Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell'angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di ottenere prove quantitative, spaziali e temporali della colocalizzazione del lisosoma del recettore dell'angiotensina di tipo uno dopo il trattamento con angiotensina due. Questo metodo è stato ideato per rilevare le differenze nell'elaborazione subcellulare dei recettori di tipo Y rispetto ai recettori mutanti, come durante il processo di internalizzazione, che emette in risposta alla simulazione del ligando. I vantaggi di questa tecnica sono che l'imaging delle cellule vitali elimina gli artefatti dalle cellule fisse e permeabilizzate dai detergenti e che i cambiamenti dinamici nella localizzazione dei recettori possono essere valutati in tempo reale.

Inizia selezionando un obiettivo con apertura numerica 1,4 appropriato e centrando l'obiettivo sul tavolino del microscopio. Aggiungere una goccia di olio da immersione ad alta viscosità e bassa auto-florescenza sull'obiettivo e trasferire la camera con le cellule trasfettate al tavolino del microscopio. Sollevare delicatamente l'obiettivo fino a quando l'olio non tocca appena il fondo del primo vetrino e individuare le celle fioche.

Con una cellula sana di interesse, al centro del campo visivo, passare alla modalità confocale e confermare che la cellula sia ben disposta, con il lato ventrale giustapposto strettamente al vetrino coprioggetti. Aprire la finestra di dialogo Stack Z, fare clic su Live, spostare lo stato attivo sulla parte superiore della cella e quindi fare clic su Inizia. Quindi mettere a fuoco la parte inferiore della cella, immettere la dimensione del passo Z 1,00 micrometri, quindi fare clic su Fine.

Quindi seleziona Modalità XYZT in Impostazioni di acquisizione in alto. Infine, impostare l'intervallo di tempo per la scansione e il periodo di tempo per la scansione per osservare il targeting del recettore dell'angiotensina di tipo 1A marcato GFP ai lisosomi. Quindi, per iniziare la stimolazione del ligando, aggiungere tre microlitri di una soluzione stock 100 X di ligando al pozzetto che viene ripreso e fare clic su Avvia per visualizzare la risposta in 3D per il periodo e la frequenza desiderati.

Per analizzare le immagini delle cellule vive, aprire il software di quantificazione delle immagini 3D appropriato. In questo protocollo, Velocity. Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno del campo dell'immagine e selezionare Proprietà.

Inserire le proprietà dei pixel dell'immagine XY e Z appropriate per creare una sequenza di misurazione per analizzare il recettore, la vescicola marcata GFP e le intensità delle cellule del foro in risposta al trattamento con ligando. Nel menu 2D, selezionare la modalità di messa a fuoco estesa per osservare la cella. Quindi, usa lo strumento regione freestyle per disegnare una regione di interesse attorno alla cella e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine per selezionare Ritaglia alla selezione.

Verrà generato un nuovo elemento immagine. Fare clic sul nome dell'immagine per selezionare l'immagine della cella ritagliata e aprire la scheda di misurazione. Per misurare l'espressione GFP delle vescicole internalizzate, trascinare Trova oggetti da Ricerca nella casella della sequenza in alto.

Impostare il canale di ricerca oggetti su GFP e aprire l'icona delle impostazioni per impostare la soglia utilizzando la deviazione standard e il limite inferiore a sei, per selezionare gli oggetti con le intensità GFP più luminose. Impostare la dimensione minima dell'oggetto a zero micrometri cubi. Quindi, fare clic su misura e selezionare i canali e i tipi di misurazioni.

Per definire la soglia e i filtri per l'identificazione dell'intera cella e per misurare l'intensità totale della GFP, trascinare una seconda casella Trova oggetti. Quindi, impostare il canale Trova oggetti su GFP e impostare la deviazione standard su zero, per selezionare oggetti con qualsiasi intensità GFP e dimensione minima dell'oggetto a due micrometri cubi. Trascinare Filtro popolazione nella casella Popolazione due oggetti e selezionare un volume di micrometri cubi, maggiore di 100 per selezionare l'intera cella ed eliminare tutti gli oggetti più piccoli.

