Name: Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri come misurare simultaneamente il calcio mitocondriale e il potenziale di membrana in cellule vive mediante microscopia confocale. Questo metodo senza manipolazione genetica aiuta a studiare le malattie mitocondriali.

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Ringraziamo il dottor Kirstin Elgass e il Dr Sarah Creed dal Monash Micro Imaging per l&#39;assistenza tecnica, e il Wellcome Trust e Medical Research Council del Regno Unito per il sostegno finanziario. MMcK è supportato il futuro Fellowship Scheme australiano Research Council (FT120100459), il Buckland Fondazione William, The Australian mitocondriale Disease Foundation (AMDF), l&#39;Istituto Hudson della ricerca medica e Monash University. Questo lavoro è stato supportato dal sistema di infrastrutture operative di supporto Governo del Victoria.

1. Preparazione di cellule <ol><li> Crescere le cellule in 10 cm piatti di coltura cellulare o 75 cm 2 palloni in terreni di coltura [10 ml di Dulbecco Eagles Modificati (DMEM) integrato con il 5% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1x penicillina / streptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Per raccogliere le cellule, rimuovere il supporto per aspirazione, quindi lavare con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS 1x). Rimuovere 1x PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 1,5 ml di 0,25% (w / v) Tripsina / 0,25% (w / v) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 2 min. Toccare piatto o pallone delicatamente per rimuovere le cellule, poi risospendere in terreni di coltura 5 ml. </li><li> Contare le cellule con l&#39;aggiunta di 12 ml di cellule risospese su un emocitometro. </li><li> cellule piastra in piatti o lamelle camerata per l&#39;imaging confocale. NOTA: Questi avranno un idoneo fondo in plastica o vetro che è stato progettato per l&#39;utilizzo con microscopi invertiti. </li><li> cellule piastra in modo tha ~ 80% di confluenza viene raggiunto il giorno di imaging. Ad esempio, circa 2 x 10 4 cellule di osteosarcoma 143B possono essere placcati in un pozzetto di un 8-ben scorrevole camera di un giorno prima di imaging. </li><li> Incubare le cellule per una notte a 37 ° C / 5% di CO 2 per consentire cellule per fissare e recuperare. </li></ol> 2. Tamponi per TMRM e Fluo-4 Imaging <ol><li> Preparare Record Solution (RS) contenente 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 1,25 mm KH 2 PO 4, 10 mm D-glucosio, 2 mM CaCl 2 e 10 mm HEPES pH 7,35. Conservare RS in aliquote a -20 ° C. </li><li> Preparare intracellulare Medium (IM) contenente 6 mM NaCl, 130 mm KCl, 7,8 mm MgCl 2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mm CaCl 2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malato, 2 mM glutammato, 2 mM ADP e 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mm soluzioni stock di malato, glutammato e ADP possono essere preparati separatamente, aliquotati e conservati a -20 ° C. questi stgreggi possono essere aggiunti a GI appena prima dell&#39;uso. </li><li> Ca soluzione salina tamponata 2+ libero di Hank (HBSS) può essere ottenuto pre-preparato da fornitori commerciali. Aggiungere etilene glicol-bis (β-amminoetil etere) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacetico (EGTA) ad una concentrazione finale di 500 mM. </li><li> Preparare una soluzione madre di 10 mm tetramethylrhodamine, estere metilico, perclorato (TMRM) in 100% di metanolo. A partire da questa, fare una scorta di lavoro di 2 micron di H 2 O. distillata </li><li> Preparare una soluzione madre di 10 mm Verapamil in 100% di etanolo. </li><li> Preparare una 1 mg / ml (p / v) Soluzione di Fluo-4 estere acetossimetil (Fluo-4, AM) in dimetilsolfossido (DMSO). NOTA: Fluo-4, AM è un indicatore di calcio che esibisce aumento di fluorescenza dal legame Ca 2+. Fluo-4 è un analogo di fluo-3, con i due sostituenti cloro sostituiti da fluori. Ciò si traduce in un aumento di eccitazione di fluorescenza a 488 nm e superiori livelli del segnale di fluorescenza. IlAM gruppo estereo traduce in un uncharged Fluo-4 molecola che può permeare le membrane cellulari. Una volta all&#39;interno della cellula, l&#39;estere AM viene scisso dalle esterasi non specifiche, risultante in una forma carica di Fluo-4 che è intrappolato all&#39;interno della cellula. </li><li> Preparare una soluzione madre di 1 mm di carbonile cianuro di p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% di etanolo. </li><li> Preparare una soluzione stock di 25 mg / ml (w / v) digitonina in H 2 O. distillata </li><li> Preparare una soluzione stock di 100 micron thapsigargin in DMSO. </li><li> Preparare una soluzione madre di 40 mm cloruro di calcio (CaCl 2) in H 2 O. distillata </li></ol> 3. La colorazione delle cellule con TMRM e Fluo-4, AM <ol><li> Preparare la soluzione RS colorazione con 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM e 0,005% di tensioattivo come Pluronic F-127 in RS. NOTA: Questo tensioattivo non ionico è un poliolo che facilita la solubilizzazione di Fluo-4, AM. Nota: 10 micron Verapamil può anche essere aggiunto alla inibizionet TMRM esportazione dal trasportatore multidrug membrana plasmatica se espressa nel tipo di cellula in fase di analisi. </li><li> Rimuovere terreni di coltura dalle cellule per pipetta e lavare con 100 ml PBS 1X. </li><li> Rimuovere 1x PBS mediante pipetta e incubare cellule in 250 microlitri soluzione RS colorazione per 45 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Una volta che il Fluo-4, AM entra nella cellula, l&#39;estere AM viene scisso dalle esterasi