Name: Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara a isolare intatte isole di Langerhans dal pancreas di topi neonati usando collagenasi e gradienti di densità. Questo metodo semplice permette di ottenere 20-80 cluster per campione per studi funzionali.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di NIDDK (DK065949 per GG). Ringraziamo la dottoressa Brenda M. Jarvis e Jeff Duryea Jr. per aver letto il manoscritto.

l&#39;utilizzo di animali segue le procedure di cui al protocollo M / 11/181 approvato dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa per Gu. topi CD1 o CBA / BL6 sono stati acquistati da fornitori commerciali e attraversato nella struttura animale Vanderbilt per ottenere topi neonatali. 1. Preparazione di topi, soluzioni di riserva, e attrezzature <ol><li> Per la croce del mouse: impostare una croce del mouse e registrare le date di tamponamento per aiutare la pianificazione sperimentale. topi CD1 di solito partoriscono intorno al giorno 19 dopo l&#39;accoppiamento. Utilizzare CD1 o CBA / BL6 croci per ottenere CD1 o CBA / BL6 neonati, rispettivamente. Incrociati tra le due linee utilizzano femmine e maschi CD1 CBA / BL6. </li><li> Per la collagenasi magazzino: pesare 200 mg di collagenasi di tipo IV con un saldo di alta precisione. Trasferire in un tubo da 50 ml centrifuga. Sciogliere in 40 mL HBSS con Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 e 0,5 mm rispettivamente) per fare un / magazzino soluzione 5 mg ml. <ol><li> Consentire a collagenasisciogliere per ~ 30 minuti agitando delicatamente. Aliquotare e conservare la soluzione congelata nel -20 ° C come magazzino, che rimane attivo per almeno un anno. </li></ol></li><li> Autoclave per la sterilizzazione diverse paia di pinzette, forbici, e suggerimenti P20 per la dissezione e isolotto raccolta. </li><li> Per il glucosio magazzino 1 M: pesare 9 g di glucosio in un tubo da 50 ml centrifuga, aggiungere 50 ml di RPMI 1640 media per sciogliere il glucosio. Tenere a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, ma non più di 6 mesi. </li></ol> 2. Soluzioni di lavoro NOTA: Il giorno di isolamento delle isole, preparare i seguenti reagenti. <ol><li> Per la soluzione IV di lavoro tipo collagenasi: disgelo e diluire collagenasi magazzino dal ghiaccio. Dispensare 0,15 mL magazzino in ciascuna 1,7 ml provetta per microcentrifuga. Aggiungere 1,35 ml HBSS con Ca 2+ / Mg 2+. Invertire la provetta per 5 volte. Lasciare in ghiaccio per 15 min. <ol><li> Girano ad alta velocità per 3 minuti in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Eliminare il tubo con residui insolubili. </li></ol></li><li> Per un completo RPMI 1640 supporti: aggiungere 2,5 ml 1 M di glucosio, 50 mL di calore inattivato FBS, e 5 ml 100x Pen-strep magazzino in 500 ml RPMI 1640 mezzi. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Isolamento e Pancreas Digestione <ol><li> Euthanize neonati con isoflurano, seguita da decapitazione secondo protocolli approvati. </li><li> Posare il mouse con la pancia rivolta verso l&#39;alto. Spruzzare con il 70% di etanolo per la sterilizzazione. </li><li> Sollevare la pelle pancia in su con una pinzetta e tagliare gli strati di pelle e muscoli longitudinalmente lungo la linea mediana, con un paio di forbici, dalla zona genitale alla gabbia toracica. Questo apre la cavità addominale per esporre tutti gli organi interni. </li><li> Trasferire