descritto un protocollo per le co-colture organoide-fibroblasti esofagee. Inoltre, l'imaging a montaggio intero viene utilizzato per visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide.

Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Impara a valutare la funzione CFTR in organoidi intestinali derivati da pazienti con fibrosi cistica mediante l'assay di gonfiore indotto da forskolina. Questo metodo supporta strategie di medicina personalizzata.

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An In Vitro Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti (Video) | JoVE Journal

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An

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