cellulari. Incubazione a temperatura ambiente inibisce l&#39;attività esterasi, permettendo Fluo-4, AM per inserire i mitocondri. </li><li> Rimuovere la soluzione RS colorazione dalla pipetta e lavare le cellule in 100 ml di Ca 2+ libera HBSS per rimuovere l&#39;eccesso Fluo-4, AM e TMRM. </li><li> Preparare la soluzione di imaging IM con 25 mg / ml (w / v) digitonina, 200 Nm TMRM e 1 micron tapsigargina in IM. NOTA: La concentrazione di digitonina può avere bisogno di essere regolato per garantire che permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna non si verifica. Questo può essere determinato empiricamente valutando l&#39;intensitàdel segnale TMRM a differenti concentrazioni di digitonina. </li><li> Rimuovere il Ca 2+ libera HBSS dalla pipetta e aggiungere 300 ml di soluzione di imaging IM alle cellule. Lasciare cellule equilibrare a temperatura ambiente per 10 min. Le cellule sono ora pronti per l&#39;imaging con CaCl 2 aggiunte. </li></ol> 4. Imaging cellulare <ol><li> Mettere piatto o vetrino camerata con le cellule in soluzione di imaging IM su un microscopio confocale a scansione laser invertito. </li><li> Utilizzare impostazione laser microscopio per l&#39;eccitazione ed emissione spettri TMRM e Fluo-4. Ad esempio, utilizzare 543 nm He-Ne e 473 linee laser ad argon nm per eccitare rispettivamente TMRM e Fluo-4. Utilizzare una potenza laser basso di circa il 5% di minimizzare una foto-danni alle cellule. </li><li> Impostare microscopio per eseguire la scansione di immagini ogni 25 secondi. celle di scansione per 10 minuti per stabilire le letture di base per la TMRM e Fluo-4 segnali. NOTA: Il segnale Fluo-4 può essere debole o non rilevabile a riposo concent calciorazioni. </li><li> Aggiungere 3 ml di 40 mM CaCl 2 soluzione madre direttamente alle cellule in 300 ml di soluzione di imaging IM (una diluizione 1: 100) e mescolare delicatamente con una pipetta. Mettere in pausa la scansione di immagini, mentre l&#39;aggiunta e la miscelazione del CaCl 2, se necessario. NOTA: La Ca 2+ concentrazione finale libera ioni [Ca 2+] nella soluzione di imaging IM può essere calcolata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) o chelante 11. Una descrizione dettagliata di come calcolare il Ca 2+ concentrazione finale libera ioni [Ca 2+] è descritto nella sezione 6 di seguito. </li><li> Continuare la scansione di immagini per circa 4 minuti, quindi ripetere CaCl 2 aggiunte ogni 4 minuti fino a quando il TMRM desiderato o Fluo-4 segnali vengono raggiunti, di solito circa 8 a 10 aggiunte. </li><li> Usando una pipetta, aggiungere una diluizione 1: 100 di 1 mm FCCP (finale concentration di 10 micron) direttamente alle cellule per dissipare ΔΨ m. celle di immagine per un ulteriore 5 min. L&#39;esperimento è ormai finito. </li></ol> Analisi 5. Immagine <ol><li> Una volta che l&#39;imaging è completa, determinare l&#39;intensità dei segnali Fluo-4 e TMRM utilizzando software di analisi delle immagini, ad esempio il software ImageJ con il plugin Bio-Formati (scaricare &#39;bioformats_package.jar&#39; dal http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e salvarlo nella &#39;C: Program Files ImageJ plugins&#39; cartella). </li><li> Aprire il file di immagini (ad esempio un file .oif) in ImageJ. Fare clic sullo strumento di selezione e selezionare una regione di interesse (ROI) che contiene mitocondri. Utilizzare il segnale TMRM iniziale per selezionare il ROI. </li><li> Apri &#39;Analizza&gt; Strumenti&gt; ROI Manager&#39;, fare clic su &#39;Add&#39; per includere il ROI selezionata per la misurazione dell&#39;intensità. ROI multipli possono essere selezionati in una singola immagine per la misurazione. Ripetere passaggi precedenti fino a quando tutte ROIs sono stati aggiunti al ROI Manager. </li><li> Fare clic su &#39;Altro&gt; Misura Multi&#39;, fare in modo che &#39;Misura tutte le sezioni&#39; sia selezionata e che &#39;una riga per ogni fetta&#39; non è selezionata, cliccare su &#39;OK&#39; per ottenere un tavolo di intensità della fluorescenza media dei TMRM e Fluo-4 segnali per ogni ROI in ogni punto. </li><li> Utilizzare i dati da tutte le ROI per calcolare l&#39;intensità media e deviazione standard per la TMRM e Fluo-4 segnali. </li></ol> 6. Calcolo del Finale libero Ca 2+ Ion Concentrazione [Ca 2+] <ol><li> Il Ca 2+ concentrazione di ioni liberi [Ca 2+] nella soluzione di imaging IM può essere determinata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) o chelante 11. Ad esempio, impostare le variabili in WEBMAXC prolungato nel modo seguente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, ionico forza = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M e Mg 2+ = 0,0078 M. Questo si traduce in una Ca 2+ concentrazione di ioni liberi finale [Ca 2+] di 62 Nm . Si noti che questi programmi non possono tener conto di tutte le variabili, come ad esempio il reagente purezza, precisione delle misure e determinazione del pH. Il metodo più preciso per determinare la libera Ca 2+ concentrazione è quello di utilizzare un elettrodo selettivo Ca 2+ calibrato. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il calcio gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari, tra cui la contrazione muscolare, la segnalazione neuronale e proliferazione cellulare 13. Aumento delle concentrazioni di calcio delle cellule sono spesso associati con la domanda di energia, con il calcio in grado di stimolare direttamente fosforilazione ossidativa mitocondriale per aumentare la produzione di ATP 3. E &#39;quindi essenziale che abbiamo la capacità di controllare efficacemente l&#39;accumu...