tutti gli organi interni di un piatto 100 centimetri con un paio di pinzette. Individuare il pancreas, che è un organo sparso con una porzione dorsale che si aggrappa allo stomaco e la milza e una parte ventrale, che si aggrappa al duodeno 11. </li&gt; <li> Aggiungere HBSS nel piatto di sommergere gli organi. In soluzione, tessuti pancreatici aggrappano più al duodeno, stomaco, milza. E &#39;facilmente riconoscibile in un ambito dissezione causa del suo colore bianco tipico. Utilizzare un paio di pinzette per sbucciare i tessuti pancreatici di distanza dal tessuto circostante e trasferimento in un nuovo piatto 60 millimetri con HBSS. </li><li> Tagliare ogni pancreas con una forbice in pezzi più piccoli di 5 mm di diametro qualsiasi dimensione. Trasferimento in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Fino a cinque pancreas (più giovane di P7) possono essere digeriti in un tubo. Per i topi P8-P16, utilizzare un tubo per il pancreas. </li><li> Aggiungere 0.5 - soluzione di lavoro 1 ml di collagenasi ad ogni provetta (0,2 ml per ogni pancreas P1-P7 Utilizzare 0,5 ml per ogni pancreas P8-P16.). Lasciare la provetta in un incubatore a 37 ° fino a 15 min. Invertire il tubo due volte ogni min. </li><li> Dopo circa 5 minuti, toccare il tubo per monitorare lo stato di digestione del tessuto pancreatico. Continuare il processo di digestione finché la maggior parte del pancreastessuto appare come gruppi di cellule frammentati, con diametro &lt;2 mm. Il lisato apparirà nuvoloso, che è dovuto alla normale autolisi delle cellule acinose. </li></ol> 4. lisato di lavaggio <ol><li> Spin il lisato a 500 g per 10 s in una microcentrifuga. Rimuovere lo strato di surnatante con una Pipetman P 1.000. Il surnatante deve apparire torbida, ma privo di gruppi di cellule. Non usare l&#39;aspirazione, che può rapidamente aspirare via i frammenti di tessuto in basso a causa della presenza di alcuni DNA appiccicoso. </li><li> Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 completo dei media. Toccare il tubo delicatamente per risospendere il lisato frammentato. Invertire su e giù per 10 volte. Ripetere il punto 4.1. </li><li> Ripetere il punto 4.2 altre due volte o fino a quando il surnatante appare evidente. Risospendere frammenti pancreatiche lavati in 1 ml completo RPMI 1640 multimediali. </li></ol> 5. L&#39;isolamento Islet NOTA: per un piccolo numero di pancreas, diretta a mano raccogliendo, come di seguito (5.1) può essere utilizzato per isolotto ISOLzione. Per grandi numeri di pancreas (&gt; 6), il metodo descritto in 5.2 è preferito. <ol><li> Diretto raccolta manuale: <ol><li> Trasferire lisato dal punto 4.3 a un piatto di 60 millimetri. Aggiungere 5 ml completi RPMI 1640 mezzi. Portare sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Impostare l&#39;illuminazione in campo chiaro sul microscopio. Regolare l&#39;intensità della luce a ~ 50% della potenza massima. In questa condizione, isolotti appaiono come un po &#39;grappoli di colore rosa, mentre le cellule acinari scuri cluster di forma irregolare (Figura 1A). Si raccomanda un ingrandimento di 50X ~ (combinando la potenza dell&#39;obiettivo e il pezzo occhio) per offrire il miglior modo di isolotti visualizzazione e l&#39;apertura punta della pipetta simultaneamente per il prelievo. </li><li> Pick up isolotti con un puntale P20 evitando cluster acinar. Frazioni dispensare