Quindi, selezionare le misurazioni e l'elemento Effettua misurazione, per effettuare la misurazione in tutti i punti temporali. Per analizzare l'espressione di GFP misurata nelle vescicole e nell'intera cellula nel tempo, fare clic sul nome del file dell'elemento di misurazione sotto il nome dell'immagine. Per estrarre i dati per GFP e vescicole dai dati totali, aprire la scheda non elaborata e selezionare la popolazione uno.

Quindi, apri la scheda analizzati e fai clic con il pulsante destro del mouse sui dati, seleziona l'analisi, quindi limita l'analisi per selezionare la popolazione uno. Per misurare la quantità di GFP nell'intera cellula, passare entrambi alla popolazione due. In Analizza questi dati e Riepiloga da, selezionare la somma, il canale di colore GFP e la somma.

Quindi, in Organizza i dati per e riga, seleziona il punto temporale. Per estrarre i dati relativi alla quantità di GFP nei lisosomi, in Trova oggetti per la popolazione uno, impostare il canale Trova oggetti sul canale rosso. Nell'icona della ruota all'interno della finestra di dialogo, impostare la soglia utilizzando la deviazione standard, il limite inferiore a sei, per selezionare gli oggetti rossi con le intensità più luminose e la dimensione minima dell'oggetto a 0,017 micrometri cubi.

Seleziona le misure e crea l'elemento di misurazione, per effettuare la misurazione in tutti i punti temporali. Per analizzare l'espressione di GFP misurata nei lisosomi, fare clic sul nome del file dell'elemento di misurazione sotto il nome dell'immagine. Selezionare la popolazione uno nella scheda grezza, quindi selezionare la popolazione uno e sommare il canale di colore GFP e la somma nella scheda di analisi, facendo clic con il pulsante destro del mouse come prima per misurare la quantità di GFP nelle vescicole rosse.

Prima della stimolazione del ligando, i recettori dell'angiotensina di tipo 1A marcati con GFP sono localizzati prevalentemente nella membrana plasmatica. Ma entro 2,5 minuti dall'aggiunta di angiotensina due, questi recettori vengono internalizzati, formando vescicole luminose e successivamente raggruppandosi e grandi vescicole paranuclearzoma. L'arruffamento indotto dall'angiotensina due complica la quantificazione dell'intensità totale della GFP della vescicola, come osservato per questi dati rappresentativi di misurazione dell'espressione della GFP.

Il filtraggio delle dimensioni non discrimina tra le increspature più grandi e le vescicole raggruppate, ma rivela che la GFP negli oggetti più piccoli aumenta prima della GFP negli oggetti più grandi. In questo andamento temporale rappresentativo dell'espressione della GFP senza autofocus, la GFP internalizzata è stata misurata come percentuale di GFP cellulare totale. L'analisi della GFP totale all'interno della cellula ha rivelato che questa cellula non si è sbiancata in modo apprezzabile nel tempo.

La quantificazione della GFP nei lisosomi delle cellule trasfettate indica anche che l'intensità del recettore dell'angiotensina di tipo 1A presente all'interno dei lisosomi non varia fino a 24 minuti dopo la somministrazione di angiotensina due. Durante questa procedura, è importante ricordarsi di monitorare la salute delle cellule prima e durante l'imaging, poiché la procedura richiede molto tempo, l'esperimento deve essere interrotto se le colture cellulari sono in qualche modo anormali. Seguendo questa procedura, l'immunocolorazione e FRET o FLIM possono essere utilizzati per rilevare e confermare la localizzazione subcellulare dei recettori.

I western blot possono essere eseguiti per affrontare l'identità e i cambiamenti nelle molecole di segnalazione coinvolte durante il traffico del recettore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging e l'analisi di cellule vive per misurare il recettore transmembrana indotto dal ligando che mira ai lisosomi e ad altri compartimenti subcellulari.