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella regolazione intracellulare concentrazione di Ca 2+, agendo come locali Ca 2+ buffer 1. Ca 2+ entra nei mitocondri attraverso il Ca 2+ uniporter, un processo guidato dal gradiente elettrochimico che esiste attraverso la membrana mitocondriale interna (ΔΨ m) 2. Una volta all&#39;interno della matrice mitocondriale, Ca 2+ può attivare fosforilazione ossidativa stimolando tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell&#39;acido citrico 3. Questa stimolazione mantiene ΔΨ m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale. Se il Ca 2+ concentrazione ai mitocondri diventa molto alta, transizione di permeabilità mitocondriale può essere avviata, con conseguente dissipazione di ΔΨ m, la cessation di fosforilazione ossidativa e l&#39;induzione della morte cellulare vie di segnalazione 4. Il ruolo importante che i mitocondri giocano nel buffer spaziale del cellulare di calcio rende il monitoraggio accurato del calcio mitocondriale critica. Vari metodi sono stati stabiliti per monitorare calcio mitocondriale, compreso l&#39;uso di coloranti a base di rodamina. Uno di questi dye, Rhod-2, AM, è molto efficace nel partizionamento ai mitocondri per misurare mitocondriali di Ca 2+ livelli 5, 6. Tuttavia, la cura deve essere utilizzato come una tintura si accumulerà in altri organelli, come liposomi, o rimanere nel citosol delle cellule. Tuttavia, analisi a valle possono essere impiegati per distinguere questi segnali da quelli dai mitocondri 7. Un&#39;altra tecnica per monitorare il calcio mitocondriale utilizza reporter fluorescente costrutti 8 </s<html> up&gt;. Il vantaggio di queste sonde geneticamente codificati è che possono essere specificamente mirata ai mitocondri utilizzando endogeni peptidi N-terminali, ad esempio il segnale di targeting N-terminale della subunità COX umana VIII. Questo sistema è stato impiegato per generare una sonda equorina mitocondriale targeting che si è dimostrata estremamente utile per studiare calcio mitocondriale segnalazione 9. L&#39;inconveniente principale di queste sonde geneticamente codificate è che hanno bisogno di essere introdotti nelle cellule di espressione transitoria (che non è fattibile per alcuni tipi di cellule e possono produrre risultati variabili) o attraverso la creazione di sistemi di espressione stabili (che richiede molto tempo). Per aggirare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per misurare mitocondriale Ca 2+ e ΔΨ m contemporaneamente. Questo protocollo si basa su un metodo precedentemente descritto che aggiunge calcio esogeno per cellule permeabilizzates = &quot;xref&quot;&gt; 10. Il nostro protocollo ha tre vantaggi principali rispetto ad altri metodi: in primo luogo, usiamo Fluo-4, AM e TMRM per monitorare Ca 2+ mitocondriale e ΔΨ m, due coloranti che hanno ben distinte proprietà spettrali; in secondo luogo, le cellule vengono permeabilizzate modo che il segnale Fluo-4 è solo rilevando mitocondriale Ca 2+ e non Ca 2+ localizzato ad altri organelli o citosol delle cellule; e in terzo luogo, l&#39;uso di Fluo-4 per rilevare Ca 2+ mitocondriale consente per la colorazione delle cellule veloce e semplice, negando eventuali problemi di trasfezione cellulare o trasformazione esistenti se si usano sonde geneticamente codificati.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penicillina/streptomicina (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina/0,25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>vetrino coprioggetti a 8 pozzetti</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ senza Hank' s soluzione salina tamponata (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetrametilrodamina, estere metilico, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 acetossimetilestere (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ematocitometro</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>Fiasche per colture cellulari Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di microscopia fluorescente