isolotti arricchita di un nuovo piatto 60 millimetri con RPMI completo supporto (Figura 1B). </li><li> Ripetere il processo di raccolta manuale altre due volte. Lasciare isolotti pure in una nuova 60mm piatto con 4 ml di mezzi RPMI completi (Figura 1C). </li></ol></li><li> centrifugazione in gradiente: <ol><li> Preparare una provetta da centrifuga 15 che viene precaricato con 2 mL polysucrose e sodio diatrizoato ad una densità di 1.077 g / mL. Lasciare la provetta in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Trasferire la sospensione dal punto 4.3 sulla parte superiore della soluzione diatrizoato polysucrose e sodio con una pipetta Pasteur. Non disturbare il livello inferiore. I tessuti di fino a 10 appena nato o 2 P17 pancreas possono essere caricati in ciascuna provetta 15 ml. </li><li> Spin la provetta a ~ 600 xg in un rotore oscillante per 15 min a 4 ° C. Utilizzare le impostazioni dei freni-off. </li><li> Dopo la centrifugazione, trasferire i mezzi di comunicazione e strati interfase (si noti che in condizioni di esercizio ottimali, le isole saranno situati nella interfase tra i media e la cultura polysucrose dopo la centrifugazione) in un nuovo tubo 15 ml. Aggiungere 10 ml di mezzi, Mescolare con cura. </li><li> Spin giù la frazione isolotto arricchitaa 300 xg per 5 min. Rimuovere il supporto di lavaggio. Ripetere il lavaggio ancora una volta con i media RPMI completo. Pellet Risospendere in a 4 ml media, che contiene per lo più isolotti e condotti (Figura 1D). </li><li> Selezionare manualmente le isole come descritto nel paragrafo 5.1. </li></ol></li></ol> 6. GSIS saggi in isole isolate <ol><li> Incubare le isolette dal punto 5.1.4 nei media RPMI completo per 2 ore in un C coltura tissutale incubatore a 37 °. </li><li> Usare una pipetta per rimuovere RPMI sotto un microscopio da dissezione. Aggiungere 3 mL di soluzione KRB con 2,8 mm di glucosio alla piastra 3. Agitare 10 volte per lavare gli isolotti. Rimuovere soluzioni KRB. <ol><li> Ripetere il processo di lavaggio una volta. Incubare le isolette con 3 mL di soluzione KRB a 37 ° C per 1 ora in un incubatore. </li></ol></li><li> Aliquotare 1 mL KRB in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Pre-riscaldare il brodo KRB e la piastra a 37 ° C in un incubatore. </li><li> Lavare gli isolotti due volte con KRB preriscaldata come in 6.2. Transfer 10 isolette a ciascun pozzetto delle piastre preriscaldate. Incubare in un incubatore a 37 °. </li><li> Dopo 45 minuti, ritirare 50 ml di surnatante. Questo contiene la soluzione di insulina secreta sotto glucosio basale. </li><li> Aggiungere 32 ml 500 mm di glucosio. Agitare la piastra 20 volte per miscelare la soluzione. Incubare in un incubatore a 37 °. Agitare la piastra 5 volte una volta ogni 5 min. </li><li> Dopo 45 minuti, ritirare 50 microlitri surnatante. Questo è l&#39;insulina secreta sotto alta glucosio. </li><li> Trasferire tutte le isolette in una provetta da 1,5 ml. Congelare in -20 ° C per 30 min. Scongelare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere il processo di congelamento e scongelamento. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% con 20 mM HCl. Lasciar riposare. Questo è l&#39;insulina nella isolotti. </li><li> Utilizzare ELISA convenzionale per saggiare i livelli di insulina, descritto in precedenza 3. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti per l'opera descritta.

