Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente
24 gennaio 2017
I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo semplice per misurare simultaneamente l'assorbimento di calcio mitocondriale e il potenziale di membrana mitocondriale in cellule vive utilizzando la microscopia confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo mitocondriale, come ad esempio il modo in cui i mitocondri agiscono come depositi locali di calcio per regolare strettamente la concentrazione intracellulare di calcio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia il calcio mitocondriale che il potenziale di membrana mitocondriale possono essere misurati specificamente contemporaneamente nelle cellule vitali senza la necessità di manipolazione genetica.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione del calcio nella patologia della malattia mitocondriale, può anche essere utilizzato per studiare altre condizioni degenerative più recenti, quando la regolazione del calcio negli orinatoi è cruciale. In questa procedura, far crescere le cellule su piastre di coltura cellulare da dieci centimetri, o fiasche da 75 centimetri quadrati, in terreni di coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per raccogliere le cellule, rimuovere il terreno mediante aspirazione e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS.
Successivamente, rimuovere la PBS per aspirazione. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tripsina EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 2 minuti. Quindi, picchiettare delicatamente il piatto per rimuovere le celle.
Risospenderli in cinque millilitri di terreno di coltura. Successivamente, contare le cellule con un emocitometro. Il giorno prima dell'imaging confocale, piastrate le cellule al 60-70% di confluenza in piastre o vetrini protettivi a camera.
Quindi incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di attaccarsi e riprendersi. In questa procedura, preparare la soluzione di colorazione dei dischi con TMRM, Fluo 4 AM e tensioattivo. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con 100 microlitri di PBS.
Quindi rimuovere la PBS e incubare le cellule in 100 microlitri di soluzione colorante per 45 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante e lavare le cellule in 100 microlitri di HBSS senza calcio per rimuovere l'eccesso di Fluo 4 AM e TMRM. Quindi preparare la soluzione intracellulare con digitonina, TMRM e tapsigargina.
Quindi, rimuovere l'HPSS privo di calcio e aggiungere 300 microlitri di soluzione di imaging IM alle cellule. Lasciare le cellule in equilibrio a temperatura ambiente per dieci minuti prima di eseguire l'imaging con le aggiunte di cloruro di calcio. Utilizzare una bassa potenza laser di circa il 5% per ridurre al minimo eventuali danni fotografici alle celle.
Utilizzare l'impostazione sui laser del microscopio per gli spettri di eccitazione ed emissione di TMRM e Fluo 4 AM. Utilizzare una bassa potenza laser di circa il cinque percento con un guadagno elevato per ridurre al minimo i danni fotografici delle celle. Quindi impostare il microscopio per scansionare le immagini ogni venticinque secondi. Scansiona le celle per dieci minuti per stabilire le letture della linea di base per i segnali TMRM e Fluo 4.
Quindi mettere in pausa la scansione dell'immagine e aggiungere 3 microlitri di soluzione madre di cloruro di calcio da 40 millimolari direttamente alle cellule in 300 microlitri di soluzione di imaging IM. Mescolare delicatamente con una pipetta. Quando si aggiunge la soluzione di calcio alle cellule, fare attenzione a non spostare il piatto sul tavolino del microscopio.
Continuare la scansione delle immagini per circa quattro minuti. Quindi ripetere le aggiunte di cloruro di calcio ogni quattro minuti fino a raggiungere i segnali TMRM o Fluo 4 desiderati, di solito da otto a dieci aggiunte. Successivamente aggiungere una diluizione da 1 a 100 di un millimolare FCCP direttamente sulle cellule per dissipare il potenziale interno della membrana.
Quindi visualizza le cellule per altri cinque minuti prima che l'esperimento sia terminato. Una volta completata l'imaging, determinare l'intensità dei segnali Fluo 4 e TMRM utilizzando il software di analisi delle immagini. Per fare ciò, apri l'immagine, fai clic sullo strumento di selezione e seleziona una regione di interesse che contiene mitocondri.
È possibile selezionare più regioni di interesse per la misurazione aprendo Analizza, Strumenti, Gestione ROI. Fare clic su Aggiungi per includere il ROI selezionato per la misurazione dell'intensità. Ripeti i passaggi precedenti fino a quando tutte le ROI non sono state aggiunte al ROI Manager.
Misura l'intensità media della fluorescenza dei segnali TMRM e Fluo 4 per ogni regione di interesse selezionando la funzione più multi misura. Accertatevi che l'opzione Misura tutte le sezioni sia selezionata e che l'opzione Una riga per sezione sia deselezionata. Quindi fare clic su OK per ottenere una tabella dell'intensità fluorescente media dei segnali TMRM e Fluo 4 per ciascun ROI in ogni punto temporale.
Quindi combina i dati per calcolare l'intensità media e la deviazione standard per i segnali TMRM e Fluo 4. In questo esperimento, le celle 143B sono state precaricate con Fluo 4 AM e TMRM prima della permeabilizzazione con digitonina. Dopo ogni aggiunta di cloruro di calcio, il segnale TMRM diminuisce man mano che l'afflusso di ioni calcio nei mitocondri dissipa il potenziale della membrana mitocondriale.
Un piccolo potenziale di membrana è evidente dopo la transizione di permeabilità poiché l'aggiunta di 10 micromolari FCCP induce ancora un collasso del potenziale di membrana. Qui la concentrazione mitocondriale di calcio, indicata dal segnale Fluo 4, inizia ad aumentare in seguito alla seconda aggiunta di cloruro di calcio quando il calcio libero nel terreno raggiunge 0,32 micromolari. Ogni successiva aggiunta di cloruro di calcio ha causato un progressivo aumento del calcio mitocondriale.