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Oltre al loro ruolo fondamentale nel generare ATP, i mitocondri fungono anche da calcio locale (Ca 2+) buffer per regolare strettamente concentrazione intracellulare di Ca 2+. Per fare questo, mitocondri utilizzano il potenziale elettrochimico attraverso la membrana interna (ΔΨ m) di sequestrare Ca 2+. L&#39;afflusso di Ca 2+ nei mitocondri stimola tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell&#39;acido citrico, aumentare il trasferimento di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) complessi. Questa stimolazione mantiene ΔΨ m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale. Descriviamo qui un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive usando la microscopia confocale. Con permeabilizzante le cellule, Ca 2+ mitocondriale puòessere misurata utilizzando la fluorescenza Ca 2+ indicatore Fluo-4, AM, con la misura di m ΔΨ utilizzando il tetramethylrhodamine colorante fluorescente, estere metilico, perclorato (TMRM). Il vantaggio di questo sistema è che c&#39;è poca sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti, consentendo una misurazione precisa della mitocondriale Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Utilizzando l&#39;aggiunta sequenziale di Ca 2+ aliquote, Ca 2+ mitocondriale assorbimento possono essere monitorati, e la concentrazione alla quale Ca 2+ induce mitocondriale transizione di permeabilità della membrana e la perdita di ΔΨ M determinato.