Qui, forniamo un protocollo step-by-step su isolamento delle isole dal pancreas che sono troppo piccoli per la perfusione convenzionale. Si prevede di produrre isolotti pronti per tutti gli studi isolotto-based come la purificazione delle cellule beta, analisi di espressione genica, isolotto la maturazione delle cellule beta, la proliferazione, risposte allo stress cellulare, la sopravvivenza delle cellule, il metabolismo, e funzionale manutenzione GSIS, ecc. Questo sarà, al meglio delle nostre conoscenze, il p...

L'isolamento delle isole pancreatiche pure è essenziale per il dosaggio della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) delle cellule beta e per il trapianto di isole da donatori cadaverici 1-3. È inoltre necessario stabilire l'espressione genica endocrina nelle cellule insulari 4, 5. A tal fine, sono stati stabiliti protocolli dettagliati per consentire l'isolamento delle isole pancreatiche da grandi pancreate (6 e riferimenti ivi contenuti). Questi metodi si basano sulla perfusione enzimatica per dissociare l'acinare dai tessuti insulari, insieme alla separazione in gradiente e al picking manuale. Pertanto, l'isolamento delle isole dal grande pancreas può essere eseguito facilmente nella maggior parte dei laboratori. D'altra parte, non esiste un protocollo dettagliato passo dopo passo per consentire l'isolamento delle isole dalla pancreata che sono troppo piccole per essere perfuse.
Studiare l'espressione genica e la funzione delle isole neonatali è importante. Le isole neonate hanno proprietà diverse da quelle degli adulti in termini di secrezione di insulina e capacità di proliferazione 7, 8. Tuttavia, isolare le isole dagli animali appena nati, in particolare dai topi, è difficile a causa delle piccole dimensioni del pancreas appena nato. La dimensione impedisce il consueto processo di perfusione quando la collagenasi viene iniettata attraverso il dotto pancreatico. In effetti, diversi articoli hanno presentato studi in questo senso, con procedure di isolamento assistite da enzimi o non enzimi 7, 9, 10. Tuttavia, manca una descrizione dettagliata del processo di isolamento delle isole con l'ausilio visivo 7, 9, il che rende difficile per la maggior parte dei ricercatori eseguire studi simili. 
Abbiamo esplorato diverse condizioni che producono isole di alta qualità da topi neonatali. Qui presentiamo un protocollo che dovrebbe aiutare i ricercatori ad apprendere i dettagli chiave nel processo di isolamento delle isole. Questo protocollo è applicabile al pancreas di topo fino a due settimane di età, dopodiché è possibile eseguire la perfusione per l'isolamento di routine delle isole avarie. Le isole possono essere utilizzate direttamente per la secrezione di insulina e per i saggi di espressione genica.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi Tipo IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS con Ca2+/Mg2+</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>Se si ottiene HBSS senza Ca2+/Mg2+, è possibile aggiungere CaCl2 e MgSO4 1,26 e 0,5 mM, rispettivamente.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 senza glucosio</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Il glucosio deve essere aggiunto a livelli specifici per non interferire con il successivo utilizzo delle isole.</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di polisaccarosio e diatrizoato di sodio</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td> Leica <td>M165</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuga 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL provette centrfughe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL provette centrfughe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Provette microfughe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Piatto 100 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Piatto 60 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>Topi CD1</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Il laboratorio Jackson, Farmington, CT&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>Il laboratorio Jackson, Farmington, CT&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse pancreas

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

protocolli isolotto-isolamento di perfusione a base di grandi dimensioni pancreas dei mammiferi sono ben stabiliti. Tali protocolli sono facilmente effettuate in molti laboratori causa delle grandi dimensioni del dotto pancreatico che permette iniettabile collagenasi pronta e successiva perfusione tissutale. Al contrario, isolamento delle isole dal pancreas piccolo, come quello dei topi neonatali, è impegnativo, perché la perfusione non è facilmente realizzabile nel piccolo pancreas. Qui si descrive una semplice procedura dettagliata che recupera un numero considerevole di isolotti da topi appena nati con assistenza visiva. Appena sezionato intero pancreas sono stati digeriti con 0,5 mg / ml di collagenasi IV disciolto in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;(HBSS) a 37 ° C, in tubi da microcentrifuga. I tubi sono stati sfruttato regolarmente per aiutare la dispersione dei tessuti. Quando la maggior parte del tessuto è stata dispersa per piccoli gruppi circa 1 mm lisati sono stati lavati tre a quattro volte con mezzo di coltura con siero fetale bovino 10% (FBS). cluster Islet,privo di tessuti acinar riconoscibili, possono poi essere recuperati sotto dissezione stereoscope. Questo metodo recupera 20 - 80 piccole e grandi dimensioni isolotti per pancreas di topo appena nato. Questi isolotti sono adatti per saggi a valle più immaginabili, tra cui la secrezione di insulina, l&#39;espressione genica, e la cultura. Un esempio di saggio secrezione di insulina è presentato per convalidare il processo di isolamento. Il background genetico e il grado di digestione sono i maggiori fattori che determinano il rendimento. soluzione di collagenasi Appena fatto con alta attività è preferito, in quanto aiuta in isolamento endocrino-esocrina. La presenza di cationi [calcio (Ca 2+) e magnesio (Mg 2+)] in tutte le soluzioni e siero bovino fetale al lavaggio / sono necessari per una buona resa di isolotti con integrità supporto corretto prelievo. Un ambito dissezione con un buon contrasto e l&#39;ingrandimento aiuterà anche.