Qui sono mostrate le immagini delle misurazioni simultanee del potenziale di membrana nel calcio mitocondriale. Il segnale rosso indica TMRM e il segnale verde indica Fluo 4. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se eseguita correttamente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare contemporaneamente i livelli di calcio mitocondriale e il potenziale di membrana mitocondriale al microscopio confocale utilizzando l'aggiunta di calcio esogeno alle cellule permeabili. Non dimenticare che lavorare con FCCP e digitonina può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare DPI.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale e il potenziale di membrana in cellule vive mediante microscopia confocale. La tecnica consente ai ricercatori di studiare come i mitocondri regolino le concentrazioni intracellulari di calcio senza ricorrere a manipolazioni genetiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Ricerca Mitochondriale
Sfondo
- I mitocondri svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione del calcio.
- Comprendere la funzione mitocondriale è fondamentale per lo studio di numerose malattie.
- La regolazione del calcio è vitale per la salute cellulare.
- I metodi attuali spesso richiedono manipolazioni genetiche, limitandone l'applicabilità.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo semplice per misurare le funzioni mitocondriali.
- Indagare il ruolo dei mitocondri come depositi locali di calcio.
- Facilitare la ricerca sulle malattie mitocondriali e altre condizioni degenerative.
Metodi Utilizzati
- Le cellule vengono coltivate in appositi terreni di coltura a 37 gradi Celsius.
- Le cellule vengono raccolte e lavate con PBS.
- Coloranti fluorescenti vengono utilizzati per misurare l'assunzione di calcio e il potenziale di membrana.
- La microscopia confocale viene impiegata per effettuare misurazioni simultanee.
Risultati principali
- Il metodo consente il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio mitocondriale.
- Viene ottenuta una misurazione simultanea del calcio e del potenziale di membrana.
- La tecnica può fornire informazioni sulle patologie mitocondriali.
- Può essere applicata per studiare altre condizioni legate alla regolazione del calcio.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione delle funzioni mitocondriali nelle cellule vive.
- Fornisce uno strumento per indagare il ruolo dei mitocondri nella salute e nella malattia.
- L'approccio è versatile per diverse applicazioni di ricerca in biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo metodo consente la misurazione diretta della dinamica del calcio mitocondriale e del potenziale di membrana in cellule vive, fornendo dati fondamentali per la validazione degli obiettivi nelle vie di disfunzione mitocondriale. Quantificando la transizione indotta dal calcio alla permeabilità e la perdita del potenziale di membrana, supporta la riduzione del rischio meccanicistica di ipotesi terapeutiche legate al fallimento bioenergetico. La lettura simultanea aumenta l'affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando il flusso di calcio allo stato di salute mitocondriale senza manipolazione genetica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Esamina ipotesi terapeutiche relative alla regolazione del calcio mitocondriale come fattore chiave nell'omeostasi cellulare del calcio.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli mitocondriali in cellule vive mediante letture fluorescenti.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando composti che modulano la transizione di permeabilità indotta dal calcio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del Saggio: Prepara cellule permeabilizzate con Fluo-4 AM e TMRM per la rilevazione quantitativa e simultanea dell'assorbimento di calcio e del potenziale di membrana.
- Riproducibilità: Utilizza aggiunte sequenziali di cloruro di calcio per generare curve dose-risposta finalizzate alla determinazione della soglia di permeabilità.
- Scalabilità: Compatibile con piattaforme di microscopia confocale per l'adattamento a piastre multipozzetto e analisi dell'intensità basata su aree di interesse (ROI).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella il sovraccarico di calcio mitocondriale rilevante per la neurodegenerazione e le lesioni ischemiche.
- Continuità traslazionale: Collega le misurazioni acute dei flussi di calcio alla disfunzione cronica in modelli preclinici di malattie mitocondriali.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce indicazioni per decisioni di proseguimento o interruzione basate sulla capacità di ritenzione del calcio e sulla stabilità del potenziale di membrana.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'interazione con il bersaglio alla validazione funzionale, in particolare per vie che coinvolgono la regolazione del calcio mitocondriale e lo stress ossidativo.
- Biologia della scoperta: Verifica come le perturbazioni influenzino il tampone del calcio mitocondriale e l'accoppiamento del potenziale di membrana.
- Screening: Fornisce letture fluorescenti quantitative che consentono il confronto degli effetti dei composti sulla desolarizzazione indotta dal calcio.
- Analisi: Fornisce dati relativi all'intensità media e alla deviazione standard dei segnali di Fluo-4 e TMRM in diversi punti temporali e aree di interesse (ROI).
- Ricerca traslazionale: Collega eventi acuti di transizione della permeabilità a un fallimento bioenergetico sostenuto nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma saggistica riutilizzabile per la farmacologia della sicurezza mitocondriale e la riduzione del rischio dei bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica correlando direttamente l'afflusso di calcio alla dissipazione del potenziale di membrana.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione mediante l'abbinamento di coloranti raziometrici e la successiva stimolazione al calcio.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale identificando precocemente le criticità mitocondriali durante l'ottimizzazione dei composti promettenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata per il rischio in base alla capacità di ritenzione del calcio e alla suscettibilità alla transizione di permeabilità.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive, nel caricamento dei coloranti e nei protocolli di permeabilizzazione.
- È dipendente dalla microscopia confocale con impostazioni laser appropriate per l'eccitazione/emissione di TMRM e Fluo-4.
- Necessita della standardizzazione della preparazione di HBSS senza calcio e della soluzione per imaging intracellulare tra diversi gruppi di lavoro.
- Comprende considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari e densità mitocondriali.
- Include limitazioni pratiche, come il rischio di fototossicità dovuto all'esposizione al laser e la fuoriuscita del colorante dopo la permeabilizzazione.