Abbiamo usato questo protocollo per esaminare gli effetti di una mutazione MT-ND5 sulla capacità dei mitocondri delle cellule 143B per tamponare gli aumenti di calcio 12. Nell&#39;esempio mostrato qui, le cellule 143B di controllo sono stati caricati con TMRM e Fluo-4, sono davanti a permeabilizzazione con digitonina. Dopo 5 minuti di immagini, otto aggiunte sequenziali di un diluizione 1: 100 di 40 mm esogeni CaCl 2 sono stati fatti, con la co...

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all&#39;interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo semplice per misurare simultaneamente l'assorbimento di calcio mitocondriale e il potenziale della membrana mitocondriale in cellule vive mediante microscopia confocale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo mitocondriale, come il modo in cui i mitocondri agiscono da depositi locali di calcio per regolare strettamente la concentrazione intracellulare di calcio. Il principale vantaggio di questa tecnica è che sia il calcio mitocondriale sia il potenziale della membrana mitocondriale possono essere misurati specificamente e simultaneamente in cellule vive, senza la necessità di manipolazioni genetiche.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione del calcio nella patologia delle malattie mitocondriali, può essere utilizzato anche per studiare altre condizioni degenerative più recenti, quando la regolazione del calcio nelle urine è fondamentale. In questo procedimento, coltivare le cellule su piastre da dieci centimetri per colture cellulari o su fiaschi da 75 centimetri quadrati, in terreno di coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per raccogliere le cellule, rimuov

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Biologia

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Fusione mitocondriale è stato misurato mediante il monitoraggio di equilibrare le photoconverted matrice mirata GFP attraverso la rete mitocondriale nel corso del tempo. Finora, una sola cella può essere sottoposto ad un'ora lunga analisi cinetica alla volta. Vi presentiamo un metodo che misura contemporaneamente più celle, in modo da accelerare il processo di raccolta dati.

Una più veloce, ad alta risoluzione, MTPA-GFP-based test Fusion mitocondriale Acquisizione dati cinetici di più celle in parallelo con microscopia confocale

Questo video descrive un test basato su un lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale in mitocondri isolati. Il test analizza il segnale di fluorescenza di un colorante fluorescente sensibile al calcio per studiare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio e del sovraccarico di calcio.

Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Il video dimostra la misurazione simultanea dei livelli intracellulari di calcio e delle variazioni del potenziale di membrana nelle cellule endoteliali dei segmenti dell'arteria cerebrale di topo. Il tubo endoteliale isolato viene caricato con un indicatore fluorescente di calcio e trattato con un farmaco che induce il rilascio intracellulare di calcio, con conseguente variazione del potenziale di membrana. La fluorescenza dell'indicatore consente la misurazione dei livelli di calcio e un...

Misurazione simultanea del calcio intracellulare e del potenziale di membrana in un endotelio cerebrale di topo

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

Scopri come misurare simultaneamente il calcio mitocondriale e il potenziale di membrana in cellule vive mediante microscopia confocale. Questo metodo senza manipolazione genetica aiuta a studiare le malattie mitocondriali.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente (Video) | JoVE Journal

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

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