In condizioni ottimali, il metodo presentato può produrre 20 - 80 isolotti da ogni piccolo pancreas mouse. Questo numero dipende dal background genetico, età dei topi, e la dimensione di isolotti da recuperare. Tra il comunemente usato, CD1 out-allevato e C57BL / 6J pura producono meno isolotti con dimensioni inferiori a ibridi tra CD1 e C57BL / 6 o B6CBAF1 commerciale / topi J fanno. Mano diretto raccogliendo in generale ha dato un numero minore di isolotti, probabilmente a causa della ...

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare isole di Langerhans integre dal pancreas di topo neonato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo lo sviluppo e la funzionalità, come ad esempio l'escrezione di insulina, l'espressione genica, la sopravvivenza delle cellule paracrine e il mantenimento della funzionalità.Il principale vantaggio di questo metodo è che è semplice e diretto, consentendo comunque ai nuovi ricercatori di isolare un numero consistente di isolotti integri per studi di sottocultura. Iniziare spruzzando un neonato in posizione supina con etanolo al 70%. Successivamente, utilizzare una pinzetta per sollevare la pelle sull'addome e tagliare longitudinalmente i tessuti cutaneo e muscolare lungo la linea mediana, dalle genitali alla gabbia toracica.Successivamente, trasferire tutti gli organi interni in una piastra da 100 centimetri e individuare il pancreas, un organo bianco e diffuso, la cui porzione ventrale aderisce al duodeno e la porzione dorsale aderisce allo stomaco e alla milza. Aggiungere HBSS nella piastra fino a immergere gli organi, in modo che i tessuti pancreatici non aderiscano più al duodeno, allo stomaco o alla milza. Quindi utilizzare una pinzetta per staccare il pancreas dai tessuti circostanti.Trasferire il pancreas in una nuova piastra da 60 millimetri contenente HBSS e utilizzare le forbici per tagliare da uno a cinque pancreas in pezzi di cinque millimetri o più piccoli. Una volta minuzionato tutto il tessuto, trasferire i pezzi in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere alle campioni la soluzione lavorativa di collaghenasi. Successivamente, incubare i frammenti di tessuto a 37 gradi Celsius, invertendo le provette due volte ogni minuto.Dopo cinque minuti, battere leggermente il tubo per monitorare lo stato della digestione dei frammenti. Proseguire la digestione per altri dieci minuti, fino a quando il lisato risulti torbido e la maggior parte dei pancreas appaia sotto forma di aggregati cellulari frammentati con un diametro inferiore a due millimetri. Al termine della digestione, centrifugare il lisato in microcentrifuga e utilizzare una pipetta p1000 per rimuovere con attenzione il soprannatante, che dovrebbe apparire torbido ma privo di aggregati cellulari.Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo completo RPMI 16/40 fresco al pellet. Quindi, battere delicatamente per risospendere i frammenti del lisato e capovolgere il tubo dieci volte. Dopo la centrifugazione, capovolgere la sospensione del lisato risospeso almeno altre due volte come appena dimostrato, fino a quando il sopranatante risulti limpido.Quindi risospendere il pellet finale in un millilitro di mezzo completo fresco e aggiungere due millilitri di polisaccaride e diatrizoato di sodio a una densità di 1,077 g/ml in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio. Utilizzando una pipetta di Pasteur, stratificare attentamente il lisato sulla soluzione gradiente senza mescolare gli strati e separare le cellule mediante centrifugazione. Trasferire il mezzo e gli strati interfaciali contenenti gli isolotti in un nuovo tubo da 15 millilitri e mescolare delicatamente ma accuratamente gli isolotti con dieci millilitri di mezzo fresco per la centrifugazione.Dopo un secondo lavaggio e con mezzo completo fresco, risospendere il pellet contenente gli isolotti e i dotti in quattro millilitri di mezzo completo fresco. Poi seminare gli isolotti in una piastra da 60 millimetri e aggiungere cinque millilitri di mezzo completo alle cellule. Trasferire la piastra sotto un microscopio stereoscopico e accendere l'illuminazione a campo chiaro, regolando l'intensità luminosa a circa il 50% della potenza massima.Con un ingrandimento di 50x, le isole appariranno come aggregati leggermente rosa e le cellule acinari come aggregati scuri e dalla forma irregolare. Utilizzando una punta per pipetta p20, raccogliere le singole isole, avendo cura di evitare gli aggregati acinari, e dispensare le frazioni arricchite in isole in una nuova piastra da 60 millimetri contenente mezzo completo. Una volta raccolte tutte le isole dalla piastra originale, trasferire le isole dalla piastra di raccolta in una nuova piastra da 60 millimetri contenente quattro millilitri di mezzo completo fresco, ripetendo l'operazione altre due volte, fino a quando nella piastra finale di raccolta saranno presenti soltanto isole pure.Una digestione e isolamento corretti produrranno isolotti con superfici esterne lisce. Una digestione insufficiente con collaghenasi può portare a isolotti di grandi dimensioni, facilmente visibili, che non possono essere completamente separati dai tessuti acinosi, riducendo il rendimento complessivo di isolotti anche se vengono prodotti isolotti più grandi. Nel caso di una digestione eccessiva, anche se i tessuti acinosi possono essere completamente separati dagli isolotti, la struttura degli isolotti tende a essere compromessa, con conseguente aspetto di isolotti con superficie irregolare osservato al microscopio.Gli isolotti neonatali isolati con questo metodo mostrano elevati livelli di secrezione basale di insulina e profili di secrezione di insulina stimolata dal glucosio tipici delle cellule beta degli isolotti immaturi, suggerendo che questa procedura di isolamento degli isolotti conserva in larga misura le proprietà funzionali degli isolotti neonatali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in soli due ore se eseguita correttamente. Quando si esegue la procedura, è importante ricordare di preruotare la collagenasi per rimuovere eventuali detriti insolubili e di aggiungere calcio e magnesio al buffer di lavaggio e di utilizzare un buffer di lavaggio preruotato per arrestare rapidamente la dissociazione del tessuto.In questa procedura, il nostro esperimento, come la secrezione di insulina stimolata da glucosio, può essere eseguito per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulle dinamiche di secrezione dell'insulina nelle cellule beta neonatali. Inoltre, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule beta per effettuare ulteriori saggi, come lo studio dell'espressione genica o altre analisi metaboliche. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come isolare isole intatte dal pancreas di topo neonatale per i vostri studi successivi.Non dimenticare che lavorare con la polvere di collaghenasi sarà estremamente pericoloso, quindi precauzioni come indossare guanti e maschera facciale devono essere sempre adottate quando si utilizza questo materiale.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

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Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

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Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

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Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara a isolare intatte isole di Langerhans dal pancreas di topi neonati usando collagenasi e gradienti di densità. Questo metodo semplice permette di ottenere 20-80 cluster per campione per studi funzionali.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

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